利拉魯肽對(duì)大鼠壓力負(fù)荷型慢性心衰的保護(hù)作用

王晨陽(yáng), 曹海濤*，張志華，華川

(1.解放軍第252醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，河北 保定　071000； 2.解放軍第252醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 保定　071000；3.解放軍第252醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定　071000)

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利拉魯肽對(duì)大鼠壓力負(fù)荷型慢性心衰的保護(hù)作用

王晨陽(yáng)1, 曹海濤1*，張志華2，華川3

(1.解放軍第252醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，河北 保定071000； 2.解放軍第252醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 保定071000；3.解放軍第252醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定071000)

目的 研究利拉魯肽對(duì)壓力負(fù)荷型慢性心衰大鼠心臟功能的作用及其機(jī)制。方法30只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、心衰組、利拉魯肽組，每組10只大鼠。心衰組、利拉魯肽組采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備模型，假手術(shù)組只穿線不縮窄。利拉魯肽組術(shù)后12周給予利拉魯肽皮下注射，2 mg/kg·d，共30 d。假手術(shù)組和心衰組給予同等劑量的生理鹽水。給藥30 d后給大鼠稱重，并使用壓力容積系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，同時(shí)對(duì)大鼠的各個(gè)器官稱重。將大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈抽血離心后取血清，按試劑盒方法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、B型鈉尿肽(BNP)、丙二醛(MDA)。結(jié)果心臟稱重顯示，利拉魯肽組的心臟重量明顯低于心衰組(P< 0.05)。壓力容積系統(tǒng)檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)顯示，相比于假手術(shù)組，利拉魯肽組大鼠的Ves、Ved、Pmax、Pes、Ped值均有明顯降低(P< 0.05)，dP/dt max、-dP/dt min、EF和PowMax值則明顯增加(P< 0.05)。和心衰組相比，利拉魯肽組大鼠血清中的SOD值明顯增加(P< 0.05)，BNP值則明顯降低(P< 0.05)。結(jié)論利拉魯肽可以改善心衰大鼠左心室的收縮和舒張功能，減輕心肌細(xì)胞的損傷，其機(jī)制可能與抗氧化作用相關(guān)。

利拉魯肽；壓力超負(fù)荷；心力衰竭

近年來(lái)，利拉魯肽作為一種人胰升糖素樣肽1(GLP-1)類似物受到廣泛關(guān)注，由于其良好的降血糖作用，被廣泛的應(yīng)用于2型糖尿病患者。大量研究表明，利拉魯肽不僅具有葡萄糖依賴性降糖作用[1]，同時(shí)對(duì)心血管系統(tǒng)具有直接或間接的保護(hù)作用，并且這種作用獨(dú)立于血糖調(diào)節(jié)機(jī)制[2]。它具有降低血脂、血壓[3]，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[4]，減少心肌細(xì)胞損傷，改善心功能[5]等功效。

大量基礎(chǔ)與臨床研究顯示利拉魯肽對(duì)2型糖尿病患者心血管系統(tǒng)具有良好的預(yù)防和改善作用，但是利拉魯肽對(duì)于不合并糖尿病的壓力負(fù)荷型慢性心衰的作用及機(jī)制研究未見(jiàn)報(bào)道。壓力負(fù)荷型慢性心衰主要是由于壓力負(fù)荷產(chǎn)生高血壓，進(jìn)而導(dǎo)致心臟左室肥厚、重構(gòu)，心臟泵血功能降低，逐步發(fā)生心力衰竭，最終導(dǎo)致心血管病的高死亡率。本研究通過(guò)建立壓力負(fù)荷型慢性心衰大鼠模型，觀察GLP-1類似物利拉魯肽對(duì)慢性心衰大鼠的左心室功能、血清酶的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠30只，8周，體重160～180 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(京)2012-0004]。無(wú)菌手術(shù)在解放軍第252醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(軍)2007-019]進(jìn)行，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器

利拉魯肽(預(yù)填充注射筆)由諾和諾德(中國(guó))制藥有限公司提供；超氧化物歧化酶(SOD)、B型鈉尿肽(BNP)、丙二醛(MDA)試劑盒均來(lái)自R&D公司；日立7600-020全自動(dòng)生化分析儀(日立公司)； MPVS Ultra-400壓力-容積系統(tǒng)(AD Instrumengts公司)，導(dǎo)管型號(hào)為SPR-838，采用PowerLab(AD Instrumengts公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組及給藥

30只大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組10只；心衰組10只；利拉魯肽組10只。心衰組和利拉魯肽組采用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制備壓力超負(fù)荷心衰大鼠模型。假手術(shù)組只行腹主動(dòng)脈穿線不縮窄。利拉魯肽組術(shù)后12周給予利拉魯肽皮下注射，2 mg/kg·d。共30 d。假手術(shù)組和心衰組給予同等劑量生理鹽水，共30 d。在手術(shù)過(guò)程中，假手術(shù)組死亡1只，心衰組死亡1只，利拉魯肽組死亡1只，在術(shù)后第2周心衰組死亡一只。最后假手術(shù)組9只大鼠，心衰組8只大鼠和利拉魯肽組9只大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.3.2心衰動(dòng)物模型的建立

參照Conrad等[6]的方法并作改進(jìn)[7,8]。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。稱重后，用50 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后，在左側(cè)脊肋角區(qū)大概2 cm2的范圍備皮，1%碘伏消毒，縱向切開(kāi)皮膚，鈍性分離肌肉，暴露腹主動(dòng)脈，剝離腹主動(dòng)脈周圍的結(jié)締組織，跟據(jù)腹主動(dòng)脈粗細(xì)以直徑為0.8 mm左右的不銹鋼探針(或使用小鼠灌胃針，去掉圓頭)與腹主動(dòng)脈一起使用4號(hào)手術(shù)線結(jié)扎，雙線結(jié)扎，抽出探針形成腹主動(dòng)脈狹窄(約50%～60%)，縫合肌層和手術(shù)切口，同時(shí)腹腔注射青霉素10萬(wàn)IU。假手術(shù)組腹主動(dòng)脈只穿線而不進(jìn)行縮窄，其他手術(shù)步驟同模型組。

1.3.3心、肺/體重比的計(jì)算

麻醉后立即開(kāi)胸取出心臟、肺臟，在預(yù)冷的0～4℃生理鹽水中洗去淤血，濾紙吸干水分，應(yīng)用精密天平測(cè)定各組動(dòng)物的心臟、肺臟的濕重，計(jì)算心重比、肺重比。

1.3.4應(yīng)用壓力容積系統(tǒng)對(duì)大鼠左心室功能進(jìn)行測(cè)定

開(kāi)始前大鼠稱重，用0.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部備皮消毒，在頸部正中切口，分離氣管后插管，分離右頸總動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，用動(dòng)脈夾夾畢頸總動(dòng)脈近心端后，剪口插入Millar壓力容積導(dǎo)管(SPR-838)，松開(kāi)動(dòng)脈夾結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，調(diào)整導(dǎo)管位置，緩慢插入左心室。在LabChart_v7.3.7軟件平臺(tái)中PVLoop_v2.0軟件記錄穩(wěn)定狀態(tài)下P-V波形的變化；腹部備皮消毒，腹部正中切口，分離下腔靜脈后快速壓閉下腔靜脈(減少回心血量，暫時(shí)降低左心室前負(fù)荷)，記錄P-V波形的變化；最后自下腔靜脈快速注射10%NaCl溶液100 μL，記錄P-V波形的變化。用肝素處理過(guò)的5 mL注射器下腔靜脈取血，將血注入定標(biāo)套件，取導(dǎo)管容積定標(biāo)。

1.3.5應(yīng)用labchart軟件分析血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在LabChart_v7.3.7軟件中，打開(kāi)保存的數(shù)據(jù)，選取一段波形穩(wěn)定的P-V環(huán)，對(duì)原始數(shù)據(jù)完成校正后，計(jì)算出穩(wěn)定狀態(tài)和改變前負(fù)荷時(shí)的心輸出量(CO)、每搏出量(SV)、收縮末期容積(Ves)、舒張末期容積(Ved)、壓力最大值(Pmax)、收縮末期壓力(Pes)、舒張末期壓力(Ped)、心率(HR)、搏出功(SW)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室壓力最大上升速率(dP/dt max)、最大功率(PowMax)、左室壓力最大下降速率(-dP/dt min)、壓力衰退的時(shí)間常數(shù)(Tau)等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.3.6血漿SOD、BNP和MDA的測(cè)定

在麻醉狀態(tài)下，取大鼠下腔靜脈血2 mL，4℃，3000 r/min，離心10 min，分離血漿，-80℃保存，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)添加標(biāo)本和試劑，用7600-020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.4統(tǒng)計(jì)方法

2　結(jié)果

2.1體重和器官重量

假手術(shù)組、心衰組和利拉魯肽組大鼠在術(shù)后16周處死，分別稱量體重、心臟和肺臟的重量。發(fā)現(xiàn)和假手術(shù)組相比，心衰組心臟和肺的重量都有增加，其中心臟和心重比有顯著增加(P< 0.01，見(jiàn)表1)，肺臟和肺重比有明顯增加(P< 0.05，見(jiàn)表1)。而利拉魯肽組和心衰組相比，心臟重量明顯減小(P< 0.05)，雖然體重和肺臟重量，以及心重比和肺重比都有所下降，但是并不明顯(P> 0.05，見(jiàn)表1)。

2.2左心室舒縮功能

假手術(shù)組、心衰組和利拉魯肽組大鼠左心室舒縮功能參數(shù)見(jiàn)表2。和假手術(shù)組大鼠比較，心衰組大鼠的Ves、Ved、Pmax、Pes、Ped、SW、Tau值均有明顯增加(P< 0.05)，而dP/dt max、-dP/dt min、EF、SV和PowMax值則明顯降低(P< 0.05)，心輸出量(CO)雖降低，但并不明顯(P> 0.05)。和假手術(shù)組比較，利拉魯肽組大鼠的Ves、Ved、Pmax、Pes、Ped值均有明顯降低(P< 0.05)，dP/dt max、-dP/dt min、EF和PowMax值則明顯增加(P< 0.05)。

表1　各組大鼠體重和器官重量情況

注：*P< 0.05，**P< 0.01，與假手術(shù)組比較；#P< 0.05，與心衰組相比。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01,compared with the sham group;#P< 0.05,compared with the HF group.

表2　各組大鼠左心室功能參數(shù)比較

注：*P< 0.05，與假手術(shù)組比較；#P< 0.05，與心衰組相比。

Note.*P< 0.05,compared with the sham group;#P< 0.05,compared with the HF group.

表3　各組大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、B型鈉尿肽(BNP)、丙二醛(MDA)的檢測(cè)結(jié)果

注：*P< 0.05，與假手術(shù)組比較；#P< 0.05，與心衰組相比。

Note.*P< 0.05,compared with the sham group;#P< 0.05,compared with the HF group.

2.3利拉魯肽對(duì)壓力負(fù)荷型心衰大鼠血清中SOD、BNP、MDA的影響

各組大鼠血清中SOD、BNP、MDA的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。和假手術(shù)組相比，心衰組大鼠血清中的BNP和MDA明顯增加(P< 0.05)，而SOD值則明顯降低(P< 0.05)。和心衰組相比，利拉魯肽組大鼠血清中的SOD值明顯增加(P< 0.05)，BNP值則明顯降低(P< 0.05)，MDA值有所下降，但并不明顯。

3　討論

心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床癥狀群，是由于各種原因?qū)е碌某跏夹募p傷，進(jìn)而引起心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，最終導(dǎo)致心室收縮或舒張功能的低下。它是各種心臟病的嚴(yán)重階段，具有很高的致殘率及病死率。高血壓造成的心臟壓力負(fù)荷是導(dǎo)致心力衰竭的常見(jiàn)病因之一，在血壓過(guò)高的情況下，心臟壓力負(fù)荷過(guò)重，心室肌代償性肥厚以保證射血量。持久的負(fù)荷過(guò)重，心肌必然發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變而導(dǎo)致失去代償功能。容量超負(fù)荷是誘發(fā)心肌肥大和心力衰竭的常見(jiàn)原因之一。

腸促胰素胰升糖素樣肽1(GLP-1)的藥物不僅具有卓越的降糖效果，同時(shí)對(duì)心血管系統(tǒng)起到了一定的保護(hù)作用，利拉魯肽作為GLP-1的代表藥物，通過(guò)與遍布全身多種組織的GLP-1受體結(jié)合，發(fā)揮各種作用，尤其是對(duì)心血管的作用[9,10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是造成心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制之一，糖尿病心肌病大鼠在經(jīng)過(guò)利拉魯肽治療后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)水平明顯降低，心肌細(xì)胞的凋亡也明顯減少，并且它對(duì)心血管益處是獨(dú)立于血糖調(diào)節(jié)機(jī)制的[4]。在心肌梗死小鼠模型中，在經(jīng)過(guò)7 d的利拉魯肽治療后，心臟破裂發(fā)生率和心臟梗死面積都明顯下降，并且心輸出量增加[11]。但是，利拉魯肽對(duì)于壓力負(fù)荷型慢性心衰是否起作用，以及其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)對(duì)壓力負(fù)荷型心衰大鼠給予利拉魯肽治療，和心衰組相比，利拉魯肽組大鼠的心臟重量減少，說(shuō)明利拉魯肽在一定程度上減緩了心肌重構(gòu)的發(fā)生。LV收縮功能參數(shù)Ves、Pes值在利拉魯肽組有明顯降低，表明利拉魯肽組與心衰組大鼠達(dá)到相同Ves時(shí)需要比較少的Pes，同樣，LV舒張功能參數(shù)Ved、Ped在利拉魯肽組中降低，說(shuō)明利拉魯肽組的LV收縮和舒張功能都得到了一定程度的恢復(fù)。此外，利拉魯肽組中反映心室排血功能的參數(shù)EF和PowMax值均明顯增加，進(jìn)一步說(shuō)明了利拉魯肽提高了心力衰竭大鼠的LV收縮與舒張功能。上述結(jié)果提示壓力負(fù)荷型心衰大鼠在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的利拉魯肽給藥之后，其LV的收縮與舒張功能都得到明顯改善，甚至心室擴(kuò)張情況也得到了緩解。

在血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)中，dP/dt max和-dP/dt min是描述心肌收縮和舒張變力性的重要指標(biāo)，左室壓力最大上升速率dP/dt max增大，心肌收縮功能增強(qiáng)。左室壓力最大下降速率-dP/dt min增大，心肌舒張功能增強(qiáng)[12]。我們的數(shù)據(jù)表明利拉魯肽顯著的增強(qiáng)了心肌收縮和舒張的變力性，心臟損傷明顯減少，心功能得到顯著提升。

氧化應(yīng)激是壓力負(fù)荷型心力衰竭的重要機(jī)制，SOD是人體內(nèi)主要的抗氧化酶，可清除自由基，其酶活性值的高低反映機(jī)體的抗氧化防御水平[13]，在本研究中，心衰組和假手術(shù)組相比，SOD值明顯下降，提示心衰大鼠機(jī)體的抗氧化能力明顯不足，而經(jīng)過(guò)利拉魯肽治療，SOD值又明顯回升，說(shuō)明利拉魯肽能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。

BNP是用來(lái)評(píng)價(jià)心力衰竭程度及預(yù)后狀況的神經(jīng)激素標(biāo)記物，由心肌細(xì)胞分泌，有報(bào)道慢性心衰患者血漿BNP濃度比正常人高，而且與心力衰竭的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[14]。本研究表明，在大鼠心功能不全時(shí)，由于心室超負(fù)荷、心肌重構(gòu)、腎素血管緊張素系統(tǒng)激活，BNP值顯著增高，利拉魯肽治療后，隨著心功能的改善BNP值明顯下降。MDA是生物膜中不飽和脂肪酸發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化性反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其濃度可間接反映細(xì)胞和組織功能損傷的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果利拉魯肽組的MDA值低于心衰組，差異并不顯著，提示利拉魯肽并不是主要通過(guò)調(diào)節(jié)MDA含量來(lái)發(fā)揮抗心衰作用的。

總之，利拉魯肽可以改善心衰大鼠左心室的收縮和舒張功能，減輕心肌細(xì)胞的損傷，其機(jī)制可能與抗氧化作用相關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Liraglutide protects pressure-overload rat heart from failure

WANG Chen-yang1, CAO Hai-tao1*, ZHANG Zhi-hua2, HUA Chuan3

(1. Department of Animal Experiment, No.252 Hospital of PLA, Baoding 071000, China;2. Department of Endocrinology, No. 252 Hospital of PLA, Baoding, 071000, China;3. Department of Clinical Laboratory, No. 252 Hospital of PLA, Baoding, 071000, China)

Objective To explore the effect of liraglutide on pressure-overload chronic heart failure in rats and related mechanisms. Methods Totally 30 SD rats were randomly divided into sham operation group, heart failure group and liraglutide group．The animals were anaesthetized and a Millar pressure volume conductance catheter SPR-838) was inserted through right carotid artery into LV to measure pressure-volume (P-V) loop．Body and organ weight were measured. After the end of intervention, the rats were anesthetized, and abdominal aortic blood taken from the upper serum after centrifugation. Kit method was used to measure superoxide dismutase (SOD), brain natriuretic peptide (BNP), malondialdehyde (MDA)．ResultsCompared with those of the sham operation group, there was a increase in absolute heart weight and (P< 0.05). During the P-V loop analyses, We found that left ventricular (LV) end-systolic volume, end-diastolic volume, end-systolic pressure, end-diastolic pressure and maximum pressure were all remarkablely lower in liraglutide group than HF group in rats (P< 0.05). Peak rate of pressure rise (dP/dt max), peak rate of pressure decline (-dP/dt min), ejection fraction and Maximum Power were increased in liraglutide group comparable by HF group (P< 0.05). SOD activity was significantly increased and BNP concentration was significantly decreased in liraglutide group compared to HF group (P< 0.05). ConclusionsThese results show that liraglutide protects pressure-overload rat heart from failure possibly through reducing oxidation．

Liraglutide; Pressure-overload; Heart failure

王晨陽(yáng)(1980-)，女，碩士生，助理研究員，專業(yè)：實(shí)驗(yàn)病理與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: wangbio_2004@163.com。

曹海濤(1979-)，男，主管技師，研究方向：心血管病檢驗(yàn)與臨床研究。E-mail: cht252@163.com。

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0064-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.012

2016-03-20