綠原酸對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株HXO-RB44的生長抑制作用

趙靜濱，何熹微，姚素艷，劉建生，鄭德宇

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，遼寧錦州　121001；2.遼寧撫順市眼病醫(yī)院，遼寧撫順　113008；3. 遼河油田總醫(yī)院眼科，遼寧盤錦　124010；4. 錦州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，遼寧錦州　121001 )

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◇中醫(yī)藥研究◇

綠原酸對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株HXO-RB44的生長抑制作用

趙靜濱1,2，何熹微3，姚素艷4，劉建生1，鄭德宇1

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，遼寧錦州121001；2.遼寧撫順市眼病醫(yī)院，遼寧撫順113008；3. 遼河油田總醫(yī)院眼科，遼寧盤錦124010；4. 錦州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，遼寧錦州121001 )

目的探討綠原酸(CHA)對體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)細(xì)胞株HXO-RB44的作用及機制。方法應(yīng)用CCK-8體外抑制實驗，篩選CHA對體外培養(yǎng)傳6代的人Rb細(xì)胞株HXO-RB44的最佳抑癌濃度。Westernblot檢測人Rb細(xì)胞株HXO-RB44中抑癌基因Rb1和P16及細(xì)胞周期蛋白(CyclinD2)和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK4)的表達變化；ELISA檢測培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)水平。結(jié)果CCK-8體外抑制實驗結(jié)果顯示，CHA對人Rb細(xì)胞株HXO-RB44的最佳抑癌濃度為80μmol/L。經(jīng)80μmol/LCHA處理5d的HXO-RB44細(xì)胞株中，抑癌基因Rb1和P16均有少量表達，而在陽性對照組(HT1080細(xì)胞)和未處理的HXO-RB44細(xì)胞幾乎沒有表達。CHA處理5d的HXO-RB44細(xì)胞株的CyclinD2和CDK4的表達明顯低于陽性對照組(HT1080細(xì)胞)和未處理的HXO-RB44細(xì)胞(P<0.01)。CHA處理5d的HXO-RB44的培養(yǎng)基中LDH的含量為(226.75±42.74)U/L，明顯低于正常培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基(425.84±31.67)U/L(P<0.01)。結(jié)論80μmol/LCHA可能通過增加HXO-RB44抑癌基因的表達，降低細(xì)胞周期蛋白的表達及LDH水平，而抑制HXO-RB44細(xì)胞株的增殖。

綠原酸；人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；抑癌基因；細(xì)胞周期蛋白2(CyclinD2)；細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4(CDK4)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,Rb)發(fā)生于視網(wǎng)膜的內(nèi)核層，即雙極細(xì)胞層，早期就可以發(fā)生顱內(nèi)轉(zhuǎn)移或其他遠(yuǎn)隔部位轉(zhuǎn)移，常危及患兒生命，是嬰幼兒眼病中危害性最大的一種原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病率約為1/20 000[1-3]。臨床上Rb的主要治療方法有手術(shù)摘除患病眼球[4]、放射治療[5]、激光光凝治療[6]及冷凍治療[7]等。因Rb具有早期轉(zhuǎn)移的特點，化療藥物治療成為手術(shù)治療的重要補充。目前，長春新堿[8]、卡鉑[9]、依托泊苷[10]、環(huán)磷酰胺等是治療Rb的常用藥物，而這些化療藥物在抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞的同時，可誘發(fā)脫發(fā)、神經(jīng)毒性、骨髓抑制等，也誘發(fā)耐藥性并對中晚期患者的療效不明顯。

金銀花(honeysuckleflowers)的特征活性成分為綠原酸(chlorogenicacid,CHA)，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、升高白細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血壓、降血脂等作用[11]。本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，中藥金銀花的生物提取物CHA能抑制人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株的生長增殖[12]。利用CHA的抗腫瘤作用，如果能夠抑制人Rb細(xì)胞株HXO-RB44的增殖，促進抑癌基因的表達則能為Rb的治療提供一種輔助治療藥物。

1　材料與方法

1.1材料CHA(金銀花提取物，相對分子質(zhì)量為354.30，純度>98%，湖南木蘭生物科技有限公司)，DMEM、胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清、HEPES(Hyclone公司)，單克隆抗體(P16、Rb、CDK4和cyclinD2，Sigma公司)，乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)檢測試劑盒(武漢博士德)，Westernblot檢測試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。

1.2Rb細(xì)胞株的復(fù)蘇培養(yǎng)根據(jù)姚素艷等[12]的方法，將液氮凍存的Rb細(xì)胞株HXO-RB44(中科院上海細(xì)胞庫)常規(guī)復(fù)蘇并培養(yǎng)，細(xì)胞生長融合至80%時傳代培養(yǎng)，取傳6代細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.3CHA最適濃度的篩選將傳代第5天的HXO-RB44細(xì)胞接種于96孔板中，每孔約100μL(2 000個/孔)，分別向培養(yǎng)基中加入CHA，其終濃度分別為25、50、100、200、400μmol/L，并設(shè)正常培養(yǎng)為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)5d后，加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h，待完全顯色后，應(yīng)用分光光度計于450nm波長檢測每孔的吸光度(A)，計算CHA對HXO-RB44的增殖抑制率：抑制率=(對照組A值-CHA組A值)/對照組A值×100%。通過增殖抑制率初步判定CHA對HXO-RB44的具有較好抑制作用時的濃度，再圍繞這一濃度進行進一步篩選。

以3×103個細(xì)胞/孔將傳6代HXO-RB44細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，按上述實驗獲得的較佳抑制濃度，向培養(yǎng)基內(nèi)加入CHA，使其終濃度分別為60、80、100、120、140μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)，加入CCK8試劑進行檢測，連測7d。每組設(shè)5個平行孔。細(xì)胞增殖率(%)=(實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%，繪制細(xì)胞生長曲線，并確定最佳濃度作為后續(xù)實驗。

1.4實驗分組并測定各組培養(yǎng)基LDH水平CHA組為傳6代的HXO-RB44經(jīng)終濃度為80μmol/LCHA作用，常規(guī)培養(yǎng)5d；陽性對照組為人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞株，陰性對照組為未經(jīng)處理的HXO-RB44(0μmol/LCHA組)，實驗對照組為HXO-RB44經(jīng)雷公藤紅素作用5d。收集各處理組培養(yǎng)3d時的培養(yǎng)基，室溫下1 000r/min離心10min。各組獲得的上清液用酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測試劑盒測定LDH水平。

1.5Westernblot檢測抑癌基因Rb、P16和細(xì)胞周期蛋白(CyclinD2)及細(xì)胞周期依賴蛋白(CDK4)的表達80μmol/L的CHA處理HXO-RB44并維持該濃度5d。陽性對照組采用人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞株，陰性對照組為正常培養(yǎng)的HXO-RB44，實驗對照組為雷公藤紅素(100μmol/L)處理HXO-RB44細(xì)胞株5d。取各種細(xì)胞各1×106，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，按Bradford法測定蛋白含量后于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

常規(guī)進行Westernblot檢測，其中一抗工作液稀釋比分別為Rb(1∶2 000)、p16(1∶1 000) 、CDK4(1∶800)和CyclinD2(1∶1 000)。掃描膠片，運用Quantity-One軟件分析條帶灰度值，以各樣本Rb/β-actin、p16/β-actin、CDK4/β-actin和CyclinD2/β-actin比值表示各組中Rb蛋白、p16蛋白、CDK4蛋白和CyclinD2蛋白的相對表達量。

2　結(jié)　　果

2.1HXO-RB44細(xì)胞的培養(yǎng)情況復(fù)蘇后進行培養(yǎng)的第一代HXO-RB44生長較為緩慢，約96h左右才能達到80%融合。而在傳二代后，細(xì)胞生長速度較快，細(xì)胞達到80%融合時大約需要72h，每次進行1∶3 傳代。細(xì)胞呈近似圓球形或多角形(圖1)。

圖1傳3代培養(yǎng)70h的HXO-RB44細(xì)胞(倒置顯微鏡，bar=50μm)

Fig.1The3rd-generationsubculturedHXO-RB44after70hundertheinvertedmicroscope(bar=50μm)

2.2CHA最適濃度的篩選結(jié)果CCK-8抑制實驗結(jié)果顯示，各濃度CHA處理組與對照組相比，細(xì)胞增殖均被不同程度抑制。隨著CHA劑量從25μmol/L依次增大至100μmol/L，細(xì)胞增殖率的下降也越來越明顯，呈劑量效應(yīng)關(guān)系趨勢，并達到最大(P<0.01)；從200μmol/L開始對細(xì)胞的抑制作用增加不明顯，甚至有減弱傾向(圖2)。進一步實驗并繪制的細(xì)胞生長曲線顯示，以80μmol/LCHA的抑制作用最強，對HXO-RB44細(xì)胞株的生長抑制作用更明顯(P<0.05，圖3)，后續(xù)實驗選擇80μmol/L為實驗濃度。

圖2CHA對HXO-RB44細(xì)胞株增殖的作用

Fig.2ThefunctionofHXO-RB44growthinducedbyCHA

與100μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖3CHA對人Rb細(xì)胞株HXO-RB44增殖的抑制作用

Fig.3TheinhibitionofthegrowthofHXO-RB44byCHA

2.3CHA對培養(yǎng)基中LDH含量的影響80μmol/LCHA處理后的HXO-RB44培養(yǎng)基上清的LDH為(226.75±42.74)U/L，正常培養(yǎng)組的LDH為(425.84±31.67)U/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與實驗對照組的(275.12±38.62)U/L相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.052)。

2.4各組細(xì)胞Rb蛋白、p16、cyclinD2和CDK4蛋白的表達變化體外培養(yǎng)的人Rb細(xì)胞株HXO-RB44在CHA(80μmol/L)處理5d后，抑癌基因Rb和p16的表達量與陰性對照組(0μmol/LCHA組)和陽性對照組(正常培養(yǎng)的HT1080)相比，均有明顯升高(P<0.01)，而與實驗對照組(雷公藤紅素處理組)相比，無明顯變化(圖4A、4B)。說明CHA處理后，促進了HXO-RB44中抑癌基因的表達。而實驗組CyclinD2和CDK4的表達明顯低于陰性對照組和陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而與實驗對照組相比，無明顯變化(圖4C、4D)。從CKD4和CyclinD2的檢測結(jié)果說明，80μmol/L的CHA對于Rb細(xì)胞株HXO-RB44的抑制作用是通過延緩G1/S關(guān)卡而實現(xiàn)的。

3　討　　論

Rb作為兒童期常見的惡性腫瘤，發(fā)生率僅次于葡萄膜黑色素瘤，約為2萬分之一[13-14]。在美國每年有300余新增病例，而我國的人口基數(shù)龐大，新的病例數(shù)會更多。這種發(fā)病與種族、性別無關(guān)，一般為視網(wǎng)膜母細(xì)胞基因的雙等位基因突變引起。發(fā)達國家診斷病例的早期率為95%左右，而我國僅為85%左右，并且Rb的早期診斷和適宜的治療是挽救患者生命、甚至是保護眼睛和恢復(fù)受損視力的最關(guān)鍵因素[15]。局部治療輔助以化學(xué)治療對于腫瘤較大且出現(xiàn)眶內(nèi)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)隔部位轉(zhuǎn)移的Rb來說是很好的選擇[16]。

圖4CHA對HXO-RB44中Rb、P16、CyclinD2和CDK4表達的影響

Fig.4EffectsofCHAontheexpressionsofRb,P16,CyclinD2andCDK4inHXO-RB44

A1、B1、C1、D1：分別為Westernblot檢測結(jié)果。泳道1：80μmol/LCHA組(實驗組)；2：陰性對照組；3：實驗對照組；4：陽性對照組。A2、B2、C2、D2：灰度掃描結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析。與實驗組相比，**P<0.01。

此外，化療藥物能減少放射治療的放射劑量，減少二次損傷和其他一些繼發(fā)性疾病。常用的化療藥物包括長春新堿、卡鉑、順鉑等，但是化療藥物的副作用卻不可忽視。

研究表明，腫瘤組織癌基因和抑癌基因的平衡在某些因素作用下被打破，使癌基因活化，而抑癌基因受抑制，從而引起組織的惡性變。抑癌基因p27[17]、p53[18]、p16[12,19]等在肝癌、前列腺癌、子宮癌等組織中表達較正常組織明顯降低。本研究檢測了人Rb細(xì)胞株HXO-RB44抑癌基因Rb1和p16的表達，結(jié)果顯示HXO-RB44中抑癌基因Rb1和p16均呈現(xiàn)出下調(diào)趨勢，說明HXO-RB44中抑癌基因的表達受到抑制，導(dǎo)致其蛋白質(zhì)對癌基因的抑制作用減弱，部分癌基因活化。在本研究中，HXO-RB44細(xì)胞系經(jīng)80μmol/LCHA作用5d后，抑癌基因Rb1和p16基因的表達較正常培養(yǎng)組均明顯升高，提示CHA發(fā)揮其抑制人Rb細(xì)細(xì)胞株增殖的作用可能與抑癌基因表達上調(diào)相關(guān)。

細(xì)胞周期的2個階段最為重要：G1到S和G2到M，分別稱之主G1/S和G2/M關(guān)卡；這兩個關(guān)卡處在復(fù)雜活躍的分子水平變化的時期，容易受環(huán)境條件的影響。其中CyclinD2、CDK4是重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，當(dāng)CDK4與CyclinD2結(jié)合后，CDK4被激活而促進細(xì)胞周期順利通過G1/S和G2/M期關(guān)卡，縮短細(xì)胞周期時間，促進細(xì)胞增殖。CyclinD2和CDK4的表達均上調(diào)，且其幅度與腫瘤的生長增殖的速度呈正相關(guān)[20]。本研究應(yīng)用Westernblot檢測結(jié)果顯示HXO-RB44細(xì)胞CyclinD2和CDK4均呈高表達，說明HXO-RB44具有快速通過細(xì)胞周期的關(guān)卡的趨勢而縮短細(xì)胞增殖周期，使細(xì)胞呈現(xiàn)出惡性變的傾向；應(yīng)用80μmol/LCHA處理HXO-RB44細(xì)胞5d后，二者均較正常培養(yǎng)的HXO-RB44有明顯下降。說明一定濃度的CHA(80μmol/L)能顯著下調(diào)細(xì)胞周期蛋白的表達，從而抑制HXO-RB44細(xì)胞快速的通過G1/S期細(xì)胞關(guān)卡，達到抑制HXO-RB44細(xì)胞增殖的作用。

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(編輯國榮)

InhibitoryeffectofchlorogenicacidonthegrowthofretinoblastomacelllineHXO-Rb44

ZHAOJing-bin1,2,HEXi-wei3,YAOSu-yan4,LIUJian-sheng1,ZHENGDe-yu1

(1.DepartmentofAnatomy,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121001;2.FushunOculopathyHospital,Fushun113008; 3.DepartmentofOphthalmology,LiaoheOilFieldGeneralHospital,Panjin124010; 4.DepartmentofPathophysiology,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121001,China)

ObjectiveToexplorethefunctionandmechanismofchlorogenicacid(CHA)onhumanretinoblastomacelllineHXO-RB44culturedin vitro.MethodsTheopticconcentrationofCHAwhichinhibitedthe6thgenerationsubculturedHXO-RB44wasdeterminedbyCCK8inhibitionexperimentin vitro.Theexpressionsofanti-oncogeneRb1andP16,CyclinD2andCDK4weredeterminedbyWesternblot.Theconcentrationoflactatedehydrogenase(LDH)wasdetectedbyenzyme-linked-immunosorbentserologicassay(ELISA).ResultsTheoptimalconcentrationofCHAforinhibitingHXO-RB44celllinewas80μmol/LdeterminedbyCCK8inhibitionexperiment.Theanti-oncogenesRb1andP16wereexpressedinalowquantityafterHXO-RB44wastreatedwith80μmol/LofCHAfor5days.However,therewashardlyRb1orP16expressioninthepositivegroup(HT1080)andthenormalculturedHXO-RB44 (chlorogenicacidconcentrationof0μmol/L)determinedbyWesternblotmethods.TheexpressionsofCyclinD2andcyclindependencekinase4 (CDK4)werelowerafterHXO-RB44 < class="emphasis_italic">received

80μmol/LofCHAfor5daysthanthoseintheHT1080celllineandthenormalcultureHXO-RB44 (P<0.01).TheconcentrationofLDHinmediumofHXO-RB44,treatedwith80μmol/LofCHAfor5dayswaslowerthanthatofthenormalculturedHXO-RB44 [(226.75±42.74)U/Lvs. (425.84±31.67)U/L, P<0.01].ConclusionCHAof80μmol/LmayinhibittheproliferationofHXO-RB44celllineviaincreasingtheanti-oncogeneexpressionanddecreasingtheexpressionsofCyclinD2andCDK4aswellastheconcentrationofLDHinmedium.

chlorogenicacid(CHA);humanretinoblastoma;anti-oncogene;CyclinD2;cyclindependencekinase4 (CDK4)

2015-07-18

2016-01-30

遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(No.2013022066，2013022048)，遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目(LT2012016)和一般項目(L2013335).

鄭德宇.E-mail:zdy4673349@163.com

R739.7

A

10.7652/jdyxb201605024

SupportedbytheNaturalScienceFoundationofLiaoningProvince(No.2013022066and2013022048)andCreativeTeamFoundationandCommonFoundationoftheDepartmentofEducationofLiaoningProvince(No.LT2012016and2013335)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160805.0953.006.html(2016-08-05)