HPLC-MS/MS法檢測(cè)雞肉中8種鎮(zhèn)靜劑殘留

華萌萌，宮小明，郭禮強(qiáng)，丁葵英，王洪濤，于金玲

（濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊261041）

HPLC-MS/MS法檢測(cè)雞肉中8種鎮(zhèn)靜劑殘留

華萌萌，宮小明*，郭禮強(qiáng)，丁葵英，王洪濤，于金玲

（濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊261041）

建立雞肉中8種獸藥鎮(zhèn)靜劑（乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇和咔唑心安）同時(shí)檢測(cè)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法。以乙腈-0.1 mol/L鹽酸溶液（90/10，體積比）作為提取試劑，混合型陽離子固相萃取柱凈化，經(jīng)AgilentZORBAXRRHDEclipsePlusC18色譜柱（100mm×3.0mm，1.8μm）分離，電噴霧正離子（ESI+）模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。8種目標(biāo)物在0.5 μg/L～20.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)r2≥0.998），其檢出限（LOD）為0.5 μg/kg，定量限（LOQ）為1.0 μg/kg。在1.0、5.0、10.0 μg/kg加標(biāo)水平下，平均回收率為85.3%～95.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%～5.00%。該方法穩(wěn)定、可靠，能夠滿足雞肉中8種鎮(zhèn)靜劑的檢測(cè)和確證。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；雞肉；鎮(zhèn)靜劑類；殘留

鎮(zhèn)靜劑類藥物對(duì)動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，在畜禽飼養(yǎng)和運(yùn)輸過程中可作為麻醉劑和止痛劑減輕或消除動(dòng)物狂躁不安、興奮，達(dá)到減少死亡率、增重催肥及縮短出欄時(shí)間的目的。此類藥物潛伏在動(dòng)物體內(nèi)，被人食用后會(huì)損害人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起體位性低血壓、心悸、運(yùn)動(dòng)障礙、肝損害、惡性綜合征，甚至誘變致癌［1-2］。因此，許多國家將此類藥物列為禁藥，并對(duì)動(dòng)物源食品中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留量有嚴(yán)格的限量要求。國際食品法典委員會(huì)（CAC）規(guī)定畜肉中阿扎哌醇、咔唑心安在畜肉中的最高殘留限量值分別為肌肉、脂肪中60 μg/kg和5.0 μg/kg，肝臟、腎臟中100 μg/kg和25 μg/kg［3］。我國農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告已明確規(guī)定阿扎哌隆、阿扎哌醇在豬肉、脂肪、肝臟和腎臟中的最高殘留限量值分別為60、60、100、100 μg/kg，氯丙嗪只允許治療使用，不得在動(dòng)物源食品中檢出［4］。

目前，國內(nèi)外對(duì)鎮(zhèn)靜劑的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）［5］、高效液相色譜法（HPLC）［6-7］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）［8-9］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）［1-2，10-11］等。ELISA法檢測(cè)后需要其他方法驗(yàn)證，高效液相色譜法靈敏度低，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖靈敏度高，但在獸殘樣品檢測(cè)時(shí)樣品需衍生，步驟繁瑣且費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，目前較為常用的為高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［11-14］。本研究選擇的目標(biāo)物為乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇等8種鎮(zhèn)靜劑，利用HPLC-MS/ MS法對(duì)雞肉中8種鎮(zhèn)靜劑同時(shí)檢測(cè)，以酸化乙腈提取，采用PCX固相萃取柱凈化簡(jiǎn)單快速，與國標(biāo)GB/T 20763-2006《豬腎和肌肉組織中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、行標(biāo)SN/T 2113-2008《進(jìn)出口動(dòng)物源食品中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留量的檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》、孫雷等［1，10，12-13］報(bào)道使用的叔丁基甲醚提取、調(diào)pH值酶解及液液萃取的前處理方法［15］相比毒性小、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單，采用內(nèi)標(biāo)法（氯丙嗪-D6）定量，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足要求，檢出限為0.5 μg/kg，定量下限為1.0 μg/kg，可為動(dòng)物源食品中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留檢測(cè)提供有力幫助。

1試驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

Agilent 1290-6460液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent公司；Mettler AE163萬分之一天平：Mettler公司；IKA TA25均質(zhì)器、IKA MSI振蕩器：IKA公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf公司；Supelco固相萃取裝置：Supelco公司；N-EVAP-111氮吹儀：美國Organomation公司。

甲苯噻嗪標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-Aldrich公司；氟哌啶醇：上海安譜公司；乙酰丙嗪、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、阿扎哌醇、氯丙嗪、咔唑心安、阿扎哌隆標(biāo)準(zhǔn)品：Dr.Ehrenstorfer公司；氯丙嗪-D6：TRC公司；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純）：Merk公司；水為Milli-Q純水機(jī)得到的超純水；混合型陽離子固相萃取柱（PCX固相萃取柱，60 mg，3 mL）：Angel公司；中性固相萃取柱（HLB固相萃取柱，60 mg，3 mL）：Waters公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取8種標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇溶解，定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；將1 mg包裝的內(nèi)標(biāo)氯丙嗪-D6，用甲醇溶解，定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為10 μg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；將上述儲(chǔ)備液稀釋成100 μg/L中間液，避光于4℃下保存。為避免分析物分解，應(yīng)采用棕色器容量瓶保存。用初始流動(dòng)相（見1.4.1）分別配制濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液（內(nèi)標(biāo)氯丙嗪-D6的濃度為5.0 μg/L），用于質(zhì)譜檢測(cè)分析，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3樣品處理

1.3.1樣品提取

準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品，置于50 mL塑料帶蓋離心管中，加入10 mL乙腈-0.1 mol/L鹽酸（90/10，體積比）提取溶液，于均質(zhì)機(jī)上高速均質(zhì)2 min，于10 000 r/min下離心10 min，用塑料小漏斗、脫脂棉過濾上清液，待凈化。

1.3.2樣品凈化

采用混合型陽離子PCX固相萃取柱凈化，經(jīng)過3 mL甲醇、3 mL水活化；將上述樣品提取液（約10 mL）全部過柱，棄去流出液；再用3 mL水、3 mL甲醇淋洗除去雜質(zhì)和脂肪，抽真空后，用5 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，用初始流?dòng)相（見1.4.1）定容至1 mL，0.22 μm膜過濾待質(zhì)譜檢測(cè)。

1.4HPLC-MS/MS條件

1.4.1HPLC條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18column（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫順序：0～2 min，20%B；2 min～4 min，20%～30%B；4 min～8 min，30%～60%B；8 min～8.2 min，60%～20%B；8.2min～10min，20%B。流速：0.4mL/min。

1.4.2MS/MS條件

電離源：電噴霧離子源（ESI+）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；離子源溫度：350℃；干燥氣流速9 L/min；噴霧針壓力：40 psi（1 psi=6.895 kPa）；電子倍增器電壓：4 000 V；碰撞氣：高純氮（純度為99.999%）；8種鎮(zhèn)靜劑的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1　8種鎮(zhèn)靜劑的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 1MS parameters of the 8 sedatives

續(xù)表18種鎮(zhèn)靜劑的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Continue table 1MS parameters of the 8 sedatives

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件的優(yōu)化

本研究考察不同流動(dòng)相對(duì)8種鎮(zhèn)靜劑的HPLCMS/MS檢測(cè)的影響，分別就有機(jī)相選擇甲醇或乙腈及0.1%甲酸-水溶液是否加入乙酸銨進(jìn)行分析。圖1 a、b、c中峰1～8分別代表8種鎮(zhèn)靜劑在不同流動(dòng)相中的定量離子色譜圖（如圖1注釋），其中x軸為峰保留時(shí)間，y軸為峰面積響應(yīng)值。如圖1 a、b所示8種鎮(zhèn)靜劑在乙腈-甲酸水系統(tǒng)和甲醇-甲酸水系統(tǒng)中的出峰時(shí)間段分別在1.5 min～7.4 min和4.5 min～9.5 min，并且氯丙嗪（8峰）、乙酰丙嗪（5峰）在甲醇-甲酸水系統(tǒng)中峰面積響應(yīng)值明顯降低。圖1 a、c所示8種鎮(zhèn)靜劑在0.1%甲酸水溶液中加入10 mmol/L乙酸銨與不加乙酸銨出峰時(shí)間段分別為3.2 min～7.5 min和1.5 min～7.4 min，各目標(biāo)物峰面積響應(yīng)值沒有影響。由于8種鎮(zhèn)靜劑的化學(xué)性質(zhì)不同，不同流動(dòng)相系統(tǒng)中出峰順序也有所不同。綜上所述，本研究選擇出峰時(shí)間早、響應(yīng)值高的乙腈和0.1%甲酸-水溶液作為流動(dòng)相。

2.2樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1固相萃取柱的選擇

已知8種目標(biāo)物為弱堿性化合物，在前處理過程中應(yīng)選擇中性或陽離子固相萃取柱進(jìn)行樣品凈化。

本研究選擇中性HLB和混合型陽離子PCX兩種固相萃取柱，就它們對(duì)8種目標(biāo)物回收率的影響進(jìn)行如下試驗(yàn)。將8種鎮(zhèn)靜劑1.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液分別經(jīng)上述兩種小柱，分別收集每步流出液，氮吹后經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果表明經(jīng)HLB固相萃取柱在上樣和淋洗過程中都有檢測(cè)到目標(biāo)物，洗脫過程中得到8種目標(biāo)物回收率為50%～60%；而經(jīng)PCX固相萃取柱的回收率90%以上，其他過程均未檢測(cè)到目標(biāo)物。說明PCX固相萃取柱更能有效的結(jié)合目標(biāo)物，保證在去除樣品中的脂肪、蛋白等雜質(zhì)的過程中目標(biāo)物不損失，達(dá)到凈化目的。

2.2.2提取試劑的優(yōu)化

圖1　不同流動(dòng)相中8種鎮(zhèn)靜劑添加水平1.0 μg/L的雞肉樣品定量離子疊加色譜圖Fig.1Quantitative ion overlap chromatograms of the blank chicken sample spiked with 8 sedatives at 1.0 μg/kg in different mobile phases

本研究考察兩種不同pH值提取試劑，分別為提取液a：乙腈-0.1 mol/L鹽酸溶液（90/10，體積比，pH為3左右）；提取液b：乙腈-甲酸溶液（98/2，體積比，pH為4左右）。在空白雞肉樣品中添加1.0 μg/kg水平下，比較二者在經(jīng)PCX固相萃取柱凈化后的回收率。檢測(cè)結(jié)果表明8種目標(biāo)物經(jīng)提取液a的回收率在80%以上，提取液b的回收率僅為50%左右，說明不同提取試劑的pH值對(duì)8種目標(biāo)物經(jīng)PCX固相萃取柱的凈化有影響，故本試驗(yàn)選擇乙腈-0.1 mol/L鹽酸溶液作為提取試劑。

2.3線性關(guān)系、檢出限和定量下限

本研究采用內(nèi)標(biāo)法定量，按照“1.3”配制一系列不同質(zhì)量濃度的8種鎮(zhèn)靜劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（內(nèi)標(biāo)氯丙嗪-D6的濃度為5.0 μg/L）作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析，各目標(biāo)物的線性范圍及回歸方程見表2，相關(guān)系數(shù)（r2）均≥0.998 0。以3倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平為檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平為定量下限（LOQ）。結(jié)果得出，8種目標(biāo)物的檢出限為0.5 μg/kg，定量下限為1.0 μg/kg（見表2）。

2.4準(zhǔn)確度和精密度

對(duì)空白樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。以回收率結(jié)果表示檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示方法的精密度。在空白雞肉樣品中添加1.0、5.0、10.0 μg/kg3個(gè)水平回收，每個(gè)水平平行測(cè)定6個(gè)樣品，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3　8種鎮(zhèn)靜劑的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3The recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 8 sedatives

8種鎮(zhèn)靜劑在3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率在85.3%～96.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.81%～5.00%。

2.5實(shí)際樣品的檢測(cè)

利用本方法對(duì)采購于本地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市的10份雞肉樣品進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)有鎮(zhèn)靜劑殘留。

3結(jié)論

本研究建立了8種鎮(zhèn)靜劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的多殘留同時(shí)檢測(cè)方法，采用內(nèi)標(biāo)法定量，準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈敏度高。本研究前處理方法簡(jiǎn)單快速、可操作性強(qiáng)，重現(xiàn)性強(qiáng)，各項(xiàng)指標(biāo)均能滿足獸藥殘留檢測(cè)分析的要求，可用于雞肉中鎮(zhèn)靜劑類藥物多殘留檢測(cè)，可為動(dòng)物源食品中鎮(zhèn)靜劑的常規(guī)檢測(cè)提供有力幫助。

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Determination of Eight Sedative Residues in Chicken by HPLC-MS/MS

HUA Meng-meng，GONG Xiao-ming*，GUO Li-qiang，DING Kui-ying，WANG Hong-tao，YU Jin-ling
（Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang 261041，Shandong，China）

A method for the determination of 8 sedative（acetopromaizine，chlorpromazine，haloperidol，propionylpromazine，xylazine，azaperone，azaperol and carazolol）residues in chicken by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）had been developed.The sample was extracted with acetonitrile-0.1 mol/L HCl（90/10，volume ratio）and cleaned up with Angel PCX SPE colum.The targeted compounds were loaded onto an Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18column（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）. The electrospray was operated in the positive mode and the samples were monitored by the multiple reaction monitoring（MRM）mode，and an internal standard method was used for quantitative analysis of 8 sedatives.The calibration curves of the 8 sedatives showed good linearity in the range of 0.5 μg/L-20.0 μg/L（correlation coefficients r2≥0.998）.The limits of detection of the 8 sedatives were 0.5 μg/kg，and the limit of quantification was 1.0 μg/kg.The average recoveries and the relative standard deviations ranged from 85.3%-95.5%and from 0.81%-5.00%at the spiked levels of 1.0，5.0，10.0 μg/kg for the 8 sedatives in chicken matrix.This method is reliable，and suitable for the determination of 8 sedative residues in chicken.

HPLC-MS/MS；chicken；sedatives；residue

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.031

2015-09-28

山東檢驗(yàn)檢疫局科研基金項(xiàng)目（SK201216）；濰坊市2015年科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（2015ZJ1101）

華萌萌（1986—），女（漢），中級(jí)工程師，碩士，研究方向：農(nóng)獸藥殘留及添加劑分析。

宮小明，高級(jí)工程師，碩士。