灰茶尺蛾性信息素的初步研究

羅宗秀，李兆群，蔡曉明，邊磊，陳宗懋*

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灰茶尺蛾性信息素的初步研究

羅宗秀1,2，李兆群1，蔡曉明1，邊磊1，陳宗懋1*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究中心，浙江杭州 310008；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

灰茶尺蛾是我國(guó)茶園中重要的食葉害蟲(chóng)。本研究對(duì)求偶高峰期的灰茶尺蛾雌蟲(chóng)，采用正己烷浸提腹部末端方法提取性信息素，利用氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀（GC-EAD）篩選性信息素提取物中的活性成分，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)活性成分進(jìn)行鑒定，最后將人工合成的性信息素進(jìn)行田間誘捕試驗(yàn)。GC-EAD結(jié)果顯示，灰茶尺蛾性信息素提取物中有兩種成分可引起雄蟲(chóng)觸角的電位反應(yīng)。GC-MS分析結(jié)果確定兩種活性成分分別為順3,順6,順9-十八碳三烯（Z3,Z6,Z9-18:H）和順3,順9-6,7-環(huán)氧十八碳二烯（Z3,epo6,Z9-18:H）。田間引誘試驗(yàn)表明，不同比例性信息素在田間顯示不同的引誘效果，當(dāng)Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H以4∶6的比例配比，總劑量為1?mg時(shí)，田間引誘效果最佳。該研究結(jié)果為灰茶尺蛾性信息素的應(yīng)用研究提供了理論基礎(chǔ)。

灰茶尺蛾；性信息素；鑒定

灰茶尺蛾（Warren）屬于鱗翅目（Lepidoptera）尺蛾科（Gometridae），是一種危害十分嚴(yán)重的茶樹(shù)食葉害蟲(chóng)，主要分布于湖南、湖北、江西、浙江、廣東和云南等茶區(qū)，幼蟲(chóng)咀食茶樹(shù)葉片，嚴(yán)重時(shí)可致茶叢光禿[1]。由于灰茶尺蛾與茶樹(shù)的另一種重要害蟲(chóng)——茶尺蠖（Prout）的形態(tài)特征極為相似且生態(tài)域有重疊，容易混淆，給害蟲(chóng)防治造成了諸多不便。張漢鵠等[1]和朱俊慶[2]先后對(duì)灰茶尺蛾和茶尺蠖的外部形態(tài)及生物學(xué)習(xí)性進(jìn)行了描述。姜楠等[3]利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行分子特征分析，結(jié)合經(jīng)典形態(tài)學(xué)分類(lèi)方法鑒別出灰茶尺蛾和茶尺蠖這兩種尺蛾。然而Zhang GH等[4]的研究則認(rèn)為，目前茶尺蠖只是存在兩個(gè)明顯的分化枝（Clade）。昆蟲(chóng)性信息素是具有種的專(zhuān)化性的化學(xué)通訊物質(zhì)，可作為判斷和鑒別近似種的一種輔助手段。目前，灰茶尺蛾性信息素研究還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試蟲(chóng)源

實(shí)驗(yàn)所用灰茶尺蛾采自浙江省嵊州市明山茶場(chǎng)?；也璩叨暧紫x(chóng)帶回實(shí)驗(yàn)室采用茶枝飼養(yǎng)，養(yǎng)蟲(chóng)室溫度(24±2)℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期16（光照）∶8（黑暗）。幼蟲(chóng)飼養(yǎng)至化蛹，將蛹按雌雄分開(kāi)放置在不同的養(yǎng)蟲(chóng)籠（50?cm×50?cm×50?cm）內(nèi)等待羽化。羽化后成蟲(chóng)飼喂10%的蜂蜜水，其中雌蛾用于提取性信息素，雄蛾用于性信息素提取物的活性測(cè)定。為避免試驗(yàn)用蟲(chóng)中混入茶尺蠖，所有供試成蟲(chóng)參考姜楠等[3]的方法，采用形態(tài)學(xué)與分子特征鑒定確定為灰茶尺蛾。

1.1.2 主要儀器與材料

氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀（GC-EAD）：氣相色譜（美國(guó)Agilent Technologies公司，7890A）、觸角電位儀（荷蘭Syntech公司）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）（日本Shimadzu公司，GC/MS-QP2010）；氮吹儀（Handiness Technologies公司）；船形誘捕器（漳州市英格爾農(nóng)業(yè)科技有限公司）；緩釋橡膠塞（白色，口徑8?mm，美國(guó)Sigma Aldrich公司）；樣品瓶（1.5?mL進(jìn)樣瓶，美國(guó)Agilent Technologies公司）；DB-23毛細(xì)色譜柱（內(nèi)徑0.25?mm，長(zhǎng)度30?m，膜厚0.25?μm，美國(guó)Agilent Technologies公司）；Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H參考Ando等[5]的方法，以亞麻酸甲酯為底物合成（杭州澤泉生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰茶尺蛾性信息素的提取

性信息素提取采用正己烷浸提法。灰茶尺蛾羽化第2天進(jìn)入暗周期4?h后，選擇求偶狀態(tài)下的處女雌蛾，用鑷子輕輕擠壓雌蛾腹部，待其產(chǎn)卵管露出后，自第8腹節(jié)用眼科手術(shù)剪剪下（圖1）。剪下后的腹部末端放入裝有150?μL正己烷的樣品瓶浸提15?min，粗提物用無(wú)水硫酸鈉脫水和氮吹濃縮后密封置于冰箱中（－20℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 灰茶尺蛾性信息素浸提的腹部末端

1.2.2 灰茶尺蛾性信息素提取物的GC-EAD分析

GC-EAD裝配DB-23毛細(xì)色譜柱（30?m×250?μm，ID：0.25?μm）。出口端1∶1分流，一部分進(jìn)入FID氫火焰離子檢測(cè)器，另外一部分經(jīng)過(guò)加熱套流出GC，刺激EAD電極上的觸角。GC載氣為N2，不分流進(jìn)樣，升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?0℃，保持2?min，以10℃·min-1的升溫速度升至160℃，再以4℃·min-1的速度升到220℃，保持5?min。GC-EAD分析時(shí)，選擇羽化第2天的灰茶尺蛾雄蟲(chóng)，用刀片將其觸角自基部切下，端部切除少許，用導(dǎo)電硅膠將觸角粘于EAG電極的固定器上。進(jìn)樣1?μL性信息素提取物，計(jì)算機(jī)記錄下分析數(shù)據(jù)，以此篩選出性信息素提取物中的活性成分。

1.2.3 灰茶尺蛾性信息素活性成分的GC-MS分析

GC-MS分析灰茶尺蛾性信息素活性成分，GC-MS中的GC升溫程序、色譜柱型號(hào)與GC-EAD分析時(shí)一致，載氣為He。MS電離方式EI，電離能量為70?eV，離子源發(fā)生器溫度為250℃，質(zhì)量掃描范圍為m/z 40~m/z400。分析時(shí)進(jìn)樣性信息素提取物1?μL，結(jié)合GC-EAD分析結(jié)果以及蛾類(lèi)性信息素特征離子進(jìn)行定性。

1.2.4 灰茶尺蛾性信息素田間誘捕試驗(yàn)

灰茶尺蛾性信息素田間誘捕試驗(yàn)于浙江省紹興御茶村茶業(yè)有限公司茶葉基地進(jìn)行。試驗(yàn)所用人工合成性信息素Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H（純度>95%）溶解于正己烷。將性信息素正己烷溶液加入緩釋橡膠塞中，空白對(duì)照為添加正己烷的橡膠塞。性信息素橡膠塞置于船形誘捕器中，每個(gè)處理3次重復(fù)。船形誘捕器棋盤(pán)式隨機(jī)布置于灰茶尺蛾發(fā)生的茶園，每個(gè)誘捕器高1.4?m，間隔15?m，統(tǒng)計(jì)21?d誘捕蟲(chóng)數(shù)。誘捕的雄蛾帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子特征鑒定。田間調(diào)查數(shù)據(jù)采用SPSS軟件單因素方差分析，數(shù)據(jù)通過(guò)lg(+1)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行Tukey’s-b分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰茶尺蛾性信息素鑒定結(jié)果

如圖2所示，GC-EAD分析灰茶尺蛾性信息素提取物，顯示采用正己烷浸提法提取的性信息素粗提物中共有兩個(gè)活性成分可以引起雄蛾觸角電生理活性，其中活性成分1的保留時(shí)間為11.47?min，活性成分2的保留時(shí)間為15.25?min。

圖2 灰茶尺蛾性信息素粗提物GC-EAD圖

與GC-EAD相同色譜條件下對(duì)性信息素提取物進(jìn)行GC-MS分析，得到了總離子流色譜圖（圖3），根據(jù)出峰順序、相對(duì)保留時(shí)間，以及鱗翅目類(lèi)型2性信息素特征離子鎖定兩個(gè)活性成分色譜峰，活性成分1的保留時(shí)間為13.91?min，活性成分2的保留時(shí)間為19.08?min。

如圖4所示，活性成分1的質(zhì)譜離子峰m/z 41，55，67，79，93，108，121，135，149，248，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、質(zhì)譜信息對(duì)比，最終確定活性成分1鑒定為順3,順6,順9-十八碳三烯（Z3,Z6,Z9-18:H）。

如圖5所示，活性成分2的質(zhì)譜離子峰m/z 41，55，67，83，95，111，121，137，151，264，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、質(zhì)譜信息對(duì)比，最終確定活性成分2鑒定為順3,順9-6,7-環(huán)氧十八碳二烯（Z3,epo6,Z9-18:H）。

2.2 灰茶尺蛾性信息素田間誘捕效果

田間誘捕結(jié)果表明，Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H確為灰茶尺蛾性信息素。Z3,Z6,Z9-18:H單獨(dú)使用無(wú)引誘效果，而Z3,epo6,Z9-18:H單獨(dú)使用具有引誘效果，當(dāng)二者混合時(shí)對(duì)雄蛾具有較好的引誘活性（圖6）。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，不同比例的性信息素組合表現(xiàn)出不同的引誘效果，其中Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H以4∶6的比例混合，總劑量為1?mg時(shí)，引誘效果最佳，21?d的誘捕蟲(chóng)數(shù)達(dá)每個(gè)誘捕器（41.7±6.8）頭，效果優(yōu)于其他處理（表1）。

注：圖中所示為誘捕器懸掛7?d，調(diào)查引誘蟲(chóng)數(shù)時(shí)性信息素所表現(xiàn)的引誘效果。

表1 灰茶尺蛾性信息素化合物的田間引誘結(jié)果

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)英文字母表示在0.05水平上單因素方差分析差異顯著。

Note: Average±standard error, different lowercase in the same column meant significance difference (<0.05).

3 討論

本研究表明，在灰茶尺蛾雌蛾求偶高峰期，采用正己烷浸提雌蟲(chóng)腹部末端的方法可以成功提取對(duì)灰茶尺蛾雄蟲(chóng)觸角具有電生理活性的性信息素粗提物。從GC-EAD分析圖譜可以看出，正己烷浸提腹部末端法提取的性信息素粗提物雖然具有較多的雜質(zhì)，但由于灰茶尺蛾個(gè)體較大，性信息素含量較高，因此不影響分析，是一種經(jīng)濟(jì)、方便的性信息素提取方法[6]。GC-MS鑒定灰茶尺蛾兩種性信息素成分為Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H，與大部分尺蛾科蛾類(lèi)一樣，其性信息屬于典型的類(lèi)型2性信息素結(jié)構(gòu)[7]。性信息素成分的協(xié)同效應(yīng)在灰茶尺蛾求偶通訊中起著重要作用，田間誘捕試驗(yàn)顯示，當(dāng)兩種性信息素化合物以特定比例混合后對(duì)雄蛾具有更好的吸引作用，田間引誘活性更為理想。田間誘捕結(jié)果驗(yàn)證了灰茶尺蛾性信息素鑒定的正確性。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究性信息素的大量誘殺和交配干擾技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

目前，茶樹(shù)蛾類(lèi)中茶尺蠖性信息素已由我國(guó)科學(xué)家鑒定，但其活性組分的報(bào)道并不完全一致[8-10]，本研究又鑒定出灰茶尺蛾的性信息素。在灰茶尺蛾和茶尺蠖性信息素的研究上存在兩個(gè)不確定因素：首先，灰茶尺蛾和茶尺蠖究竟是不同的獨(dú)立種還是一個(gè)種中的“分化枝”似乎尚未有定論[3-4]；其次，以往的研究中所使用的材料究竟是灰茶尺蛾還是茶尺蠖還不能肯定。因此在進(jìn)行性信息素研究的同時(shí)，對(duì)灰茶尺蛾和茶尺蠖的形態(tài)和命名也有進(jìn)一步核實(shí)的必要。如果是獨(dú)立的兩個(gè)種，那么這兩種茶樹(shù)尺蛾近緣種如何實(shí)現(xiàn)求偶通訊的種間隔離是一個(gè)值得深入研究的科學(xué)問(wèn)題。性信息素化合物結(jié)構(gòu)、比例、劑量的特異性通常是蛾類(lèi)近緣種求偶通訊種間隔離的主要方式[11-16]。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，灰茶尺蛾和茶尺蠖性信息素的主要成分均為Z3,Z6,Z9-18:H和Z3,epo6,Z9-18:H，其中么恩云等[9]研究發(fā)現(xiàn)，除以上兩種組分外，順3,順6,順9-二十二碳三烯（Z3,Z6,Z9-22:H）和順3,順6,順9-二十四碳三烯（Z3,Z6,Z9-24:H）對(duì)茶尺蠖具有引誘作用，因此微量組分在兩種尺蛾求偶通訊種間隔離中的作用需進(jìn)一步研究。此外，近緣種常常通過(guò)手性異構(gòu)實(shí)現(xiàn)求偶通訊種間隔離[17-19]，兩種尺蛾的性信息素主要成分Z3,epo6,Z9-18:H的環(huán)氧烯烴結(jié)構(gòu)有手性中心，因此兩種尺蛾的性信息素立體化學(xué)結(jié)構(gòu)同樣值得深入研究。以上因素均有可能導(dǎo)致求偶通訊的隔離現(xiàn)象，只有闡明這兩種尺蛾近緣種求偶通訊的種間隔離機(jī)制，才能更好地指導(dǎo)性信息素的應(yīng)用技術(shù)研究，同時(shí)豐富茶樹(shù)蛾類(lèi)近緣種的性選擇分化及求偶通訊系統(tǒng)的進(jìn)化理論。

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A Primary Study on Sex Pheromone of

LUO Zongxiu1,2, LI Zhaoqun1, CAI Xiaoming1, BIAN Lei1, CHEN Zongmao1*

1. Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Warren is a severe defoliator species in tea garden of China. In this study, the sex pheromone was extracted from abdominal tips of virgin female moths by n-hexane during peak calling period. Analysis of gland extracts by gas chromatography (GC) with electroantennographic detection (EAD) and the components of sex pheromone were identified by gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometry (MS). Finally, the biological activity of synthetic sex pheromone was evaluated by field trapping. The result of GC-EAD revealed two components that elicited responses from male moth antennae. Based on the mass spectrum, two components were identified as (Z,Z,Z)-3,6,9-octadecatriene and (Z,Z)-3,9-cis-6,7-epoxy-octadecadiene. In field experiment, different attracting effects were identified under different ratio of sex pheromones. Experiment showed the ratio of 4:6 of these synthetic components showed the maximum attractiveness at 1.0 mg when loaded on rubber septum. This investigation provides a theoretical basis for developing sex pheromone application technology againest.

, sex pheromone, identification

S435.711；Q968.1

A

1000-369X（2016）05-537-07

2016-03-24

2016-04-18

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0200900）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-23）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程

羅宗秀，男，博士研究生，助理研究員，主要從事茶樹(shù)害蟲(chóng)化學(xué)生態(tài)學(xué)研究。

zmchen2006@163.com