M型鉀離子通道開放劑對腦梗死再灌注損傷的保護作用

王德龍，石秋艷，孫　原，楊騰騰，許世民，李艷玲

(華北理工大學附屬醫(yī)院神經內科，河北唐山　063000)

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◇基礎研究◇

M型鉀離子通道開放劑對腦梗死再灌注損傷的保護作用

王德龍，石秋艷，孫原，楊騰騰，許世民，李艷玲

(華北理工大學附屬醫(yī)院神經內科，河北唐山063000)

目的探討M型鉀離子通道開放劑對缺血性腦卒中的腦保護作用及其可能機制。方法選取C57BL/6J小鼠60只，采用抽簽法隨機分為假手術組(10只，Sham組)、對照組 (10只，MCAO組)、治療組(40只，RTG組)，按照給藥時間的不同再將RTG組分為RTG 0 h、RTG 1 h、RTG 3 h、RTG 6 h四個亞組，每組10只。采用線栓法制作小鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，于腦缺血2 h后再灌注。RTG組給予瑞替加濱(10.5 mg/kg)，假手術組和缺血再灌注組給予等量生理鹽水。采用TTC染色法檢測腦梗死體積；Longa評分法進行神經功能評分；蘇木素-伊紅(HE)染色觀察海馬神經元的形態(tài)變化；免疫組化法和Western blotting法測定小鼠缺血半影區(qū)半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和細胞膜蛋白CD40L的表達水平。結果假手術組未發(fā)現(xiàn)腦梗死病灶，海馬神經元無明顯改變，Caspase-3陽性細胞數(shù)少見，無CD40L表達。MCAO組和RTG組均可見大腦中動脈供血區(qū)梗死灶，但RTG四個治療組梗死灶均較MCAO組明顯縮小(P<0.05)，RTG 6 h組較RTG 0 h、RTG 1 h、RTG 3 h給藥組小鼠腦梗死體積增大，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。RTG各組較MCAO組神經功能明顯改善。MCAO組海馬區(qū)腦組織腫脹與壞死明顯，RTG各治療組腦水腫和神經元壞死病理損害明顯較輕。RTG組Caspase-3陽性細胞數(shù)較MCAO組明顯減少(P<0.05)，0、1、3 h治療組最為顯著。RTG 0 h、RTG 1 h及RTG 3 h組梗死周圍區(qū)CD40L含量均較MCAO組明顯下降(P<0.05)，RTG 6 h 下降不明顯(P>0.05)。結論M型鉀離子通道開放劑瑞替加濱對缺血性腦卒中具有腦保護作用，其機制可能是降低神經細胞的興奮性，減輕缺血半影區(qū)的炎癥反應，從而抑制細胞凋亡。M型鉀離子通道開放劑的腦保護作用具有時間依賴性，即超過一定的時間窗腦保護作用會減弱。

腦卒中；M型鉀離子通道；缺血再灌注損傷；瑞替加濱；興奮性神經毒性

迄今的研究已闡明，腦卒中缺血再灌注損傷的多種機制，有能量耗竭、興奮性毒性、自由基大量產生、鈣超載、炎癥和凋亡等。其中興奮性毒性是缺血再灌注損傷級聯(lián)反應中非常關鍵的一個環(huán)節(jié)。當局部腦血流量降低后，神經細胞ATP生成障礙，Na+-K+-ATP酶活性降低，神經元興奮性增高，過度釋放興奮性氨基酸(excitatory amino acids, EAA)，引發(fā)神經細胞的損傷。其中谷氨酸是發(fā)揮興奮性神經毒性的主要遞質。EAA受體有3種亞型，其中NMDA受體過度興奮介導的遲發(fā)性神經細胞損傷可能在興奮毒性中起到主導作用[1]。

M型鉀離子通道是一類電壓依賴性的鉀離子電流，其中KCNQ鉀離子通道家族中的KCNQ2和KCNQ3構成了中樞神經系統(tǒng)M型鉀電流的主要成分。當神經細胞M型鉀離子通道開放時，會促使膜電位回到靜息態(tài)而降低神經細胞的興奮性，減少興奮性神經遞質谷氨酸的釋放；相反，抑制M通道的功能，則使神經細胞的興奮性增高。瑞替加濱(RTG)是第一個應用于臨床的M型鉀離子通道開放劑，目前主要用于抗癲癇治療。大量研究表明，ATP依賴的鉀離子通道開放劑能夠通過多種途徑對腦卒中缺血再灌注損傷起到抑制作用[2]，而M型鉀離子通道開放劑是否對缺血性腦卒中也具有相似的治療作用，國內目前還無相關實驗研究。

本實驗通過觀察不同組小鼠腦梗死體積、神經功能評分、海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)，同時測定不同時間點給藥組腦梗死周圍區(qū)炎癥細胞膜蛋白CD40L及凋亡蛋白Caspase-3的表達變化，探討M型鉀離子通道開放劑瑞替加濱對小鼠急性腦梗死缺血再灌注損傷是否具有保護作用及其可能機制，從而為臨床應用M型鉀離子通道開放劑治療缺血性腦卒中提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組本實驗使用相同背景C57BL/6J小鼠60只，4～6月齡，體質量25～30 g，來源于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究動物實驗中心[許可證號：SCXK-(軍)2011-003)，恒溫(26 ℃)]，安靜環(huán)境中飼養(yǎng)。術前5只一籠飼養(yǎng)，用全價顆粒飼料喂養(yǎng)小鼠，自由飲水，室溫(22±2)℃，濕度50%～60%，通風良好，12∶12 h光照/黑暗周期，術前4 h禁食，自由飲水。實驗前采用抽簽法隨機分組：①假手術組(Sham組)10只；②對照組(MCAO組)10只；③治療組(RTG組)40只。按照給藥時間的不同RTG組再分為RTG 0 h組、RTG 1 h組、RTG 3 h組、RTG 6 h組，每組10只小鼠。

1.2制作動物模型小鼠術前禁食4 h，腹腔注射水合氯醛(3.5 mg/kg)進行麻醉。參照Longa法并稍作改良[3]，用6-0硅膠包被的尼龍單絲線制備單絲管腔內右側大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。在缺血120 min后，輕取出尼龍線，并恢復頸總動脈血供。核心體溫維持在36～37 ℃。假手術組動物接受相同的麻醉和手術過程，但不將線栓插至大腦中動脈。

1.3給藥時間和劑量模型建立成功后，治療組通過小鼠尾靜脈在設定的不同時間點給予瑞替加濱(10.5 mg/kg)，假手術組和缺血再灌注組給予等量生理鹽水。

1.4檢測指標及方法

1.4.1腦梗死體積每組4只小鼠用于TTC染色，在給藥24 h后斷頭處死小鼠，迅速取出腦組織，去除嗅球、小腦及低位腦干，-20 ℃冰凍10 min。自前極(anterior pole)連續(xù)切取1 mm厚度腦冠狀切片，置2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride, TTC)(上海精析化工)生理鹽水溶液中37 ℃避光孵育30 min，100 mL/L甲醛中性緩沖液(pH 7.4)固定過夜。微距相機拍攝，Image-pro plus 6.0圖像分析軟件進行圖像分析(美國Media Cybemetics公司),計算并統(tǒng)計腦梗死體積。梗死體積(mm3)=梗死面積(mm2)×厚度(m)。校正梗死體積(mm3)=左半球體積(mm3)-[右半球體積(mm3)-直接測量出的梗死體積(mm3)]。腦梗死體積與全腦體積之比為梗死體積百分比。

1.4.2Zea-Longa評分標準0分：無明顯神經缺損癥狀；1分：提尾垂直時不能伸展左側前肢；2分：行走時向左側繞圈；3分：行走時身體向左側傾倒；4分：不能自行行走，意識喪失。各組10只小鼠均參與神經功能評分。

1.4.3蘇木素-伊紅(HE)染色光學顯微鏡下觀察海馬 CA1區(qū)神經元的形態(tài)學變化。

1.4.4免疫組化SP法檢測caspase-3的表達每組3只小鼠用于免疫組化，給藥后24 h后，斷頸處死小鼠，斷頭取腦, 取缺血半影區(qū)組織，制備石蠟切片，隔6取1用于實驗，每份組織取4個切片。切片常規(guī)脫蠟至水，過氧化物酶溶液阻斷，50 mL/L的山羊血清溫室封閉1 h，微波爐抗原修復，PBS漂洗后滴加兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體(1∶100，Affinity)，4 ℃過夜，滴加羊抗兔多克隆抗體(1∶100，北京中杉金橋生物技術公司)，37 ℃ 1 h，PBS漂洗后DAB顯色。平均每張切片取5個視野，算出每個視野的Caspase-3陽性細胞數(shù)并計算其平均數(shù)。

1.4.5Western blotting檢測缺血半影區(qū)膜蛋白CD40L的含量每組3只小鼠，給藥后24 h斷頸處死小鼠，斷頭取腦，將大腦半球分為損傷側與非損傷側。取缺血半影區(qū)新鮮組織，每只小鼠取2份標本，按照1 mg∶10 L(質量∶體積)加入RIPA蛋白裂解液勻漿組織。冰上靜置90 min，每隔15 min禍旋振蕩10 s；4 ℃，12 000 g離心15 min；分離上清即得總蛋白，-80 ℃保存。用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品中加入6×SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)，煮沸變10 min，冷卻后取適量上樣，以125 g/L SDS-PAGE電泳分離(150 V，90 min)；使用PVDF膜進行蛋白轉印(35 mA，45 min)；PVDF膜用鼠抗鼠CD40L單克隆抗體(1∶1 000，Abcam)標記，4 ℃過夜，TBST漂洗，15 min 3次，被標記的PVDF膜用羊抗鼠的二抗(1∶2 000，Sigma)孵育，室溫45 min，TBST漂洗15 min 3次；ECL發(fā)光液顯色；全自動化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)顯影分析(Bio-Rad, America)。

2　結　　果

2.1腦梗死體積及神經行為評分Sham組未見梗死灶形成；MCAO組及RTG組可見不同程度梗死灶形成(P<0.05)；與MCAO組相比，RTG 0 h、RTG 1 h、RTG 3 h及RTG 6 h組腦梗死體積明顯減小(P<0.05)。RTG 6 h組較0、1、3 h給藥組小鼠腦梗體積增大，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。RTG組在0、1、3、6 h四個時間點的神經功能評分均好于MCAO組(P均<0.05，表1)。

表1各組小鼠腦梗死體積、Longa評分的比較

Tab.1Comparison of cerebral infarction volume and Longa score of mice in each group

±s)

與Sham組相比，△P<0.05；與MCAO組相比，*P<0.05；與RTG6h組相比，#P>0.05。

2.2各組小鼠海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)的變化HE染色顯示，在海馬CA1區(qū)，假手術組神經元排列整齊緊密，胞質透明，細胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰，形態(tài)規(guī)則；而在MCAO組，神經元排列紊亂，神經細胞皺縮、變性，胞核固縮，組織間水腫明顯，呈壞死特征。在RTG組，缺血側海馬區(qū)與MCAO組比較，變性、壞死的神經元減少，形態(tài)改變及組織間水腫減輕(圖1)。

2.3各組小鼠缺血半影區(qū)Caspase-3的表達情況免疫組化結果顯示，Sham組有極少量陽性細胞表達(2.67±0.82)，MCAO組(81.32±9.0)和RTG各時間點給藥組Caspase-3陽性細胞表達明顯增多。但RTG各時間點治療組Caspase-3陽性細胞表達數(shù)均較MCAO組明顯減少(P<0.05)，同時6h給藥組(45.34±6.3)較0h組(31.22±6.9)、1h組(32.34±5.5)及3h組(37.14±6.7)caspase-3陽性細胞增加(圖2)。

2.4各組小鼠缺血半影區(qū)膜蛋白CD40L含量的比較Westernblotting結果顯示，假手術組與MCAO組未損傷側大腦半球均無CD40L的表達；與MCAO組相比，RTG0h組、RTG3h組CD40L的表達明顯增多(P<0.05)，RTG6h組較MCAO組CD40L表達減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3、圖4)。

圖1各組小鼠海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)的變化

Fig.1ThemorphologicalchangesofhippocampalCA1neuronswithHEstaining(HE, ×400)

A：假手術組；B：MCAO組；C：RTG0h組；D：RTG1h組；E：RTG3h組；F：RTG6h組。

圖2各組小鼠缺血半影區(qū)Caspase-3陽性細胞的表達情況

Fig.2Theexpressionofcaspase-3intheischemicpenumbraofmiceineachgroup(Immunohistochemistry, ×400)

A：假手術組；B：MCAO組；C：RTG0h組；D：RTG1h組；E：RTG3h組；F：RTG6h組。

3　討　　論

KCNQ型鉀離子通道是電壓依賴性鉀離子通道家族中的重要成員，目前有5個亞型(KCNQ1-5)，其中KCNQ2和KCNQ3型鉀離子通道是構成中樞神經系統(tǒng)M通道的主要成分。研究發(fā)現(xiàn)，該通道基因突變或功能失調會引起驚厥、癲癇等疾病。目前，M型鉀離子通道已經成為抗癲癇治療的重要靶點。由于癲癇發(fā)作和缺血性腦損傷的平行分子事件，一些學者推測，抗癲癇藥物對缺血性腦卒中是有效的。本實驗結果顯示，M型鉀離子通道開放劑能夠減輕小鼠神經功能損傷、縮小腦梗死面積、抑制缺血半影區(qū)炎癥反應及細胞凋亡，而在缺血再灌后6h前給藥治療效果最為明顯。此外，實驗中RTG的用量僅為10.5mg/kg，而人體最大的承受劑量為20mg/(kg·d)，或許提高RTG的用量可以使小鼠神經元損傷進一步減輕。近年

圖3不同處理組小鼠缺血半影區(qū)CD40L和內參β-肌動蛋白的表達變化

Fig.3ExpressionsofCD40Landβ-actinintheischemicpenumbraofmiceineachgroup

圖4各組CD40L的相對含量(CD40L/β-actin)的比較

Fig.4TherelativeamountofCD40Lineachgroup與模型組(MCAO組)相比，*P<0.05；與MCAO組相比，#P>0.05。

來，隨著缺血再灌注損傷研究的深入，已有越來越多的證據(jù)表明，興奮性神經遞質谷氨酸的大量釋放是缺血再灌注損傷的重要病理改變之一。興奮性神經毒性作用最早由OLNEY發(fā)現(xiàn)并闡述[4]，并逐漸發(fā)展形成興奮性神經毒性學說，其內容是指：興奮性神經遞質—谷氨酸受體的持續(xù)活化而導致神經元損傷、凋亡的過程。在缺血性卒中發(fā)生后，因為腦血流的急劇下降，引起了局部ATP合成障礙，N+-K+-ATP酶失活，使鉀離子大量外流，鈉離子內流，神經元細胞膜去極化。細胞內大量的興奮性神經遞質釋放，尤其以谷氨酸為代表的興奮性氨基酸異常釋放過度激活NMDA受體，引起大量的Ca2+內流，激活一系列依賴于鈣的酶系統(tǒng)，引發(fā)神經細胞的損傷和死亡[5]。同時，細胞內部高濃度鈣離子、鈉離子導致細胞腫脹，并且線粒體內產生大量的活性氧簇，在此過程中所產生的大量的自由基引發(fā)炎癥反應，在缺血區(qū)釋放大量炎癥介質，引發(fā)神經細胞的損傷、壞死[6]。這些病理生理變化主要發(fā)生在缺血再灌注后的早期。同時還有研究表明，抑制性神經遞質γ-氨基丁酸(GABA)能突觸傳遞的中斷或減少可以增加神經細胞的興奮性，從而加重缺血性腦卒中的損傷。而增加GABA受體的活性，可以減少NMDA受體介導的NO的產生[7]。OOI[8]研究顯示，NO能夠通過抑制M型鉀電流，增加神經細胞的興奮性。使大量鉀離子外流，促使膜電位回到靜息態(tài)，降低神經元的興奮性，或者使神經元“沉默”，減少興奮性氨基酸釋放，可能是RTG挽救缺血半影區(qū)神經細胞的主要機制。

同時，有大量研究顯示，因興奮性毒性啟動的炎癥反應在缺血再灌注損傷的病理進程中發(fā)揮著重要作用。而CD40/CD40L是啟動炎癥反應的關鍵分子，T細胞、B細胞、巨噬細胞、內皮細胞、平滑肌細胞都有表達CD40/CD40L的能力。在缺血再灌注損傷中，大量的炎癥介質參與其中，與CD40/CD40L形成一個復雜的網絡，共同推進病理過程的發(fā)展。CD40與CD40L結合即可觸發(fā)炎癥反應，增加如TNF-α、IL-1β等炎癥介質的釋放，而TNF-α、IL-1β也可促進各細胞表達CD40L。這樣一個相互促進的過程使神經細胞持續(xù)損傷，故有學者提出CD40L可作為炎癥反應的標志物[9]。除此之外，CD40L還參與血小板的活化及血栓形成[10-11]。一些臨床研究證實，CD40L的升高水平可獨立預測缺血性腦卒中患者的短暫性腦缺血和輕微腦卒中的復發(fā)[12]。本實驗結果顯示，RTG夠抑制腦梗死缺血半影區(qū)的炎癥反應的激活，減少神經細胞凋亡，而始動因素是RTG抑制了神經元的病態(tài)興奮性。

綜上所述，M型鉀離子通道開放劑對缺血性腦卒中有一定的治療作用，其機制可能是抑制神經元過度的病態(tài)興奮性，減少谷氨酸等興奮性神經遞質的釋放，進而抑制炎癥反應的啟動，減少炎癥介質的釋放，從而減少神經元凋亡。M型鉀離子通道開放劑的治療作用具有一定的時間依賴性，即超過一定的時間窗，腦保護作用會減弱，而具體的治療時間窗以及其是否具有劑量依賴性還需要進一步研究。

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(編輯卓選鵬)

The protective effect and mechanisms of M-type (KCNQ) potassium channel openers on acute cerebral ischemia reperfusion

WANG De-long, SHI Qiu-yan, SUN Yuan,YANG Teng-teng, XU Shi-min, LI Yan-ling

(Department of Neurology, North China University of Science and Technology Affiliated Hospital, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo investigate the effect and possible mechanisms of M-type potassium channel openers on brain damage after middle cerebral artery occlusion (MCAO) in male mice. MethodsWe randomly divided 60 male mice into six groups: sham group (n=10), MCAO group (n=10) and RTG-treatment group (n=40). RTG-treatment group was further divided into RTG 0 h group, RTG 1 h group, RTG 3 h group and RTG 6 h group, with 10 in each, according to different time of drug administration. The temporary MCAO reperfusion model was constructed by the suture method, reperfusion 2 h after cerebral ischemia. In RTG-treatment groups, a single dose of 10.5 mg/kg RTG was injected at various designated time points (0 hour, 1 hour, 3 hour and 6 hour after reperfusion). The sham-operation group and MCAO group received the same volume of saline. Infarct size was measured by TTC staining, the neurological function was scored with Longa 5-point scale, HE staining was used to observe the morphological changes of hippocampal neurons. In the ischemic penumbra, the expression levels of caspase-3 and the membrane protein of CD40L were detected by immunohisto-chemistry and Western blotting. ResultsIn the sham-operation group, brain tissue had no obvious change, no infarction was observed, caspase-3(+) cells were hardly found and there was no CD40L expression. However, the infarction volume and neurological outcome scores in RTG-treatment group were lower than those in MCAO group (P<0.05). HE staining showed that hippocampal neurons were obviously swollen and necrotic in MCAO group. The pathological damages such as brain edema and neuron necrosis were ameliorated significantly in RTG-treatment group. A lot of caspase-3(+) cells and CD40L were found in the MCAO group and the RTG-treatment group. Compared with those in MCAO group, the expressions of caspase-3 and CD40L decreased significantly in RTG-treatment group (P<0.05), especially at 0 hour, 1 hour and 3 hour, but CD40L expression was not significant at 6 h after stroke. ConclusionM-type potassium channel RTG had a protective effect on cerebral ischemic reperfusion injury and the mechanisms of action were related to reducing cell excitability and inflammation, thereby inhibiting cell apoptosis. The protection was less effective when the M-channel openers were used outside a defined critical period of time.

stroke; M-type potassium channel; ischemic reperfusion injury; retigabine (RTG); excitotoxicity

2015-11-29

2016-04-25

石秋艷. E-mail: qiuyanshi@163.com

R743

A

10.7652/jdyxb201605005

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.0859.002.html(2016-08-03)