轉(zhuǎn)化生長因子β1對(duì)自體移植肋軟骨增殖及代謝的作用△

丁永清　陳琦

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·基礎(chǔ)研究·

轉(zhuǎn)化生長因子β1對(duì)自體移植肋軟骨增殖及代謝的作用△

丁永清陳琦

目的評(píng)估體內(nèi)環(huán)境下轉(zhuǎn)化生長因子β1 (TGF-β1 )對(duì)自體移植肋軟骨增殖及代謝的作用。方法健康新西蘭白兔18只(1月齡，體重1 kg),隨機(jī)分為空白對(duì)照組、凝膠對(duì)照組、5 ng/mL TGF-β1凝膠組、10 ng/mL TGF-β1凝膠組、手術(shù)對(duì)照組、5 ng/mL TGF-β1溶液組、10 ng/mL TGF-β1溶液組，每組各3只。截取兔右側(cè)第7、8、9根帶軟骨膜肋軟骨共4段，按不同組別處理后移植于背部皮下。移植術(shù)后8周，取出移植或空白對(duì)照的肋軟骨，行大體觀察及軟骨切片蘇木素-伊紅(HE)染色、甲苯胺藍(lán)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨顯微結(jié)構(gòu)變化情況，并檢測(cè)軟骨內(nèi)糖胺多糖(GAG)含量。結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)條件下，10 ng/mL TGF-β1凝膠組軟骨細(xì)胞的增殖最活躍,GAG含量與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但顯著高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論在體內(nèi)環(huán)境下，TGF-β1能有效抑制幼年兔移植后軟骨基質(zhì)的降解,促進(jìn)細(xì)胞增殖及外周基質(zhì)的分泌，能明顯抑制幼年兔移植后軟骨細(xì)胞的凋亡、壞死，抑制軟骨退行性變。10 ng/mL濃度較5 ng/mL濃度作用明顯。TGF-β1與凝膠復(fù)合，可提高其療效，可能與其緩慢釋放、作用持久相關(guān)。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016,16：239-242， 247)

肋軟骨；自體移植；轉(zhuǎn)化生長因子β1；糖胺多糖

自體肋軟骨移植行耳廓再造術(shù)是耳廓缺損修復(fù)的主要方式，移植后肋軟骨支架有遠(yuǎn)期吸收、攣縮可能。轉(zhuǎn)化生長因子β1 (transforming growth factor β1，TGF-β1 )是調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖及代謝的重要生長因子之一。大量離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)它能刺激軟骨細(xì)胞的分裂增殖，增強(qiáng)蛋白多糖(proteoglycan，PG)及Ⅱ型膠原的合成;但TGF-β1對(duì)體內(nèi)自體移植的肋軟骨起何種作用，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究運(yùn)用新西蘭白兔，在體內(nèi)環(huán)境下，局部應(yīng)用不同濃度的TGF-β1于自體移植肋軟骨旁，改善移植軟骨周圍局部條件，采用光學(xué)顯微鏡觀察、生物化學(xué)定量測(cè)試等技術(shù)，探討TGF-β1對(duì)自體移植肋軟骨增殖及代謝的作用。

1　材料與方法

1.1材料普通級(jí)健康新西蘭白兔18只，1月齡，體重1 kg左右，雌雄不限，購自上海市奉賢區(qū)泰日鎮(zhèn)銀根養(yǎng)兔室[許可證號(hào)：SCXK(滬)2010-0029]。TGF-β1(PeproTech公司，美國)；人纖維蛋白原購自上海萊士公司；凝血酶購自浙江杭康藥業(yè)有限公司；組織糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)檢測(cè)試劑盒購自GENMED公司。正置生物顯微鏡(DMR型，LEICA公司，德國)；透射電鏡是PHILIPS CM-120；冷凍離心機(jī)(Heraeus pico 17，Thermo公司)；酶標(biāo)儀(Synergy H1，BioTek公司)。

1.2方法將18只新西蘭白兔隨機(jī)分為空白對(duì)照組(A)、凝膠對(duì)照組(B)、5 ng/mL TGF-β1凝膠組(C)、10 ng/mL TGF-β1凝膠組(D)、手術(shù)對(duì)照組(E)、5 ng/mL TGF-β1溶液組(F)、10 ng/mL TGF-β1溶液組(G)，其中B～G組每組各3只，A組為B組的非實(shí)驗(yàn)側(cè)。

手術(shù)對(duì)照組將自體肋軟骨取出，直接移植于背部皮下。凝膠對(duì)照組為取出后的軟骨以不含TGF-β1的凝膠包被后移植于背部皮下。TGF-β1凝膠組將自體肋軟骨取出后，與不同濃度(5、10 ng/mL)TGF-β1凝膠混合為軟骨-生長因子復(fù)合物后移植于背部皮下；TGF-β1溶液組是先將移植的肋軟骨浸泡于不同濃度(5、10 ng/mL)TGF-β1溶液中，再注射于背部移植處。纖維蛋白原(20 mg/mL)、凝血酶(20 U/mL)各0.25 mL等體積混合，制備成纖維蛋白凝膠，現(xiàn)用現(xiàn)配。

動(dòng)物麻醉(25 mg甲苯噻嗪+2 mL氯胺酮,l mL/kg體重肌內(nèi)注射)成功后，常規(guī)剃毛、消毒、鋪無菌單。截取右側(cè)第7、8、9帶軟骨膜肋軟骨共4段，每段長約1 cm。按不同組別處理后移植于背部皮下，每只兔移植4段肋軟骨。

移植術(shù)后8周，動(dòng)物行空氣針注射處死。取出移植的肋軟骨及左側(cè)空白對(duì)照組正常生理情況下生長的肋軟骨，進(jìn)行檢測(cè)。大體觀察包括：移植軟骨與周圍組織的粘連程度、色澤、透明度、彈性及硬度。石蠟切片用蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin， HE)、甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡下觀察。Leiea Qwin Standard軟件拍照，觀察細(xì)胞排列及細(xì)胞損壞程度。根據(jù)說明書行軟骨GAG測(cè)定(阿爾新藍(lán)法)。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。滿足正態(tài)分布、方差齊性采用方差檢驗(yàn)；不滿足的用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水平α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1移植軟骨大體觀察術(shù)后8周，全部移植軟骨與周圍組織粘連較牢固，不易分離。僅E組有1例移植肋軟骨出現(xiàn)短縮、吸收，其余移植軟骨均未見明顯的吸收、短縮。移植肋軟骨呈乳白色、半透明、彈性好，與空白對(duì)照組軟骨相似。

2.2光學(xué)顯微鏡下HE、甲苯胺藍(lán)染色觀察A組HE切片未見壞死灶, 軟骨細(xì)胞生長活躍(圖1、2)。C組軟骨細(xì)胞增生，軟骨中心部成熟細(xì)胞較少，出現(xiàn)基質(zhì)分離現(xiàn)象(圖5、6)，D組標(biāo)本未見壞死灶，軟骨細(xì)胞增生活躍, 層次增加明顯, 大量幼稚細(xì)胞增生，細(xì)胞間距縮小，甲苯胺藍(lán)染色示胞外基質(zhì)藍(lán)色異染，軟骨邊緣染色較C組深，均勻(圖7、8)。F組HE 切片可見軟骨中心區(qū)灶性壞死,中心區(qū)軟骨細(xì)胞發(fā)生退行性變、空泡變、細(xì)胞排列不齊，出現(xiàn)基質(zhì)分離現(xiàn)象，邊緣部軟骨細(xì)胞及基質(zhì)正常，甲苯胺藍(lán)染色示軟骨中心區(qū)染色較淺(圖11、12)。G組幼稚細(xì)胞相對(duì)較少，成熟軟骨細(xì)胞增加，細(xì)胞排列整齊(圖13、14)。B組(圖3、4)及E組(圖9、10)大部分軟骨中心區(qū)出現(xiàn)軟骨細(xì)胞減少，部分軟骨出現(xiàn)邊緣性壞死。軟骨細(xì)胞變性、數(shù)量減少、排列不規(guī)則，基質(zhì)分離明顯。甲苯胺藍(lán)染色示胞外基質(zhì)藍(lán)色異染，染色欠均勻。

圖1.　A組HE染色(100×)

圖2.　A組甲苯胺藍(lán)染色(100×)

圖3.　B組HE染色(100×)

圖4.　B組甲苯胺藍(lán)染色(100×)

圖5.　C組HE染色(100×)

圖6.　C組甲苯胺藍(lán)染色(100×)

圖7.　D組HE染色(100×)

圖8.　D組甲苯胺藍(lán)染色(100×)

圖9.　E組HE染色(100×)

圖10.　E組甲苯胺藍(lán)染色(100×)

圖11.　F組HE染色(100×)

圖12.　F組甲苯胺藍(lán)染色(100×)

圖13.　G組HE染色(100×)

圖14.　G組甲苯胺藍(lán)染色(100×)

2.3軟骨GAG測(cè)定A組與D組軟骨GAG含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10 ng/mL的TGF-β1凝膠可抑制GAG降解，維持軟骨正常功能。A組與除D組外的其他各組比較，GAG含量均降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D組、C組及B組比較，GAG含量：D組>C組>B組。TGF-β1可抑制軟骨GAG降解，且10 ng/mL作用更明顯。G組、F組分別與E組比較，GAG含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但G組和F組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明TGF-β1可抑制軟骨GAG降解的作用，但溶液形式給藥，濃度效果不明顯。D組與G組比較，說明凝膠給藥方式的TGF-β1作用效果更好。以上詳見表1、2。

表1　各組的軟骨GAG含量(μg/mg)

表2　各組間多重比較的P值

3　討論

無耳及小耳畸形是一類嚴(yán)重影響聽力和外觀的先天畸形，目前報(bào)道我國發(fā)病率約為5.18/10 000[1-2]。及時(shí)行耳廓再造及聽力重建，對(duì)于矯治患者心理疾患，改善日常生活質(zhì)量具有非常重要的意義。

耳廓因其組織結(jié)構(gòu)特殊且解剖形態(tài)復(fù)雜，再造手術(shù)是一項(xiàng)富有挑戰(zhàn)性的工作[3]。耳廓再造術(shù)中支架材料的選擇是決定術(shù)式的關(guān)鍵因素[4-6]。自體肋軟骨因其組織相容性好、無排異反應(yīng)、易存活、易雕刻成形等優(yōu)點(diǎn)，是目前耳廓再造術(shù)最常用的支架材料[7-9];但是移植后的肋軟骨支架存在不明原因的吸收與變形，導(dǎo)致再造耳廓扭曲、攣縮，影響手術(shù)效果[4]。這一直是自體肋軟骨移植行耳廓再造術(shù)待解決的問題之一。

軟骨組織主要由軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)組成。細(xì)胞外基質(zhì)主要包含3種主要成分：PG、膠原(Ⅱ型膠原為主)和水。其中PG占軟骨細(xì)胞外基質(zhì)有機(jī)成分的90%,由核心蛋白和GAG以共價(jià)鍵結(jié)合而成[10]。在正常情況下，PG的合成與分解保持動(dòng)態(tài)平衡，維持軟骨結(jié)構(gòu)與功能完整[11-12]。軟骨自身不含血管及淋巴管， 但由于軟骨基質(zhì)內(nèi)富含水分(約占軟骨基質(zhì)的75%)，營養(yǎng)物質(zhì)易于滲透，其營養(yǎng)主要靠周圍組織液滲透而非血液供應(yīng)。因此移植后軟骨周圍局部生存條件，尤其是周圍營養(yǎng)條件對(duì)其存活、生長有很大影響。有研究[13]表明，自體移植后軟骨基質(zhì)中PG及膠原蛋白會(huì)發(fā)生降解及流失，是由于外部營養(yǎng)條件的限制導(dǎo)致軟骨細(xì)胞移植后不能成活，基質(zhì)合成能力較弱，從而導(dǎo)致軟骨基質(zhì)中GAG含量減少。TGF-β1 是一種多功能細(xì)胞因子，在軟骨的修復(fù)重建過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β1可能通過2種途徑促進(jìn)軟骨缺損的修復(fù)：①發(fā)揮軟骨誘導(dǎo)作用, 促進(jìn)干細(xì)胞分化為軟骨；②促進(jìn)軟骨特異性基質(zhì)的合成, 如Ⅱ型膠原、PG等[10]。有文獻(xiàn)[14]報(bào)道，在臨床動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射TGF-β1，可調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的新陳代謝，修復(fù)軟骨損失，還可改變軟骨的超微結(jié)構(gòu)；體外實(shí)驗(yàn)證明，TGF-β1可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的合成。

本研究根據(jù)光學(xué)顯微鏡下HE、甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同給藥途徑(TGF-β1凝膠、TGF-β1溶液)TGF-β1均可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，保持細(xì)胞活性,維持合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1凝膠組使軟骨細(xì)胞層次增加更明顯, 增殖大量幼稚細(xì)胞，合成基質(zhì)能力更強(qiáng)。不同濃度(5、10 ng/mL)相比較，10 ng/mL TGF-β1凝膠組使軟骨細(xì)胞層次增加最明顯, 增殖大量幼稚細(xì)胞，合成基質(zhì)能力最強(qiáng)。

本研究根據(jù)軟骨GAG定量分析，反映軟骨中PG水平，評(píng)估移植后肋軟骨退變的情況。D組與A組軟骨GAG含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且均高于其他組，差異顯著，表明移植后的肋軟骨GAG含量降低；而D組抑制GAG降解作用顯著，維持GAG含量與正常生理情況下類似。B組與E組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明凝膠自身對(duì)移植后軟骨無抑制或促進(jìn)基質(zhì)合成作用。D組、C組與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均值D組>C組>B組，TGF-β1可抑制軟骨基質(zhì)降解，且10 ng/mL作用更明顯。G組、F組分別與E組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但G組和F組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明TGF-β1可抑制軟骨基質(zhì)降解，但溶液形式給藥，濃度效果差異不明顯。而D組與G組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明凝膠給藥的作用效果更佳。

纖維蛋白凝膠主要由天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分構(gòu)成，抗原性小，免疫排斥反應(yīng)少，對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長、增殖及分化均沒有抑制作用[15-16]，近年來作為支架材料被廣泛應(yīng)用到組織工程學(xué)的研究中[17-18]。 有學(xué)者[16]發(fā)現(xiàn)，采用纖維蛋白原和凝血酶制備凝膠，加入生物活性肽或生長因子，可明顯促進(jìn)組織再生和傷口愈合。這與本研究結(jié)果一致。本研究制備的凝膠是由纖維蛋白原(20 mg/mL)、凝血酶(20 U/mL)各0.25 mL等體積混合而形成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)生物材料，使TGF-β1吸附并與之復(fù)合。通過纖維蛋白凝膠逐漸降解，其中吸附的TGF-β1逐漸被釋放出來，持續(xù)作用于移植肋軟骨，改變周圍局部微環(huán)境，從而更持久地發(fā)揮作用。而TGF-β1溶液效果差，原因可能是其半衰期短，在移植軟骨周圍存在時(shí)間較短，很快降解成為無活性的單體。作用時(shí)間較短，因此不足以滲透到軟骨內(nèi)部持續(xù)發(fā)揮作用，未能引起軟骨細(xì)胞增殖或抑制基質(zhì)的降解。

有文獻(xiàn)[19]提出，纖維蛋白凝膠可保持長期不發(fā)生降解，故若包被軟骨的凝膠過多、過厚，不能及時(shí)降解，影響移植肋軟骨從周圍組織中獲取營養(yǎng)，可能阻礙移植軟骨生長，導(dǎo)致軟骨退行性變。本研究中凝膠對(duì)照組與手術(shù)對(duì)照組在光學(xué)顯微鏡下觀察、GAG定量分析，均沒有明顯差別，說明纖維蛋白凝膠自身對(duì)移植后軟骨無抑制或促進(jìn)基質(zhì)合成作用，且能及時(shí)降解，促使移植后肋軟骨與周圍組織獲得聯(lián)系。

總之，在體內(nèi)環(huán)境下，TGF-β1能有效抑制幼年兔移植后軟骨基質(zhì)的降解，明顯抑制幼年兔移植后軟骨細(xì)胞的凋亡、壞死，促進(jìn)細(xì)胞外周基質(zhì)的分泌，抑制軟骨退行性變。10 ng/mL較5 ng/mL濃度的效果更明顯。TGF-β1與凝膠復(fù)合，可增加其療效，可能與其緩慢釋放、作用持久相關(guān)。

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(本文編輯楊美琴)

Effect of transforming growth factor β1 on the proliferation and metabolism of autografted costal cartilage

DING Yong-qing, CHEN Qi.

Department of Otorhinolaryngology,Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University, Shanghai 200031, China Corresponding author： CHEN Qi, Email: chenqiear@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate the effect of transforming growth factor β1 (TGF-β1) on the proliferation and metabolism of costal cartilage autograftinvivo.MethodsEighteen healthy New Zealand white rabbits(1 month in age and 1 kg in weight) were randomly divided into 6 groups: fibrin glue(FG) control group, 5 ng/mL TGF-β1+FG group, 10 ng/mL TGF-β1+ FG group, surgical control group, 5 ng/mL TGF-β1+normal saline (NS) group, 10 ng/mL TGF-β1+NS group, with 3 rabbits in each group. All the rabbits were anesthetized and sterilized. Two pieces of the right eighth costal cartilage were taken and 2 pieces from the right seventh and ninth costal cartilage. The cartilage tissue was 1 cm in length and combined with the perichondrium. The four pieces of cartilage treated with the above different methods were implanted into the subcutaneous chamber of the rabbit back respectively. After 8 weeks, the autografted and the physiological costal cartilage were removed. The multiplication, degeneration and the cells viability of cartilage cells was observed with hematoxylin and eosin staining and toluidine blue staining. The microstructure of chondrocyte were observed under the optical microscope and glycosaminoglycan (GAG) content were measured.ResultsThe chondrocyte proliferate was most active in the 10 ng/mL TGF-β1 +FG group and the content of GAG was similar to the blank control group (the left costal cartilage of the rabbits) (P>0.05), but significantly higher than other groups (P<0.05).ConclusionsTGF-β1 promotes the proliferation of chondrocytes and maintains their synthesis of specific matrix. TGF-β1 could obviously inhibit the apoptosis and necrosis of chondrocytes. The effect of 10 ng/mL TGF-β1 is superior to the effect of 5 ng/mL TGF-β1. As the carrier of TGF-β1, FG has a certain slow-released effect on TGF-β1 and could delay the degradation of TGF-β1.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol, 2016,16:239-242, 247)

Costal cartilage; Autograft; Transforming growth factor β1; Glycosaminoglycan

上海市衛(wèi)生局局級(jí)科研項(xiàng)目(2010269)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科上海200031

陳琦(chenqiear@hotmail.com)

現(xiàn)在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科張家口075000

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.04.003

2015-06-08)