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      膠質瘤干細胞的內皮分化和管腔形成能力

      2016-10-25 04:55:33陳麗麗馬志紅
      中國老年學雜志 2016年16期
      關鍵詞:磁珠管腔膠質瘤

      展 濤 陳麗麗 顏 彬 曹 永 馬志紅 岳 輝

      (牡丹江醫(yī)學院,黑龍江 牡丹江 157011)

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      膠質瘤干細胞的內皮分化和管腔形成能力

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      (牡丹江醫(yī)學院,黑龍江牡丹江157011)

      目的探討膠質瘤干細胞內皮分化和形成管腔的能力。方法以含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)U87人腦膠質母細胞瘤細胞,再用免疫磁珠法結合“懸浮克隆球形成法”分離膠質瘤干細胞,先行形態(tài)學觀察,然后采用免疫熒光方法檢測CD133、Nestin和GFAP表達,鑒定膠質瘤干細胞。將分離所得的膠質瘤干細胞在添加20 μg/ml血管內皮生長因子(VEGF),1 μg/ml FGF和2 μg/ml胰島素樣生長因子(IGF)的10% DMEM培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng),分別取培養(yǎng)3 d和7 d的細胞進行Western印跡檢測內皮特定蛋白的表達。同時將誘導培養(yǎng)7 d的細胞接種于涂有Matrigel的24孔板中,12 h和24 h后于倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。結果免疫磁珠法結合“懸浮克隆球形成法”分離出的膠質瘤細胞團呈現明顯的CD133和Nestin免疫熒光染色,但GFAP未顯示熒光染色;Western印跡檢測發(fā)現被誘導的膠質瘤干細胞隨著時間延長,CD133的表達逐漸減弱直至消失,而CD31和 vWF表達由弱到強;Matrigel 結果顯示被誘導7 d的膠質瘤干細胞明顯形成了完整的管腔。結論膠質瘤干細胞在內皮細胞生長條件下,可以分化為內皮樣細胞并且具有形成管腔的能力。

      膠質瘤干細胞;內皮細胞;血管形成;膠質瘤

      膠質瘤是最常見和死亡率最高的顱腦原發(fā)性惡性腫瘤,占腦腫瘤的大部分,而膠質瘤的發(fā)展及治療與腫瘤中血管形成密切相關〔1〕。近年來又發(fā)現了一種與傳統(tǒng)腫瘤血管生長途徑完全不同的、不依賴內皮細胞的全新血液供應方式,即血管生成擬態(tài)(VM)〔2〕。因此,研究膠質瘤干細胞的內皮分化和形成管腔能力對于開展膠質瘤臨床新療法有著重要的意義。

      1 材料與方法

      1.1腫瘤細胞系及培養(yǎng)選用人U87人腦膠質瘤細胞作為研究對象,細胞系由牡丹江醫(yī)學院病理教研室惠贈。將細胞置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中,用含10%胎牛血清、青霉素100 IU/ml、鏈霉素50 IU/ml的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

      1.2用免疫磁珠方法分離膠質瘤干細胞參照齊玲等〔3〕報道,用免疫磁珠方法分離腦腫瘤干細胞,分離出膠質瘤干細胞,并將其接種到含內皮生長因子(EGF,20 μg/ml),bFGF(20 μg/ml),B27添加劑(1×)的無血清培養(yǎng)基中,平穩(wěn)置入5%CO237℃濕度條件飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后顯微鏡下觀察干細胞球形成情況并采集圖像。

      1.3免疫熒光法鑒定膠質瘤干細胞取培養(yǎng)至第5天的細胞球懸液用移液槍移至離心管中,1 000 r/min,離心5~10 min,用移液槍移除上清液,以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液,之后采用免疫熒光法進行鑒定,實驗中設立空白對照組和陰性對照組(CD133-細胞),熒光顯微鏡下觀察結果并采集圖像。

      1.4膠質瘤干細胞的誘導培養(yǎng)膠質瘤干細胞被培養(yǎng)7 d后分為對照組及誘導組。對照組僅給10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基;誘導組在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中分別添加20 μg/ml血管內皮細胞生長因子(VEGF),1 μg/ml FGF和2 μg/ml胰島素樣生長因子(IGF)。培養(yǎng)期間每2~3 d換液并補充相應生長因子。

      1.5Western印跡檢測被誘導的膠質瘤干細胞內皮標記物的表達取被誘導3 d和7 d的膠質瘤干細胞加入200 μl細胞裂解緩沖液〔100 mmol/L Tris/HCl,100 mmol/L氯化鈉,0.5%脫氧膽酸鈉,1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),1%NP40,0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)和蛋白酶抑制劑〕,提取內皮祖細胞(EPCs)的總蛋白并經 Lowrry法定量;取40 μg蛋白上樣到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠,電泳(100 V,1.5 h),待溴酚藍進入凝膠底部后,把蛋白質再印跡到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用抗CD133、CD31和血管性假血友病因子(vWF)抗體(1∶200)和抗β-actin(1∶500) 抗體孵育,最后加入用堿性磷酸酶(AP)標記的相應二抗,用 o-Dianisidine,tetrazotized 和β-naphthyl acid phosphate 顯色劑顯色后用凝膠成像儀分析圖像。

      1.6被誘導的膠質瘤干細胞體外管腔形成能力的檢測將Matrigel均勻滴涂于24孔板里,送培養(yǎng)箱里凝固30 min;取被誘導7 d的膠質瘤干細胞經胰酶消化制備成單細胞懸液,計數并調節(jié)細胞密度為 6×104個細胞/ml;按 0.5 ml/孔的量接種細胞懸液于Matrigel膠表面,培養(yǎng)24~48 h;顯微鏡觀察管腔樣結構形成情況,拍照,計數。

      1.7統(tǒng)計學方法應用SPSS20.0軟件,組間資料比較采用ANOVA和t檢驗。

      2 結 果

      2.1膠質瘤細胞系免疫磁珠分選前鏡下觀察U87細胞培養(yǎng)1 d后,大部分細胞貼壁,有梭形、星形等多種形態(tài)。培養(yǎng)3~5 d后細胞突起逐漸增多,細胞融合達70%~80%。見圖1。

      圖1 U87細胞培養(yǎng)3 d后鏡下觀察

      2.2免疫磁珠分選后的細胞生長狀況和形態(tài)學觀察U87細胞用CD133+磁珠分選后再用含bFGF+EGF+B27的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液懸浮細胞,結果與未分選而直接進行培養(yǎng)的U87細胞相比,磁珠分選系統(tǒng)分離后的細胞接種后1~2 d內細胞生長比較緩慢,幾無明顯增殖,培養(yǎng)第3天可見一些懸浮細胞形成多個細胞的圓形克?。坏?~7天可見大量懸浮生長的由幾十個到幾百個圓球形細胞組成的細胞球。細胞形態(tài)均一,結合緊密,折光性好。吹打成單細胞懸液,經過傳代培養(yǎng)可形成許多新的細胞球。見圖2。

      2.3免疫熒光鑒定膠質瘤干細胞免疫熒光染色發(fā)現:4 h后貼壁的細胞團呈明顯的CD133和Nestin熒光染色,但GFAP未顯示熒光染色。陰性對照組也未顯示熒光染色。膠質瘤干細胞核用DAPI(藍色)標記。見圖3。

      圖2 免疫磁珠分選結合無血清培養(yǎng)后膠質瘤細胞生長情況

      A:CD133陽性細胞示紅色熒光;B:Nestin陽性細胞示綠色熒光;C:雙重染色陽性的細胞示黃色熒光,即膠質瘤干細胞;D:A、B、C 圖 DAPI 細胞核染色;E:陰性對照組細胞DAPI 細胞核染色;F:陰性對照組細胞PE染色;G:陰性對照組細胞FITC染色;H:GFAP染色未顯示熒光圖3 磁珠分選結合懸浮克隆球培養(yǎng)分離的膠質瘤干細胞CD133、Nestin和GFAP表達(×100)

      2.4誘導培養(yǎng)的膠質瘤干細胞形成管腔的能力接種于Matrigel上的細胞,未誘導的細胞未見明顯細胞條索形成,而被誘導的細胞在12 h后開始往凝膠里爬行生長,呈明顯條索;24 h后這些條索互相開始鏈接,融合成類似圓形、三角形和多邊形的管腔樣結構。見圖4。

      2.5膠質瘤干細胞誘導分化后內皮分化相關蛋白的表達Western印跡研究發(fā)現:當細胞被誘導到第3天時,仍然有CD133表達,CD31和 vWF有微弱表達;但到第7天時,CD133的表達消失,說明被誘導的細胞已經失去干/祖細胞的標記,而CD31和 vWF的表達明顯增強(P<0.05或P<0.01)。見圖5。

      圖4 膠質瘤干細胞在Matrigel上形成管腔情況(×100)

      與對照組(0 d)比較:1)P<0.01;組內與3 d比較:2)P<0.01,3)P<0.05圖5 Western印跡檢測膠質瘤干細胞誘導分化后CD133、CD31和 vWF表達

      3 討 論

      腫瘤內在新生血管時,參與其中的內皮細胞主要來源于:①腫瘤細胞以趨化的方式募集原有血管內皮細胞,通過出芽、運動和遷移進入腫瘤組織當中;②血液循環(huán)中祖細胞(EPC)定位和分化,從而產生新的血管內皮。

      以往研究膠質瘤干細胞在膠質瘤血管生成過程中的作用主要是集中在分析膠質瘤干細胞如何通過分泌促血管形成因子來刺激血管形成,而在本研究中則是分析膠質瘤干細胞能否直接分化為內皮細胞并具有管腔形成的能力。目前分離腫瘤干細胞(TSCs)的主要方法為熒光激活細胞分選術和磁性激活細胞分選術。也有研究者根據干細胞高表達ATP結合盒超家族(ABC)轉運體的特點,通過流式細胞儀從膠質瘤細胞系內分離出側群干細胞(SP細胞),并證實這類細胞具有 TSCs 特性〔4〕。流式細胞技術分選細胞對細胞損傷較大,而且容易受到污染,不易控制。免疫磁珠分選技術利用包被有單克隆抗體的納米級球形磁性微粒特異性地與靶物質相結合,使之具有磁響應性,應用外部建立的磁場,分離出具有活性的靶細胞。本實驗以免疫磁珠分選法,利用膠質瘤干細胞表面具有干細胞特有的表面標志物 CD133 的特點〔5〕,選用 CD133 抗體包被的免疫磁珠,從人膠質母細胞瘤懸液中有效地分離只占腫瘤細胞總數 0.1%~1%的TSCs。進一步利用公認的神經干細胞標記物CD133、Nestin同時陽性表達和神經膠質細胞特異性GFAP陰性表達作為判斷膠質瘤干細胞的標準,結果成功獲得了膠質瘤干細胞,同時也為繼續(xù)研究其能否被誘導成具有內皮標記的細胞和參與管腔形成奠定了基礎。

      干細胞在分子水平,通過細胞-細胞間、細胞-間質及各種分子的相互作用,使一些關鍵基因表達發(fā)生改變,產生特異的蛋白質,從而調整其分化,導致細胞結構與功能等方面發(fā)生變化,造成表型出現變化。在本實驗中,通過其形態(tài)學變化,表明膠質瘤干細胞已經從形態(tài)學接近了內皮細胞。

      本研究顯示,膠質瘤干細胞在內皮條件下培養(yǎng)到第3天時,仍然有CD133的表達,而CD31和 vWF開始有較弱的表達;但到第7天時,CD133的表達消失,說明被誘導的細胞已經失去干/祖細胞的標記,而CD31和 vWF的表達明顯增強。這也說明隨著細胞被誘導時間延長,其內皮特定蛋白的表達也逐漸增加且趨于穩(wěn)定;同時也表明膠質瘤干細胞在內皮環(huán)境下完全可以被誘導成內皮樣的細胞。將經過內皮誘導7 d的膠質瘤干細胞接種于Matrigel上,結果表明,膠質瘤干細胞在內皮培養(yǎng)基中不但可以分化為內皮樣細胞,而且從功能上也具備了形成管腔的能力,據此也可以推斷這種膠質瘤干細胞在體內環(huán)境適宜的情況下也可能通過內皮分化而直接參與腫瘤血管的形成。但是,膠質瘤干細胞在體內如何參與血管形成,膠質瘤干細胞又如何向內皮細胞轉化,轉化過程中涉及了哪些信號轉導通路,這都還有待于進一步研究。

      1楊世強,李蘊潛.CD105與人腦膠質瘤腫瘤血管生成關系的研究進展〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(12):3504-6.

      2Maniotis AJ,Folberg R,Hess A,etal.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro:vasculogenic mimicry 〔J〕.Am J Pathol,1999;155(3):739-52.

      3齊玲,金宏,丁麗娟,等.CD133免疫磁珠分選腦腫瘤干細胞及其生物學特性〔J〕.吉林大學學報(醫(yī)學版),2011;37(3):441-4,572.

      4Kondo T,Setoguchi T,Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cell in the C6 glioma call line〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2004;101(3):781-6.

      5Holland EC.Glioblastoma multiforme:the terminator〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2000;97(12):6242-4.

      〔2015-11-29修回〕

      (編輯袁左鳴)

      黑龍江省教育廳科研項目(No.12541849)

      陳麗麗(1979-),女,主治醫(yī)師,主要從事臨床醫(yī)學研究。

      展?jié)?1981-),男,碩士,講師,主要從事病理學研究。

      R739.4

      A

      1005-9202(2016)16-3910-03;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.018

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