基底細(xì)胞樣乳腺癌老年患者Ki-67表達(dá)與TopoⅡα、C-MYC基因的相關(guān)性

李春燕　李春旭　楊　帆

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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基底細(xì)胞樣乳腺癌老年患者Ki-67表達(dá)與TopoⅡα、C-MYC基因的相關(guān)性

李春燕李春旭1楊帆

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心，黑龍江齊齊哈爾161006)

目的探討基底細(xì)胞樣乳腺癌(BLBC)和非BLBC(NBLBC)癌組織中TopoⅡα、C-MYC基因擴(kuò)增與Ki-67表達(dá)的關(guān)系。方法該院臨床病理診斷中心經(jīng)石蠟包埋的乳腺癌組織，其中100例BLBC癌組織、100例NBLBC癌組織，對照組選取100例同期周圍正常乳腺組織。結(jié)果TopoⅡα與C-MYC基因改變類型主要為擴(kuò)增與缺失，TopoⅡα、C-MYC和Ki-67在對照組表達(dá)不顯著。100例BLBC病理組織中，TopoⅡα與C-MYC基因擴(kuò)增分別為43例和51例，缺失分別為57例49例；Ki-67陽性76例，陰性24例；TopoⅡα、C-MYC基因擴(kuò)增與Ki-67表達(dá)在Spearman等級相關(guān)分析中有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。100例NBLBC病理組織中，TopoⅡα與C-MYC基因擴(kuò)增分別為34例和43例，缺失66例和57例；Ki-67陰性16例，陽性84例；Spearman等級相關(guān)分析，TopoⅡα、C-MYC基因擴(kuò)增與Ki-67表達(dá)相關(guān)(P<0.05)，TopoⅡα與C-MYC基因擴(kuò)增呈正相關(guān)(P<0.05)。與NBLBC比較，BLBC的TopoⅡα與C-MYC基因擴(kuò)增略多。結(jié)論TopoⅡα、C-MYC基因擴(kuò)增與Ki-67相關(guān)。與NBLBC比較，BLBC癌組織的TopoⅡα、C-MYC基因擴(kuò)增較多，TopoⅡα與C-MYC基因擴(kuò)增可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

乳腺癌；TOP2A；C-MYC；Ki-67

我國老年女性乳腺癌發(fā)病率最高〔1〕。乳腺癌按cDNA組織芯片基因表型分為基底細(xì)胞樣乳腺癌(BLBC)和非基底細(xì)胞樣乳腺癌(NBLBC)兩類，BLBC約占25%，其特點為強(qiáng)侵襲性和惡性程度高，患者術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致生存質(zhì)量下降、預(yù)后差及病死率增高。本文采用熒光原位雜交方法(FISH)和免疫組化(ICC)檢測BLBC癌組織拓樸異構(gòu)酶(Topo)Ⅱα和細(xì)胞原癌基因(C-MYC)的擴(kuò)增情況及細(xì)胞增殖因子(Ki-67)的表達(dá)，同時探討三者之間的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2010年2月至2014年8月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心經(jīng)石蠟包埋的癌組織，其中100例BLBC癌組織、100例NBLBC癌組織，同時選取100例同期周圍正常乳腺組織作為對照組。所有患者均符合乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，為首次診治的女性，研究開始前告知患者及其監(jiān)護(hù)人本研究的目的及意義，患者在知情同意書上簽字，并嚴(yán)格保守患者個人信息，得到倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行研究。兩組年齡、體重指數(shù)等基本資料無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1　BLBC和NBLBC兩組基本情況比較

1.2儀器和試劑采用杭州朗基科學(xué)儀器有限公司基因擴(kuò)增儀MCC96+；熒光原位雜交和染色體核型分析采用美國IMSTAR全自動熒光原位雜交掃描分析系統(tǒng)Pathfinder FISH；小鼠抗人Ki-67單克隆抗體來自上海微蒙生物科技有限公司；TopoⅡα和C-MYC基因擴(kuò)增檢測(FISH法)采用上海信裕生物技術(shù)有限公司的試劑盒及其相應(yīng)配套試劑。

1.3檢測方法

1.3.1Envision檢測Ki-67在乳腺組織的表達(dá)將乳腺組織石蠟切片脫蠟，高壓鍋內(nèi)放入乙二胺四乙酸(EDTA)修復(fù)液，將切片置入其中修復(fù)3 min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，在3%H2O2溶液中浸泡10 min，再用PBS沖洗，然后加入一抗，4℃靜置10 h后用PBS沖洗，加入二抗，放入恒溫箱中37℃靜置40 min后用PBS沖洗，最后加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，進(jìn)行觀察。

Ki-67在乳腺癌組織的陽性判斷：當(dāng)出現(xiàn)黃色顆粒時Ki-67胞核表達(dá)為陽性，按著色的細(xì)胞染色強(qiáng)度分級：深褐色為3分；棕黃色為2分；淺黃色為1分。陽性細(xì)胞所占百分比分級：陽性細(xì)胞占總細(xì)胞比例>51%為3分；占總細(xì)胞比例26%～50%為2分；占總細(xì)胞比例6%～25%為1分；占總細(xì)胞比例<5%為0分。著色強(qiáng)度+陽性細(xì)胞百分比為Ki-67陽性表達(dá)級別：“”為5～6分；“” 為3～4分；“+”為2分；“-”為0～1分。

1.3.2TopoⅡα和C-MYC基因檢測采用FISH法進(jìn)行檢測，將厚度為4 μm的切片脫蠟后置入甲醇溶液中，浸泡5 min后取出，干燥15 min，放入甲酸混合液(濃度85%)中暗處靜置20 min，4% HCl漂洗5 min，置于含4%HCl 70%～100%系列乙醇溶液梯度脫水，干燥20 min，置于硫氰酸鈉(NaScN)液80℃加熱10 min，4% HCl漂洗。4%HCl 70%～100%系列乙醇溶液脫水，晾干。蛋白酶工作液37℃加熱10 min，4% HCl漂洗10 min，4%HCl 70%～100%系列乙醇溶液脫水，晾干，加固定液3.7%甲醛PBS溶液靜置15 min后，在PBS溶液中漂洗15 min，用超純水漂洗10 min，用中性系列乙醇溶液(濃度為70%～100%)脫水。晾干后加入10 μl探針(TopoⅡα或C-MYC)和蓋玻片，80℃烘干5 min，然后放入37℃恒溫箱中雜交。10 h后取出浸泡在PBS液中，去掉蓋玻片，將恒溫箱調(diào)至42℃，用PanWash洗液孵育，5 min后用PBS液沖洗，中性70%～100%系列乙醇溶液脫水，晾干，甘油明膠封片，熒光顯微鏡下觀察。基因擴(kuò)增陽性判定：通過查找基因雜交信號，分別標(biāo)記17號染色體(綠色)、TopoⅡα基因(紅色)、8號染色體(藍(lán)色)、C-MYC基因(黃色)。在激光共聚焦顯微鏡下隨機(jī)查找30個雙色信號的癌細(xì)胞核。統(tǒng)計Ratio值，即30個細(xì)胞核中紅(黃)/綠(藍(lán))比值，若Ratio(紅/綠)<1.8，表示TopoⅡα無基因擴(kuò)增；Ratio(紅/綠)>2.2時，說明TopoⅡα基因擴(kuò)增。當(dāng)Ratio(黃/藍(lán))<1.8，表示C-MYC無基因擴(kuò)增；當(dāng)Ratio(黃/藍(lán))>2.2，說明樣本中C-MYC基因擴(kuò)增。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件行方差分析、等級相關(guān)分析。

2　結(jié)　果

2.1Ki-67分級與TopoⅡα基因擴(kuò)增的相關(guān)性分析TopoⅡα基因改變以擴(kuò)增與缺失為主，對照組很少有TopoⅡα和Ki-67表達(dá)。BLBC組及NBLBC組中擴(kuò)增分別占43.0%、34.0%，缺失分別占57.0%、66.0%。等級相關(guān)分析(Spearman)顯示，BLBC、NBLBC病理組織TopoⅡα基因擴(kuò)增隨Ki-67分級增高而增加，呈正相關(guān)(r=0.58，0.53；P<0.05)；基因缺失均與Ki-67分級無關(guān)聯(lián)(P>0.05)。兩組比較，BLBC組的TopoⅡα基因擴(kuò)增多于NBLBC組。見表2。

2.2Ki-67分級與C-MYC基因擴(kuò)增的相關(guān)性分析見表3。擴(kuò)增與缺失是C-MYC基因主要改變類型，對照組很少出現(xiàn)C-MYC擴(kuò)增或缺失。BLBC組及NBLBC組中擴(kuò)增分別占51.0%、43.0%、缺失分別占49.0%、57.0%。等級相關(guān)分析(Spearman)顯示，BLBC、NBLBC組C-MYC基因擴(kuò)增與Ki-67呈正相關(guān)，隨分級增加而升高(r=0.56，0.52；P<0.05)；基因缺失均與Ki-67分級無關(guān)聯(lián)(P>0.05)；兩組相比，BLBC組的C-MYC基因擴(kuò)增多于NBLBC組。

表2　Ki-67與TopoⅡα在BLBC、NBLBC基因擴(kuò)增中的相關(guān)性〔n(%)〕

表3　Ki-67與C-MYC在BLBC、NBLBC基因擴(kuò)增中的相關(guān)性〔n(%)〕

2.3BLBC的TopoⅡα基因與C-MYC基因擴(kuò)增相關(guān)性BLBC病理組織基因擴(kuò)增中，TopoⅡα、C-MYC共同擴(kuò)增29例，共同缺失35例，TopoⅡ擴(kuò)增、C-MYC缺失14例，TopoⅡα缺失、C-MYC擴(kuò)增22例。TopoⅡα與C-MYC在BLBC基因擴(kuò)增中有關(guān)(r=0.59，P<0.05)。

2.4NBLBC的TopoⅡα基因與C-MYC基因擴(kuò)增相關(guān)性分析NBLBC病理組織基因擴(kuò)增中，TopoⅡα、C-MYC共同擴(kuò)增23例，共同缺失46例，TopoⅡα擴(kuò)增、C-MYC缺失11例，TopoⅡα缺失、C-MYC擴(kuò)增20例。TopoⅡα與C-MYC在NBLBC基因擴(kuò)增有關(guān)(r=0.61，P<0.05)。

3　討　論

Ki-67僅在增殖細(xì)胞表達(dá)，因此，可作為反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與預(yù)后密切相關(guān)〔2～6〕。本研究表明，TopoⅡα與C-MYC基因水平變化對乳腺癌的靶向治療具有參考價值〔7〕。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶按功能可分TopoⅠ和TopoⅡ，其中TopoⅡ亞單位包括α與β，TopoⅡα與乳腺癌密切相關(guān)，位于17號染色體上，TopoⅡα作為拓?fù)洚愇锩傅木幋a基因，對核酸生理功能具有調(diào)控作用，合成酶和水解酶在細(xì)胞分裂中扮演重要角色，由ATP提供能量，表現(xiàn)為：①DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)改變可以通過偶聯(lián)反應(yīng)途徑催化DNA鏈結(jié)合或斷開；②作用于核酸磷酸價鍵，影響DNA超螺旋和解旋狀態(tài)間的轉(zhuǎn)換，參與DNA復(fù)制與修復(fù)。本次研究中，TopoⅡα基因擴(kuò)增BLBC高于NBLBC，表明癌基因激活機(jī)制包括TopoⅡα基因擴(kuò)增，在臨床同一分期患者中，TopoⅡα基因擴(kuò)增存在差異，從側(cè)面表明乳腺癌轉(zhuǎn)歸不同，表明乳腺癌發(fā)生過程中TopoⅡα基因會擴(kuò)增〔8〕。但有學(xué)者認(rèn)為，乳腺癌的病理改變與TopoⅡα基因擴(kuò)增并沒有顯著的相關(guān)性，其敏感性高低不能作為蒽環(huán)類化療藥物標(biāo)志物〔9〕。筆者認(rèn)為，檢測方法是導(dǎo)致差異的主要因素，需要采用不同檢測方法并增加樣本量來進(jìn)行驗證。

C-MYC基因?qū)儆贛YC基因組，人的C-MYC基因在染色體的8q24區(qū)，其組成包括外顯子3個和內(nèi)含子2個，其中第1外顯子只能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，無編碼序列，2、3外顯子核蛋白能夠與DNA結(jié)合，進(jìn)行核內(nèi)信息傳遞。C-MYC基因在激活狀態(tài)下可與ras癌基因產(chǎn)生協(xié)同作用，阻礙p15、p21 等因子表達(dá)，促使細(xì)胞增殖速度加快和細(xì)胞分化速度降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、惡性腫瘤形成。研究發(fā)現(xiàn)C-MYC基因在很多腫瘤中均可表達(dá)過度，并且是永生癌基因，尤其在癌變早期和腫瘤啟動呈現(xiàn)異常激活狀態(tài)，可作為早期乳腺癌病變觀察指標(biāo)，其表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展、浸潤侵襲等過程密切相關(guān)。乳腺癌合并C-MYC基因擴(kuò)增后，可能導(dǎo)致乳腺癌化療藥物耐受。有研究顯示，抑制C-MYC水平，阿霉素類藥物治療乳腺癌患者敏感性顯著提高〔2，10〕，C-MYC基因在BLBC中擴(kuò)增高于NBLBC。

綜上所述，TopoⅡα基因與C-MYC基因擴(kuò)增在BLBC與NBLBC中呈正相關(guān)，在靶向治療中，若其中一種基因水平下降，另一種基因也隨之下降。但尚未有文獻(xiàn)報道兩者之間的關(guān)聯(lián)，仍需深入探討。

1Alkam Y,Mitomi H,Nakai K,etal.Protein expression and methylation of DNA repair genes hMLH1,hMSH2,MGMT and BRCA1 and their correlation with clinicopathological parameters and prognosis in basal-like breast cancer〔J〕.Histopathology,2013;63(5):713-25.

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3 Criscitiello C,Disalvatore D,De Laurentiis M,etal.High Ki-67 score is indicative of a greater benefit from adjuvant chemotherapy when added to endocrine therapy in luminal B HER2 negative and node-positive breast cancer 〔J〕.Breast,2014;23(1):69-75.

4Christgen M,Winkens W,Kreipe HH.Determination of proliferation in breast cancer by immunohistochemical detection of Ki-67〔J〕.Pathologe,2014;35(1):54-60.

5Lee SK,Kim SW,Han SA.The protective effect of parity in hormone receptor-positive,Ki-67 expressing breast cancer〔J〕.World J Surg,2014;38(5):1065-9.

6González-Sistal A,Sánchez AB,Del Rio MC,etal.Association between tumor size and immunohistochemical expression of Ki-67,p53 and BCL2 in a node-negative breast cancer population selected from a breast cancer screening program〔J〕.Anticancer Res,2014;34(1):269-73.

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9 Irini T,Paraskevi A,Ioanna G,etal.Preserved Axin expression is associated with an aggressive phenotype in invasive breast carcinomas〔J〕.APMIS,2013;121(9):797-805.

10Nair R,Roden DL,Teo WS,etal.c-Myc and Her2 cooperate to drive a stem-like phenotype with poor prognosis in breast cancer〔J〕.Oncogene,2014;33(30):3992-4002.

〔2015-12-31修回〕

(編輯袁左鳴)

齊齊哈爾市科技局指令性科研項目

李春旭(1965-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腎臟病、乳腺病及婦產(chǎn)科疾病研究。

李春艷(1976-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事乳腺病理研究。

R737.9

A

1005-9202(2016)16-3988-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.054

1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院