腎母細胞瘤中ERCC1、TUBB3、TOP2AmRNA的表達及臨床意義

潘偉康，余　輝，王懷杰，鄭百俊，郭青青，郭正團，高　亞，李　鵬

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院小兒外科，陜西西安　710004；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西西安　710061)

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◇臨床研究◇

腎母細胞瘤中ERCC1、TUBB3、TOP2AmRNA的表達及臨床意義

潘偉康1，余輝1，王懷杰1，鄭百俊1，郭青青2，郭正團1，高亞1，李鵬1

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院小兒外科，陜西西安710004；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西西安710061)

目的探討核苷酸切除修復(fù)交叉互補基因(excisionrepaircrosscomplementation1,ERCC1)、3型β微管蛋白編碼基因(ClassⅢβ-tubulin,TUBB3)和DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱα(TopoisomeraseⅡA,TOP2A)mRNA在小兒腎母細胞瘤組織中的表達及臨床意義。方法收集18例腎母細胞瘤組織標本及14例癌旁組織標本，通過分支-DNA液相芯片法檢測標本中ERCC1、TUBB3、TOP2AmRNA的表達水平，并分析上述基因表達與腎母細胞瘤臨床病理的關(guān)系。結(jié)果腎母細胞瘤組織中ERCC1、TUBB3和TOP2A高表達率分別為44.4%、50.0%和66.7%，均顯著高于癌旁組織的7.1%、7.1%和14.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ERCC1高表達率與腎母細胞瘤臨床分期和病理類型有關(guān)(P<0.05)，TOP2A高表達率與腎母細胞瘤臨床分期相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論小兒腎母細胞瘤組織中ERCC1、TUBB3和TOP2AmRNA表達高于癌旁組織，可能參與腎母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

腎母細胞瘤；ERCC1；TUBB3；TOP2A

腎母細胞瘤也稱為Wilms瘤，是最常見的小兒實體腫瘤之一，其發(fā)病率約為兒童全部腫瘤的6%[1]。通過手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后化療和放療等綜合治療途徑，可使腎母細胞瘤患兒的5年生存率達到87%[2]。但目前腎母細胞瘤的治療仍面臨諸多問題，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制的闡明、多藥耐藥現(xiàn)象的克服、化療毒副作用的降低和治療有效率的提高等。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種成人實體腫瘤中發(fā)現(xiàn)，核苷酸切除修復(fù)交叉互補基因(excisionrepaircross-complementinggroup,ERCC1)、3型β微管蛋白編碼基因(ClassⅢβ-tubulin,TUBB3)和DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱα(topoisomeraseⅡA,TOP2A)mRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、化療藥物的療效密切相關(guān)[3-6]。但有關(guān)ERCC1、TUBB3、TOP2A基因在正常腎臟及小兒腎母細胞瘤中的表達鮮見報道。為此本研究擬通過分支DNA液相芯片技術(shù)，測定腫瘤組織和癌旁組織中ERCC1、TUBB3和TOP2AmRNA的表達，并分析ERCC1、TUBB3和TOP2AmRNA表達水平與腎母細胞瘤病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，為探索小兒腎母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展機制及個體化綜合治療方案的選擇和精準藥物療效預(yù)測提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1臨床資料收集西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院小兒外科2014年1月～2015年11月經(jīng)影像學(xué)檢查、實驗室檢查及手術(shù)后病理證實的腎母細胞瘤組織標本18例。男性13例，女性5例；年齡0.5～8歲，中位年齡2.3歲。所有病例均為初治病例，均未接受放化療。同期取距離腫瘤組織2cm處癌旁組織18例(4例樣本不合格，未入組)作為對照組。

1.2方法1.2.1樣本制備腫瘤組織及癌旁組織用100mL/L甲醛溶液固定16～24h，乙醇洗滌。

1.2.2檢測方法采用分支DNA液相芯片技術(shù)，同時檢測樣本中ERCC1、TUBB3、TOP2AmRNA表達，由廣州益善醫(yī)學(xué)檢驗所檢測。與PCR方法相比，該技術(shù)不需要進行RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄。具體操作步驟為：①56 ℃用裂解液裂解樣本2h；②加入緩沖液、探針-微球和支持延伸探針，55 ℃震蕩孵育過夜；③次日將孵育板置于磁力架靜置1min，去上清液；④洗滌液震蕩洗滌1min，于磁力架上靜置1min，去上清液，重復(fù)3次；⑤加入擴增延伸探針和標記探針，50 ℃下震蕩反應(yīng)1h；⑥磁力架上靜置1min，去上清液，洗滌2次；⑦加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，50 ℃震蕩30min；⑧靜置于磁力架上1min，去上清液，重復(fù)洗滌2次。⑨加洗滌液震蕩洗滌5min，Luminex閱讀儀讀取中位熒光值(MFI)，經(jīng)廣州益善醫(yī)學(xué)檢驗所相關(guān)數(shù)據(jù)分析軟件分析，得到最終結(jié)果。

1.3結(jié)果判定ERCC1、TUBB3、TOP2AmRNA表達水平以百分率表示?！?5%為高表達，60%～75%為中偏高表達，40%～60%為中表達，40%～25%為中偏低表達，小于25%為低表達。mRNA表達水平可以反映藥物療效。將ERCC1和TUBB3高表達、中偏高表達記為高表達組，中表達、中偏低表達和低表達記為中低表達組。將TOP2A高表達、中偏高表達和中表達記為高表達組，將中偏低表達和低表達記為中低表達組。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件完成，采用Fisher確切概率法檢驗進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1一般結(jié)果分析18例入組患兒中，8例患兒術(shù)前出現(xiàn)肉眼血尿，4例患兒術(shù)中發(fā)現(xiàn)腎靜脈或下腔靜脈中有瘤栓，腫瘤質(zhì)量約220～870g。無合并其他系統(tǒng)畸形及綜合征。左側(cè)8例，右側(cè)10例，均為單側(cè)腎母細胞瘤。病理類型包括預(yù)后良好(FH)型10例(圖1A)，預(yù)后不良(UH)型8例(圖1B)。按照SIOP分期系統(tǒng)，Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期7例，Ⅴ期0例。

圖1預(yù)后良好型(A)及預(yù)后不良型(B)腎母細胞瘤HE染色

Fig.1HEstainingofnephroblastomawithFH(A)andnephroblastomawithUH(B) (×200)

2.2ERCC1、TUBB3、TOP2AmRNA在腫瘤組織和癌旁組織中的表達在腫瘤組織及癌旁組織中，ERCC1、TUBB3、TOP2AmRNA表達結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：腎母細胞瘤組織中ERCC1高表達率為44.4%，明顯高于癌旁組織7.1%(P<0.05)。TUBB3在腫瘤組織中高表達率為50%，在癌旁組織中高表達率為7.1%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TOP2A在腫瘤組織中高表達率(66.7%)明顯高于癌旁組織(14.3%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3ERCC1、TUBB3、TOP2AmRNA表達與腎母細胞瘤臨床病理的關(guān)系在Ⅲ/Ⅳ期患兒中，ERCC1mRNA高表達率為85.7%，顯著高于Ⅰ/Ⅱ期的18.2%(P<0.05)。UH型高表達率為87.5%，高于FH型的10%(P<0.05)。表明ERCC1mRNA高表達率與臨床分期和組織類型有關(guān)，但是與性別、年齡無關(guān)(P>0.05，表2)。

TUBB3mRNA高表達率與性別、年齡、臨床分期和組織類型均無關(guān)(P>0.05，表2)。

晚期(Ⅲ/Ⅳ)患兒TOP2AmRNA高表達率為100%，明顯高于早期(Ⅰ/Ⅱ)患兒的45.5%(P<0.05)，表明TOP2AmRNA高表達率與臨床分期相關(guān)，但與性別、年齡、組織類型無關(guān)(P>0.05，表2)。

表1ERCC1、TUBB3、TOP2AmRNA在腫瘤組織和癌旁組織的表達

Tab.1TheexpressionsofERCC1,TUBB3andTOP2AmRNAinnephroblastomaandperitumoraltissues

[n (%)]

表2ERCC1、TUBB3、TOP2AmRNA表達與腎母細胞瘤臨床病理的關(guān)系

Tab.2RelationshipofERCC1,TUBB3,andTOP2AmRNAexpressionswithclinicopathologicparametersofnephroblastoma

臨床病理參數(shù)nERCC1高表達中低表達PTUBB3高表達中低表達PTOP2A高表達中低表達P性別 男13490.118761.000850.615 女5412341年齡 ≥2.311380.154651.000741.000 <2.37523452臨床分期 Ⅰ+Ⅱ11290.013470.335560.038 Ⅲ+Ⅳ7615270組織類型 FH10190.003460.637731.000 UH8715353

3　討　　論

隨著手術(shù)、化療、放療等綜合治療手段的應(yīng)用，小兒腎母細胞瘤的生存率得到了顯著改善。目前，國際上傾向在保證療效的情況下，降低治療強度，減少毒副作用，改善患兒的生存質(zhì)量[7]。因此，需要深入評估患兒的個體差異，選擇合適的個體化治療方案和劑量，克服多藥耐藥現(xiàn)象，提高治療有效率并降低毒性反應(yīng)，實現(xiàn)精準治療的目標。腎母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展和多藥耐藥是多種基因在多個不同階段共同作用的結(jié)果。因此，對腫瘤組織進行多種基因并行檢測，不僅有助于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制，還可以預(yù)測化療藥物的療效，從而針對性地選擇治療方案。

ERCC1屬于核苷酸外切修復(fù)家族成員，其表達量直接影響DNA的修復(fù)[8]。ERCC1的異常表達與結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3,9-10]。另外，由于鉑類藥物主要是通過引起腫瘤細胞內(nèi)DNA的交聯(lián)，阻礙DNA的合成與復(fù)制，從而抑制腫瘤細胞的生長。因此，ERCC1表達與鉑類藥物的療效密切相關(guān)，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NationalComprehensiveCancerNetwork,NCCN)臨床實踐指南建議患者在接受鉑類藥物化療前進行ERCC1基因表達檢測[11]。在多種腫瘤中，ERCC1低表達的患者與高表達患者相比，更能夠從含鉑類藥物的治療方案中獲益[4,12]。TUBB3基因編碼的β-tubulin-Ⅲ蛋白是微管蛋白的重要組成部分。微管蛋白在維持細胞形態(tài)、調(diào)控細胞有絲分裂中起重要作用。有研究表明，TUBB3基因異常表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展和抗微管類藥物密切相關(guān)[5]。KOH等[13]用免疫組化方法檢測發(fā)現(xiàn)，在肺鱗癌中TUBB3陽性率高于其他病理類型，且TUBB3陽性表達與5年無病生存率和總生存時間有關(guān)。TUBB3低表達的患者對長春堿類藥物的敏感性更好[14]。TOP2A基因通過編碼DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程，增強腫瘤細胞的增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)，TOP2A高表達的患者對依托伯苷和蒽環(huán)類藥物較敏感，而低表達患者對上述兩類藥物表現(xiàn)出耐藥性[6,15]。

目前，基因表達檢測通常使用定量PCR法。定量PCR法是敏感度高的mRNA檢測方法，但該方法需要進行RNA抽提、純化、逆轉(zhuǎn)錄和目標片段擴增等多個步驟，易產(chǎn)生積累誤差，且定量PCR方法每次檢測的基因數(shù)目有限，無法實現(xiàn)多基因的并行檢測。為此本研究采用分支-DNA液相芯片法，在樣本裂解后直接進行檢測，省略了RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄及目標片段擴增等步驟，大大降低多步驟操作的積累誤差，同時能最大程度保證檢測結(jié)果的準確性和可重復(fù)性。并且可同步實現(xiàn)多個基因的mRNA水平檢測，尤其適用于甲醛固定石蠟包埋(FFPE)樣本的多基因并行檢測[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，腎母細胞瘤組織中ERCC1高表達率明顯高于癌旁組織，ERCC1高表達率與腎母細胞瘤臨床分期和病理組織類型有關(guān)，較晚臨床分期和預(yù)后不良的患兒ERCC1更趨向于高表達。表明腎母細胞瘤組織中存在大量的DNA損傷，引起DNA修復(fù)基因的表達增加。提示腫瘤惡性程度越高，其DNA損傷積累越多，基因組越不穩(wěn)定。TUBB3mRNA在癌旁組織中存在表達，提示TUBB3表達對維持正常細胞生理活動起著重要作用。但TUBB3mRNA的高表達率在腫瘤組織和癌旁組織中存在顯著差異，表明其異常表達可能在腎母細胞瘤的發(fā)生中起到了促進作用。TOP2A在腫瘤組織中的高表達率明顯高于癌旁組織，在臨床分期較晚的患兒中，TOP2A的高表達率為100%。表明TOP2A在腫瘤組織中表達增高，并隨著臨床分期的加大，其表達呈現(xiàn)上升的趨勢，提示晚期腎母細胞瘤患兒可能對依托伯苷和蒽環(huán)類藥物更敏感。

綜上所述，ERCC1、TUBB3和TOP2AmRNA的異常表達可能參與腎母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程，檢測ERCC1、TUBB3和TOP2AmRNA的表達水平可能為腎母細胞瘤的臨床分期、惡性程度判斷及化療方案的選擇提供依據(jù)。但因本研究病例偏少及腫瘤發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性，ERCC1、TUBB3和TOP2A在腎母細胞瘤中的作用有待進一步研究與論證。

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(編輯邱芬)

ExpressionandclinicalsignificanceofERCC1,TUBB3andTOP2AmRNAinnephroblastoma

PANWei-kang1,YUHui1,WANGHuai-jie1,ZHENGBai-jun1,GUOQing-qing2,GUOZheng-tuan1,GAOYa1,LIPeng1

(1.DepartmentofPediatricSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004; 2.HealthScienceCenter,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)

ObjectiveToinvestigatetheexpressionandclinicalsignificanceofexcisionrepaircrosscomplementation1(ERCC1),ClassⅢβ-tubulin(TUBB3)andtopoisomeraseⅡA(TOP2A)innephroblastoma.MethodsTheexpressionlevelsofERCC1,TUBB3andTOP2Ain18casesofnephroblastomatissueand14casesofperitumoraltissueweredetectedbybranch-DNAliquidchiptechnology.Therelationshipoftheexpressionsoftheabovegeneswiththeclinicopathologiccharacteristicsofnephroblastomawasanalyzed.ResultsThehighexpressionratesofERCC1,TUBB3andTOP2Ainnephroblastomatissues(44.4%，50.0%, 66.7%)weresignificantlyhigherthanthoseinperitumoraltissues(7.1%, 7.1%and14.3%) (P<0.05).ThehighexpressionofERCC1wascorrelatedwiththeclinicalstageandhistopathologictype(P<0.05).TOP2Awascorrelatedwiththeclinicalstage(P<0.05).ConclusionTheexpressionsofERCC1,TUBB3andTOP2Awerehigherinnephroblastomathaninnormalrenaltissue.HighexpressionsofERCC1,TUBB3andTOP2Amayplayanimportantroleincarcinogenesisandprogressionofnephroblastoma.

nephroblastoma;ERCC1;TUBB3;TOP2A

2016-01-28

2016-05-25

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81172589)

李鵬.E-mail:sienafiat@hotmail.com

R737.11

A

10.7652/jdyxb201605015

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81172589)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.1405.020.html(2016-08-03)