L16（45）正交實驗優(yōu)化鮮生姜黃酮類物質(zhì)提取工藝

姜輝煌，侯爽，周祉延，李強，周長征△

1山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南250355；2吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院

L16（45）正交實驗優(yōu)化鮮生姜黃酮類物質(zhì)提取工藝

姜輝煌1，侯爽1，周祉延2，李強1，周長征1△

1山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南250355；2吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院

目的：選用不同單因素水平，通過正交實驗，研究從鮮生姜中提取黃酮物質(zhì)的工藝條件。方法：選用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)對照，采用回流提取法，以紫外光度法測定其含量，選取切片厚度、乙醇濃度、提取溫度、料液比等進行正交實驗的方法學(xué)考察，得到最佳工藝流程。結(jié)果：鮮生姜原料切片厚2 m m，乙醇濃度85%，浸提溫度80℃，固液比1:5 g/m L，在此條件下黃酮的收率最高。

鮮生姜；黃酮；提取工藝

生姜是姜科多年生草本植物姜的新鮮根莖，別名有姜根、百辣云、勾裝指、因地辛。姜的根莖葉均可入藥。生姜在傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)里具有發(fā)散、止嘔、止咳等功效［1］。近年研究表明生姜是治療鹽酸-乙醇性潰瘍的有效藥物，生姜醇提取物對麻醉貓血管運動中樞及呼吸中樞有興奮作用［2］，生姜對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，提取的生姜揮發(fā)油能明顯抑制小鼠自發(fā)活動及抗病原微生物、抗氧化作用［3］。目前生姜中黃酮類物質(zhì)的提取方法主要有水提法，乙醇提取法、超聲和微波提取法［4］，但上述提取方法基本以姜粉為提取原料。本研究從新鮮的生姜中提取黃酮類物質(zhì)，省去干燥，粉碎的步驟，節(jié)約時間和能源。此方法較采用姜粉提取的黃酮總量高（按生姜平均含水量80%）。

1　材料與方法

1.1藥物生姜購于濟南長清區(qū)銀座超市，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民教授鑒定為此類植物的根莖。

1.2試劑乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、鎂粉、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、濃氨水、三氯化鋁、蘆丁對照品均購于中國藥品生物制品檢測所。

1.3儀器數(shù)顯恒溫水箱水浴鍋；UV-6000型紫外分光光度計（上海元析儀器公司提供）；BS210S型電子天平（北京賽多利斯天平股份有限公司提供）；旋蒸儀（上海亞榮儀器總廠提供）；中藥切片機；高速離心機。

1.4方法

1.4.1提取條件的選擇

1.4.1.1提取溶劑的選擇取1 g生姜切片，選擇切片厚度2 mm，于100 mL圓底燒瓶，加入水、乙醇、丙酮、甲醚各30 mL，于85℃提取3次，每次時長為1小時，合并濾液過濾，黃酮顯色反應(yīng)，測定黃酮含量，結(jié)果表明，溶劑為乙醇時黃酮的總得率最高，故提取溶劑選擇乙醇，見表1。

表1　不同提取溶劑的黃酮提取效率

1.4.1.2提取方法的選擇取1 g生姜切片，選擇切片厚度2 mm，乙醇濃度為70%，分別用以下方法進行提取，黃酮顯色反應(yīng)，測定黃酮的含量，結(jié)果表明，回流提取時鮮生姜黃酮的得率最高，所以選擇方法為回流提取，見表2。

表2　鮮生姜在不同提取方法時的黃酮提取率

1.4.2溶液的制備

1.4.2.1供試品溶液的制備精密稱取1 g生姜切片，操作按正交實驗設(shè)計相關(guān)因素進行，使用水浴加熱每次提取1小時，冷卻并超速離心（5 000 r/min），除去纖維不溶物，然后乙醇溶解，定容于20 mL容量瓶。

1.4.2.2黃酮類化合物含量測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉絡(luò)合反應(yīng)，將標(biāo)準(zhǔn)樣品置于20 mL的容量瓶中，按賈冬英等［5］的方法處理，以試劑作為空白對照，在500 nm處進行紫外光吸收測定。回歸方程：Y=0.0316X+0.0034（r2=0.9993），濃度范圍0.005 6～0.034 7 mg/mL，見表3。

表3　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

1.4.3鮮生姜中總黃酮的含量測定精密量取“1.4.2.1”項下濾好的供試品1 mL于10 mL容量瓶，加0.3 mL 5%NaNO2于容量瓶中，搖勻靜置6分鐘；再加入0.3 mL10%AI（NO3）3于容量瓶內(nèi)，搖勻靜置5分鐘；加入1 mo1/LNaOH 3 mL后搖勻靜置12分鐘定容至刻度，在500 nm處進行紫外吸收測定，平行測定2次，得出總黃酮總量。

1.4.4精密度實驗取鮮生姜提取物各4份，依本實驗含量測定方法顯色并測定黃酮含量，黃酮總量平均量為10.37 mg/g，RSD為0.85%，表明精密度良好。

1.4.5回收率實驗此藥材已知含量的提取液中，加入一定含量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品，按照含量測定方法測定蘆丁的平均含量96.82%，RSD為1.77%。

1.4.6正交實驗設(shè)計依據(jù)相關(guān)文獻，選定提取1小時為恒定指標(biāo)，研究片厚A、提取溫度B、體積分?jǐn)?shù)C、料液比D、提取次數(shù)E等對總黃酮提取效果的影響，每個因素下設(shè)4個水平，進行正交實驗設(shè)計，以總黃酮的得率作為評價指標(biāo)，對該部位總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，見表4。

表4　正交實驗單因素水平

2　結(jié)果

2.1單因素實驗設(shè)計結(jié)果與分析

2.1.1乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量的影響精密稱取1.00 g生姜，以不同體積分?jǐn)?shù)（65%，75%，85%、95%）的乙醇溶液為溶劑，料液比1∶20，提取溫度為70℃，片厚為2 mm，提取次數(shù)為2次，每次1小時，結(jié)果顯示，隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大，提取率增大，在75%時達(dá)到最大，其后隨著乙醇的體積分?jǐn)?shù)增大提取率反而降低。造成該現(xiàn)象的原因可能是隨著乙醇濃度的增大，水溶性黃酮減少而脂溶性物質(zhì)溶出［6］。

2.1.2提取次數(shù)對總黃酮含量的影響精密稱取1.00 g生姜，以體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液，料液比為1∶20，溫度為70℃，片厚為2 mm，單次回流提取時間1小時，分別提取4次，結(jié)果顯示，提取次數(shù)在1～3次時生姜總黃酮的得率增加，而3次后隨著時間的增加，總黃酮的得率有所下降。可以得出不同提取時間對黃酮總得率影響較大。時間過短，黃酮不能充分溶出，時間過長可能造成黃酮類物質(zhì)的分解損失［7］。

2.1.3固液比對總黃酮得率的影響精密稱取1.00 g生姜，以體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液，溫度為70℃，回流提取次數(shù)為2次，片厚2 mm，料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，結(jié)果可見，在固液比為1∶10時，提取可達(dá)到較好效果。若再增加提取溶劑的量對總黃酮得率增加效果影響不大，考慮到生產(chǎn)成本，固液比以1∶10為宜。

2.1.4提取溫度對總黃酮得率的影響精密稱取1.00g生姜，以體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液，回流提取次數(shù)為2次，料液比為1∶20，片厚為2 mm，溫度為50℃、60℃、70℃、80℃，結(jié)果可見，隨提取溫度的升高，總黃酮的得率也逐漸升高，這是因為隨著提取溫度升高，分子的運動速度增加，滲透和擴散作用增強，使得黃酮類化合物更容易溶出，考慮到能耗，選擇70℃為宜［8］。

2.1.5片厚對總黃酮得率的影響精密稱取1.00 g生姜，以體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液，溫度為70℃，回流提取次數(shù)為2次，料液比為1∶20，片厚為0.5 mm、1 mm、2 mm、4 mm，結(jié)果可見，片厚為1 mm時，黃酮得率較高，減少片厚對黃酮提取影響不大。

2.1.6正交實驗按照表4利用正交設(shè)計對各因素的提取條件進行篩選，以黃酮含量為指標(biāo)，平行測量兩次，結(jié)果見表5。

表5L16（45）正交實驗所得結(jié)果

通過正交實驗數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，鮮生姜中總黃酮的提取最佳工藝為A3B1C3D4E2，影響提取的主要因素為乙醇濃度＞提取溫度＞料液比＞片厚＞提取時間，乙醇濃度對其影響最大，片厚為2 mm，乙醇濃度85%，浸提溫度80℃，固液比1∶5（g/mL）的條件下黃酮得率最高。

［1］黃泰康.常用中藥成分及藥理手冊［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1994：178.

［2］李素民，楊秀嶺，趙智，等.干姜和生姜藥理研究進展［J］.中草藥，1999，30（6）:471-473.

［3］劉雪梅.生姜的藥理作用研究進展［J］.中成藥，2002，24（7）: 539-541.

［4］游見明.生姜黃酮的提取方法比較［J］.四川食品與發(fā)酵，2005，41（2）:29-31.

［5］賈冬英，喬玉蘭，譚敏.用正交法探討苦蕎麥莖及籽殼中總黃酮蘆丁的乙醇提取工藝［J］.食品科學(xué)，1997，18（6）:22-25.

［6］常楚瑞.乙酸乙酯回流法提取木瓜總黃酮及含量［J］.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，26（4）:326-327.

［7］李瑞麗，喬五忠，王艷輝，等.葡萄籽原花青素的超聲提取工藝研究［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27（2）:64-66.

［8］李躍中，縱偉，董海麗.超聲輔助提取菊花中綠原酸的工藝研究［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2008，14（9）:194-195.

The Extraction Process of F lavonoid Substances from Fresh Ginger Optimized by L16（45）Orthogonal Experiment

JIANG Huihuang1，HOU Shuang1，ZHOU Zhiyan2，LI Qiang1，ZHOU Changzheng1△
1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2 College of Oral Medicine of Jilin University

Objective:To study the extraction process of flavonoid substances from fresh ginger by choosing different single-factor levels in orthogonal experiment.Methods:The contents of flavonoid substances were detected by ultraviolet spectrophotometry after choosing rutin as standard control articles by reflux extraction method，the best extraction process was obtained by investigating the methodology of orthogonal experiment containing the thickness of the slice，the concentrations of ethanol，extraction temperature，solid-liquid ratio and others.Results: The thickness of fresh ginger slice is 2mm，the concentrations of ethanol was 85%，extraction temperature 80℃，solid-liquid ratio 1:5 g/mL，the yield of flavonoids reaches the highest under the conditions.

fresh ginger；flavonoids；the extraction process

R284.2

A

1004-6852（2016）05-0037-03

2015-03-20

姜輝煌（1990—），男，在讀碩士研究生。研究方向：藥劑學(xué)。

周長征（1966—），男，教授。研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)。