慢病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2治療骨質(zhì)疏松骨折的效果

張　君

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外科，河南新鄉(xiāng)　453000)

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◇基礎(chǔ)研究◇

慢病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2治療骨質(zhì)疏松骨折的效果

張君

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨外科，河南新鄉(xiāng)453000)

目的探討慢病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)治療骨質(zhì)疏松骨折的效果。方法建立30只大鼠骨質(zhì)疏松模型并進(jìn)行分組。模型組和BMP-2治療組(即BMP-2組)進(jìn)一步制作左脛骨中段橫行骨折模型，并于骨折當(dāng)天在骨折局部分別皮下注射對(duì)照病毒和BMP-2質(zhì)粒的慢病毒，而對(duì)照組不作骨折處理，只在相應(yīng)部位皮下注射等體積的PBS。4d后分別處死各組3只大鼠，用Westernblot檢測(cè)骨折局部皮下BMP-2的表達(dá)情況；治療8周后處死其余大鼠，取左脛骨進(jìn)行X線檢查并評(píng)分，測(cè)定骨密度及骨的生物力學(xué)指標(biāo)，觀察骨痂組織學(xué)變化。結(jié)果BMP-2組大鼠骨折處皮下組織BMP-2蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和模型組(P<0.05)。模型組和BMP-2組大鼠脛骨X線評(píng)分與對(duì)照組比較，明顯降低(P<0.05)，但是BMP-2組明顯高于模型組(P<0.05)。模型組和BMP-2組大鼠骨密度明顯低于對(duì)照組，而BMP-2組明顯高于模型組(P<0.05)。模型組和BMP-2組大鼠脛骨3點(diǎn)彎曲參數(shù)(最大載荷、最大應(yīng)力、破壞載荷和破壞應(yīng)力)與對(duì)照組大鼠比較，均明顯下降，而BMP-2組各參數(shù)較模型組明顯升高(P<0.05)。骨痂組織HE染色顯示，模型組大鼠軟骨性骨痂較多，骨小梁較細(xì)，排列稀疏紊亂，而BMP-2組大鼠可見大量軟骨性骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)變，新生形成大量編織骨小梁。結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的BMP-2能促進(jìn)骨形成，促進(jìn)骨折部位愈合，對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折具有很好的治療效果。

慢病毒；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)；骨質(zhì)疏松性骨折；骨密度；彎曲參數(shù)；基因治療；骨生物力學(xué)

骨質(zhì)疏松是一種因骨強(qiáng)度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，容易出現(xiàn)骨折的全身性骨骼系統(tǒng)疾病[1-2]。骨強(qiáng)度主要表現(xiàn)為骨密度和骨質(zhì)量，而老年人患上骨質(zhì)疏松之后，骨密度和骨質(zhì)量均顯著下降，導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降，很容易出現(xiàn)骨折[3]。骨質(zhì)疏松常見的骨折部位主要以脊柱、髖部、橈骨遠(yuǎn)端和肱骨近端。老年患者一旦發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折，極大影響了其身心健康和生活質(zhì)量。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)是一種多功能的生長(zhǎng)因子，對(duì)胚胎骨形成及出生后成骨有重要作用，其中BMP-2是最主要的骨形成調(diào)控因子[4-5]。BMP-2是主要調(diào)節(jié)骨形成的信號(hào)蛋白，具有強(qiáng)大的成骨作用，同時(shí)可促進(jìn)骨骼愈合和修復(fù)，是治療骨質(zhì)疏松性骨折的藥物[6-8]。由于蛋白類藥物在體內(nèi)的半衰期短，藥物生物利用率低，作用于骨折部位的藥物濃度低。因此，尋求一種持久的、能在局部部位高表達(dá)BMP-2的方法是治療骨折的關(guān)鍵[9]。本研究采用慢病毒介導(dǎo)BMP-2，觀察其在因骨質(zhì)疏松發(fā)生骨折部位的表達(dá)變化及其對(duì)骨折治療效果的影響。

1　資料與方法

1.1材料SD大鼠(180～200g)購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物中心；BMP-2抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；GAPDH單克隆抗體購(gòu)自南京諾唯贊生物有限公司；IVISLuminaⅡ活體動(dòng)物成像儀購(gòu)自美國(guó)冷泉港生物科技股份有限公司；LUNAR骨密度儀購(gòu)自美國(guó)通用電氣有限公司；CSS-44100微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)購(gòu)自美國(guó)通用電氣有限公司；切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司。

1.2骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建及分組30只SD大鼠構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型，即建模前12h，大鼠禁食，采用100g/L氯胺酮腹腔注射麻醉。仰臥位固定后，腹部消毒處理，沿著腹部中線切開3cm切口，暴露子宮并結(jié)扎子宮角，切除卵巢后直接縫合。另外15只大鼠僅剝離卵巢周圍脂肪組織，不切除卵巢，為對(duì)照組。術(shù)后均肌肉注射青鏈霉素，40 000U/只，連續(xù)注射3d。

30只骨質(zhì)疏松大鼠模型建立8周后，進(jìn)一步建立大鼠左側(cè)脛骨骨折模型，并隨機(jī)分為模型組和治療組(即BMP-2組)，每組大鼠15只。模型組和BMP-2組大鼠分別于脛骨骨折處注射溶解于PBS溶液中的包裝空載體和BMP-2基因的慢病毒1×108(體積100μL)；對(duì)照組于模型組和BMP-2組相同部位注射等體積(100μL)的PBS溶液。注射8周后對(duì)大鼠脛骨的生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3Westernblot檢測(cè)BMP-2表達(dá)各組大鼠在治療4d后處死3只，取注射部位皮下組織并勻漿提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50g/L脫脂奶粉封閉30min，然后用BMP-2兔多克隆抗體(稀釋比為1∶1 000)以及GAPDH鼠單克隆抗體(稀釋比為1∶5 000)4 ℃包被過夜，次日用PBS洗滌3次，每次5min；然后用羊抗兔和羊抗鼠HRP標(biāo)記的二抗室溫包被1h后，用PBS洗滌3次，每次5min后，加發(fā)光液后進(jìn)行拍照掃描。

1.4X線平片檢查及評(píng)定在治療后8周，取各組大鼠左脛骨，采用小動(dòng)物活體成像儀進(jìn)行X線掃描，并按照下述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定：骨折線清晰，無骨膜反應(yīng)為0分；骨折邊緣部分趨于模糊，骨膜出現(xiàn)輕度反應(yīng)為1分；骨折邊緣模糊，骨膜反應(yīng)淺淡，出現(xiàn)少量骨痂，邊緣不整齊為2分；骨折線邊緣仍然可以看到，但是邊緣接近消失，骨痂量增多，且密度較深為3分；骨折線完全消失，骨痂填滿缺損，并與骨皮質(zhì)密度相同為4分。

1.5骨痂密度及骨生物力學(xué)指標(biāo)測(cè)定處死治療8周后的各組大鼠，無菌條件下剝離脛骨，取脛骨骨痂組織，采用LUNAR骨密度儀測(cè)定左側(cè)脛骨骨痂骨密度，并進(jìn)行分析。

采用CSS-44100微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)測(cè)試左側(cè)脛骨的3點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。將脛骨置于測(cè)試儀上，以脛骨中心為加力點(diǎn)，支座跨距20mm，最大荷載200N，加力至骨折，計(jì)算脛骨內(nèi)徑和外徑，分析最大載荷、最大應(yīng)力、破壞載荷和破壞應(yīng)力。

1.6骨枷組織學(xué)變化取脛骨骨痂組織，PBS洗滌后采用40g/L多聚甲醛固定24h，EDTA脫鈣5周，常規(guī)制作5μm厚石蠟包埋切片，HE染色，并在顯微鏡下觀察骨痂組織學(xué)變化。

2　結(jié)　　果

2.1大鼠注射部位皮下組織BMP-2蛋白的表達(dá)變化BMP-2組大鼠注射病毒部位的組織中BMP-2蛋白的表達(dá)較高。而模型組和對(duì)照組表達(dá)水平相當(dāng)(圖1)。

圖1各組大鼠骨折處皮下組織BMP-2的表達(dá)

Fig.1BMP-2expressioninfracturesubcutaneoustissueofthethreegroups

2.2大鼠X線平片結(jié)果分析X線顯示對(duì)照組大鼠脛骨未見骨折線。而模型組大鼠骨折線較為清晰，骨折部位僅有部分骨痂形成；BMP-2組大鼠脛骨骨折線基本消失，骨痂形成明顯，且骨髓腔逐漸形成。對(duì)照組大鼠X線評(píng)分高于模型組和BMP-2組，而模型組評(píng)分明顯低于BMP-2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2各組大鼠X線片評(píng)分的比較

Fig.2ComparisonofXrayscoreinratsofthethreegroups

2.3三組大鼠骨密度分析與對(duì)照組骨密度(0.154±0.021)比較，模型組大鼠(0.137 ±0.013)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組和模型組比較，BMP-2組(0.183±0.027)大鼠的骨密度顯著性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05，圖3)。

圖3三組大鼠骨密度的比較

Fig.3Comparisonofbonedensityinratsofthethreegroups

2.4各組大鼠脛骨生物力學(xué)分析與對(duì)照組大鼠比較，模型組和BMP-2組大鼠脛骨3點(diǎn)彎曲參數(shù)(最大載荷、最大應(yīng)力、破壞載荷和破壞應(yīng)力)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，BMP-2組大鼠脛骨3點(diǎn)彎曲參數(shù)較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.5模型組和BMP-2組大鼠骨折處骨痂組織組織學(xué)變化模型組大鼠可見軟骨性骨痂較多，骨小梁較細(xì)，排列稀疏紊亂；BMP-2組大鼠可見大量軟骨性骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)變，新生形成大量編織骨小梁(圖4)。

表1三組大鼠脛骨3點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)參數(shù)的比較

Tab.1Comparisonof3pointbendingexperimentparametersinratsofthethreegroups

組別最大載荷(N)最大應(yīng)力(N/mm2)破壞載荷(N)破壞應(yīng)力(N/mm2)對(duì)照組0.10±0.03157.25±20.340.09±0.01129.48±15.54模型組0.04±0.01*110.32±15.32*0.04±0.01*89.33±10.52*治療組0.07±0.02*#135.44±18.22*#0.07±0.01*#110.25±13.69*#

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

圖4模型組和BMP-2組大鼠骨痂組織學(xué)的變化

Fig.4Thehistologicalchangesofcallusinthemodelgroupandthetreatmentgroup(×200)

3　討　　論

骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加而容易骨折為特征的代謝性骨病[10]。全球每年骨質(zhì)疏松發(fā)生骨折的數(shù)量呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)。由于骨質(zhì)疏松骨脆性增加，采用內(nèi)固定治療的臨床難度較大，因此，骨質(zhì)疏松性骨折的治療目前已成為臨床研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)[11]。近年來，發(fā)現(xiàn)了許多能誘導(dǎo)成骨作用的蛋白如BMP對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折的治療可能有一定的治療作用。BMP蛋白是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族成員之一，目前大量研究結(jié)果顯示BMP蛋白能誘導(dǎo)原始間質(zhì)細(xì)胞向成骨和軟骨趨化、增殖和分化，并且能誘導(dǎo)成骨形成[12-13]。但是，這些蛋白通過口服或者注射會(huì)被體內(nèi)的蛋白酶迅速水解，不能長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮其生物學(xué)作用，因此生物利用率太低。BMP-2是目前研究較多的骨形成蛋白之一。

由于傳統(tǒng)給藥治療藥物的生物利用率比較低，研究者普遍將目光轉(zhuǎn)移至BMP-2的基因治療。所謂基因治療是指通過載體使目的基因在病變部位過表達(dá)，進(jìn)而治療疾病的技術(shù)。要實(shí)施基因治療，選擇合適的基因傳輸載體至關(guān)重要。病毒類載體是目前常用的介導(dǎo)外源基因表達(dá)的載體，其主要分為慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和單純性皰疹病毒[14-15]。慢病毒是目前應(yīng)用較廣的病毒類型之一，其具有可感染非分裂期細(xì)胞，容納外源性基因片段大，可持續(xù)性表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)[16]。本研究采用慢病毒介導(dǎo)BMP-2基因表達(dá)治療骨質(zhì)疏松性骨折，并探討了其治療效果。

本研究結(jié)果顯示，采用慢病毒介導(dǎo)的BMP-2基因在大鼠骨折部位組織注射后4d即觀察到BMP-2顯著表達(dá)，說明慢病毒介導(dǎo)的BMP-2能夠在組織中表達(dá)，且能夠在骨折組織局部形成高表達(dá)區(qū)域，有助于藥物發(fā)揮生物學(xué)功能。對(duì)其治療效果進(jìn)行分析顯示，經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的BMP-2治療后能夠促進(jìn)骨折部位的愈合，可能是由于BMP-2蛋白的高表達(dá)促進(jìn)了骨形成，進(jìn)而有助于骨折部位的愈合。此外，與模型組大鼠比較，慢病毒介導(dǎo)的BMP-2治療組的骨痂部位的骨密度水平明顯增加，也反映了BMP-2的過表達(dá)可以促進(jìn)骨形成。對(duì)大鼠骨折的脛骨進(jìn)行生物力學(xué)分析，結(jié)果顯示經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的BMP-2治療后大鼠脛骨的最大載荷、最大應(yīng)力、破壞載荷和破壞應(yīng)力等生物力學(xué)參數(shù)較模型組明顯增加，說明BMP-2過表達(dá)促進(jìn)了骨形成和骨愈合，使骨骼承載壓力的能力增加。并通過骨痂的HE染色得到了進(jìn)一步證實(shí)，模型組大鼠可見軟骨性骨痂較多，骨小梁較細(xì)，排列稀疏紊亂。而經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的BMP-2治療組大鼠可見大量軟骨性骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)變，新生形成大量編織骨小梁。這都說明慢病毒介導(dǎo)的BMP-2的過表達(dá)能夠促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨折部位骨形成，進(jìn)而促進(jìn)大鼠的骨折部位的愈合。

綜上所述，慢病毒介導(dǎo)的BMP-2蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折具有很好的治療效果。但是，本研究采用的慢病毒載體僅適合于進(jìn)行動(dòng)物基礎(chǔ)研究，對(duì)于臨床治療仍然需要尋求更好的蛋白傳輸載體，以避免病毒潛在的危險(xiǎn)。

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(編輯國(guó)榮)

Theeffectoflentivirus-mediatedBMP-2onthetreatmentofosteoporoticfracturesZHANGJun

(DepartmentofBoneSurgery,theFirstAffiliatedHospitalof

XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453000,China)

ObjectiveToinvestigatetheeffectoflentivirus-mediatedbonemorphogeneticprotein(BMP-2)onthetreatmentofosteoporoticfractures.MethodsWedivided30osteoporoticmodelratsintocontrolgroup,modelgroupandtherapygroup.Themodelgroupandtherapygroupwereusedtomakethelefttibialtransversefracturemodel.Inthemodelgroupandthetherapygroup,ratsweretreatedbylocalfracturesubcutaneousinjectionoflentiviruswhichwaspackedwithemptyplasmidandBMP-2plasmid.TheratsinthecontrolgroupwereinjectedwithPBSonly.Thethreegroupsofratsweresacrificedat8weeksafteroperation,theexpressionofBMP-2wasusedtoanalyzebyWesternblot.X-rayscore,bonedensity,bonebiomechanicalindexandbonestructureweremeasured.ResultsLentivirus-mediatedBMP-2genewasexpressedin vivo.Comparedwiththatinthecontrolgroup,theX-rayscoreinthemodelgroupandthetherapygroupwaslower(P<0.05).TheX-rayscorewassignificantlyhigherinthetherapygroupthaninmodelgroup(P<0.05).Thebonemineraldensityinthemodelgroupandthetherapygroupwassignificantlyreducedcomparedwiththatinthecontrolgroup,whilebonemineraldensityinthetherapygroupsignificantlyincreasedcomparedwiththatinthemodelgroup(P<0.05).Comparedwiththecontrolgroup,the3pointbendingparameters(maximumload,maximumstress,failureloadandfailurestress)inthemodelgroupandthetherapygroupsignificantlydecreased,whilethe3pointbendingparametersinthetherapygroupweresignificantlyhigherthanthoseinthemodelgroup(P<0.05).HEstainingshowedthattherewascartilagecallusandthetrabecularbonewasthinandsparseinthemodelgroup,whilealargeamountofcartilagecalluschangedintothebonycallusinthetherapygroup.ConclusionLentivirus-mediatedBMP-2canpromoteboneformationandpromotethehealingoffracturesite,whichhasagoodtherapeuticeffectonosteoporoticfracture.

lentivirus;BMP-2;osteoporosisfracture;bonemineraldensity;genetherapy;bonebiomechanical

2015-12-13

2016-04-25

張君.E-mail:zhangjunwait@sina.com

R318

A

10.7652/jdyxb201605011

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.1131.010.html(2016-08-03)