應用流式細胞分選技術高效純化大鼠視網膜神經節(jié)細胞及其鑒定△

楊伯齊　高鳳娟　吳繼紅

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·基礎研究·

應用流式細胞分選技術高效純化大鼠視網膜神經節(jié)細胞及其鑒定△

楊伯齊高鳳娟吳繼紅

目的探索一種高效、穩(wěn)定的純化視網膜神經節(jié)細胞(RGC)方法。方法結合免疫抗體吸附方法，利用流式細胞儀分離新生大鼠RGC，并采用流式細胞及熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測分選RGC的純度。結果新生SD大鼠視網膜混合細胞為(4.37±0.22)×106個/視網膜，通過流式細胞儀分離出Thy1.1陽性的RGC為 (5.70±0.21)×103個/視網膜；熒光定量PCR及流式細胞分析結果均顯示此方法分離的RGC細胞純度高，可達90.11%，且純度高低可控。結論通過流式細胞分選技術可獲得較高純度的RGC。該方法分選速度快、穩(wěn)定，為深入開展RGC的體外研究，提供了一種理想的、基于流式細胞儀的細胞快速分離純化方法。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：234-238)

視網膜神經節(jié)細胞；細胞純化；流式細胞分選；細胞鑒定

視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)是視網膜內唯一連接腦部并將視網膜信息傳遞到大腦的神經元[1]。許多疾病可造成RGC的損傷和死亡而導致永久性失明，如青光眼、糖尿病視網膜病變、脫髓鞘性疾病、腫瘤、視神經病變、缺血和外傷等[2- 4]。盡管目前大量研究致力于RGC損傷及凋亡的機制，但對于引起RGC進行性凋亡的發(fā)生機制仍不十分清楚[5-6]。為此，國內外研究者以RGC為靶細胞，進行了大量的動物實驗和體外研究[7-8]，研究該細胞的生物學特性及其損傷機制，尋找阻止或延緩RGC凋亡的途徑及方法等。

體外實驗是深入研究RGC損傷和保護的重要且不可或缺手段，可以排除在體環(huán)境下其他細胞、因子等因素對RGC的影響，更加準確地研究RGC的信號通路、基因表達、電生理特性等，因此建立高效、穩(wěn)定的RGC分離純化方法顯得極為重要。RGC位于視網膜內層，占視網膜總細胞數量的不到1%，這也使其分離、純化更加困難[1, 9]。目前分離、純化細胞的方法有多種，常用的有免疫抗體吸附法、免疫磁珠細胞分選、流式細胞分選等[4, 10-11]。

過去許多研究應用免疫抗體吸附法或免疫磁珠細胞分選方法分離RGC，但因視網膜中膠質細胞和RGC結合非常緊密,免疫抗體吸附法操作時間較長、過程也較復雜，純化效率相對低，且純度有一定波動，存在不穩(wěn)定的缺點[12]；而免疫磁珠細胞分選方法成本昂貴、對操作者技術要求較高[13]，不易在短時間內掌握。流式細胞技術是一項新型的生物分析技術，不僅可以對細胞、微生物等進行檢測分析，而且還可以根據顆粒特性進行分選，具有檢測速度快、測量指標多、采集數據量大等特點，已在血液細胞及腫瘤細胞分類中得到很好的應用[14-16]。但針對RGC的流式純化方法國內外鮮見報道。若能建立穩(wěn)定、高效流式分選RGC的方法，必將有助于該領域研究的深入開展。為此我們反復實踐摸索，建立了一種較為完善的流式細胞儀分選RGC的方法。該分選方法操作較簡單且快速穩(wěn)定，可以在短時間內獲得純度高、數量多的RGC，為RGC的體外研究提供了一種理想的基于流式細胞儀的細胞快速分離、純化方法?，F報道如下。

1　材料與方法

1.1視網膜細胞懸液的制備出生1～3 d的SD大鼠，雌雄不限，于體積分數為75%的乙醇中浸泡處死。無菌狀態(tài)下摘除眼球，將眼球置于Earles平衡鹽溶液(Earles balanced salt solution，EBSS)中。在立體顯微鏡(解剖顯微鏡)下依次去除角膜、晶狀體和玻璃體，鈍性分離視網膜神經上皮層，并撕去視網膜血管層，在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中漂洗2次。將視網膜組織置于已配制好的木瓜蛋白酶消化液(5 mg/mL 木瓜蛋白酶, 0.24 mg/mL L-半胱氨酸, 10 U/mL DNase Ⅰ)中，37 ℃消化25～30 min后，加入0.1%卵類黏蛋白溶液(西格瑪奧德里奇)終止消化，200 g 離心10 min，棄上清液。加入7 mL含0.05%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的最低基礎培養(yǎng)液(minimum essential medium，MEM)培養(yǎng)基中重懸細胞。

1.2巨噬細胞的去除將視網膜細胞懸液經孔徑為40 μm的過濾器過濾，倒入預先用抗大鼠巨噬細胞抗體包被的培養(yǎng)皿中，37 ℃，45～60 min后，收集細胞懸液，4 ℃，300 g離心10 min后，棄上清液，PBS洗滌3次。

1.3流式抗體標記細胞計數后用流式緩沖液重懸( 1×107細胞用500 μL緩沖液重懸)。流式緩沖液: PBS，pH =7. 2，加入0. 5% BSA及2 mol 乙二胺四乙酸(EDTA)。加入10 μL Thy1-PE 抗體，同時另一組加入同型IgG-PE抗體作為陰性對照。避光冰上標記15 min，PBS洗滌2次。將細胞重新用100 μL流式緩沖液懸起，細胞過濾器過濾后進行流式細胞分選。

1.4流式細胞儀分選本實驗使用的流式細胞儀為貝克曼MoFlo XDP。流式細胞分選儀調試參數后，限定分選條件，進行分選。首先在FSC/SSC散點圖中設門圈活細胞群, 排除凋亡細胞和碎片。然后在SSC/ FL2散點圖中設置分選門控，分選出Thy1.1+細胞。因為RGC表達Thy1.1的量不同，我們設置了2個分選門，R10 代表低表達Thy1.1組，R21代表高表達Thy1.1組(圖1,R10+R21代表混合組)。 分選后的細胞置于完全培養(yǎng)基中。

圖1.　流式細胞分選參數設置　A為陰性對照組，B為Thy1.1+組。 R10為低表達組，R21為高表達組。X軸：FSC，前向角散射，FL2通道熒光強度；Y軸：SSC，側向角散射

1.5純化RGC的流式鑒定收集純化后的RGC，加入75%冷乙醇固定細胞，室溫，20 min；加入PBS離心洗滌2次；依次加入0.4%Triton X-100透膜、3%BSA封閉非特性位點。離心，加入兔抗大鼠一抗Brn3a(1∶50,Abcam)，4 ℃，60 min；洗滌2次后，加入抗兔FITC-IgG，避光孵育60 min；陰性對照以PBS代替一抗，其余處理步驟同上。將細胞懸液經流式分析：激發(fā)光波長為488 nm，FITC通道。

1.6熒光定量聚合酶鏈反應分析純化后的RGC離心，收集，按照RNA提取試劑盒(Qiagen,德國)及cDNA合成試劑盒(Takara,日本)說明操作。在NCBI Gene 庫中查找大鼠β-actin(內參基因)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP,膠質細胞標志蛋白)、突觸融合蛋白1(syntaxin1，無長突細胞標志蛋白)、Thy1.1及Brn3a(RGC標志蛋白)的基因序列，采用Primer 5.0 軟件設計引物并且由生工生物工程有限公司(上海)合成。按照實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR) 試劑盒(Takara,日本)說明操作。定量PCR 熒光染料采用SYBR green(Roche，Germany)，在ABI 7500(美國應用生物系統(tǒng)公司，加利福尼亞州，美國)完成熱循環(huán)反應。所有樣本每次實驗設3個復孔，靶基因的表達量以2- ΔΔCt方法計算。合成的目的基因及內參基因PCR引物見表1。

表1　合成的目的基因及內參基因PCR引物

1.7統(tǒng)計學處理實驗重復6次，每次應用30～40只SD大鼠，所有數據以均數±標準差表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行分析。組間計量資料數據比較采用t檢驗。P<0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1視網膜混合細胞獲得率平均可分離(4.37±0.22)×106個/視網膜(表2)。視網膜混合細胞懸液經抗巨噬細胞抗體包被的培養(yǎng)皿中孵育(圖2A、2B)后，部分含有抗巨噬細胞抗體的細胞被吸附(圖2C、2D)，剩余視網膜混合細胞懸液約含(3.13±0.45)×106個/視網膜(表2)。

表2　分離、純化RGC過程中細胞數量的定量分析

2.2流式細胞分選結果流式細胞分選儀以PE-Thy1.1作為表面標志陽性(圖1B)，同型PE-IgG作為陰性對照(圖1A),分選目的細胞群為Thy1.1+即為RGC。由于RGC表面Thy1.1的表達量不同，將陽性群分為R10、R21兩個區(qū)域，分別代表Thy1.1低表達群及Thy1.1高表達群。R10+R21區(qū)域平均分離RGC個數為(5.70±0.21)×103個/視網膜，其中R21區(qū)域平均分離RGC個數為(2.90±0.13)×103個/視網膜(表2)。

圖2.　視網膜混合細胞懸液于抗巨噬細胞抗體包被的培養(yǎng)皿中孵育　 A、B分別為50倍和200倍物鏡下視網膜細胞懸液孵育圖片，白色箭頭為未吸附的懸浮細胞，黑色箭頭為吸附細胞；C、D分別為孵育結束后，去除上層視網膜懸液，剩余被吸附細胞的50倍和200倍的物鏡下圖片

2.3RGC純度鑒定因為在細胞分選過程中Thy1.1的結合位點已被占用，為了鑒定分離出來的RGC純度，我們選用另外一個RGC的標志蛋白Brn3a。 經流式細胞儀回鑒定后，結果顯示RGC的純度約為90.11%(圖3)。此外，我們還采用熒光定量PCR分別檢測了RGC的標志蛋白Thy1.1及Brn3a，膠質細胞標志蛋白GFAP， 無長突細胞標志蛋白syntaxin1mRNA的表達量(表3)。如圖4顯示，高表達組Thy1.1含量顯著高于低表達組及混合組(P<0.01)；3組細胞Brn3a的表達同Thy1.1(P<0.05)；3組細胞中均含有syntaxin1mRNA的表達，而GFAP只在低表達組中有表達，高表達組中未檢測到GFAP mRNA的表達。

表3　流式分選的3組RGC mRNA的表達

3　討論

將RGC從視網膜中分離、純化，以便深入研究單一細胞群體的生理和病理過程及其分子機制，是進行眼內多種疾病發(fā)病機制探索的基礎。因此尋求一種簡便易行、高效穩(wěn)定且高純度的RGC分離、純化方法，對深入探討RGC 損傷后的細胞學和分子生物學機制具有十分重要的意義。

目前常用的分選RGC方法為免疫抗體吸附法，但此法耗時較長，過程復雜，且分離的RGC中混雜一定比例的視網膜細胞，可對實驗結果產生一定的干擾[11]。越來越多的研究采用免疫磁珠抗體法分選RGC，此法分選的RGC純度明顯高于前者，但是細胞活性比前者低，且對儀器設備有要求，實驗成本明顯增加。基于流式細胞儀的推廣，近年來越來越多的研究選用流式細胞分選。此方法的原理是，使用偶聯熒光染料的特異性單克隆抗體標記細胞，制備細胞懸液，細胞懸液經過流動的噴嘴時，使鞘液流成為上萬個微滴，微滴以微滴細流的形式通過激光束，此時細胞的熒光和散射光信號被測量，給鞘液流一個充電脈沖信號使待分選的液滴帶上電荷。流式細胞分選儀的檢測分析系統(tǒng)通過分選設門特性迅速判定其是否為分選目的細胞。當帶電荷細胞的鞘液滴流經帶有強大電場的偏轉板時，不同細胞就根據自身所帶的電荷性質產生偏轉而落入各自的容器中，從而實現了細胞的分選[17-18]?，F代高端型流式細胞分選儀每秒可以選數萬個細胞，儀器可選配3～9根激光管，最多可檢測18個熒光參數，從而滿足日益多元化、深入的前沿科學研究需要[19]。

本實驗采用的是貝克曼流式細胞儀，與傳統(tǒng)的流式細胞儀相比較，具有分選效率高、精確度更高、自動化程度高的特點。由于視網膜巨噬細胞也表達Thy1.1抗體[9]，為了增加分選的純度，我們結合免疫抗體吸附方法，先將巨噬細胞去除，再利用流式細胞分選技術分離高純度的RGC。此方法分選RGC所用時間明顯短于免疫抗體吸附及磁珠法，且RGC的純度極高，結果穩(wěn)定性極好，并且可以通過調整儀器參與控制分選RGC的純度，對于易受其他雜細胞影響或干擾極大的實驗，選擇此法分選RGC更佳。然而，在實際使用過程中，分選細胞的生物學活性、回收率、純度等分選指標經常會受到許多干擾因素的影響，最終會導致無法獲取理想的實驗結果。經過反復的摸索探究，我們總結出以下幾點經驗：①視網膜細胞懸液要充分分離為單細胞懸液；②確保流式液流的連續(xù)性和穩(wěn)定性；③儀器使用前校淮；④細胞先富集、再分選；⑤控制分選速度；⑥設門清晰，否則嚴重影響細胞純度。本研究是采用大鼠視網膜細胞進行分離、純化，是否對人或其他動物，如小鼠、兔等同樣可以分選出高純度的RGC，有待進一步探究。

總之，流式細胞分選技術作為一種高效、迅速、穩(wěn)定分選RGC的方法，可以純化出較高純度的RGC，排除其他細胞對研究結果的干擾及影響，為RGC的研究奠定了基礎。

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(本文編輯諸靜英)

Purification of rat retinal ganglion cells by using flow cytometry sorting technology and its identification

YANGBo-qi,GAOFeng-juan,WUJi-hong.

DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,ChinaCorresponding author： WU Ji-hong, Email: jihongwu@fudan.edu.cn

ObjectiveTo establish an efficient and stable method for retinal ganglion cells (RGCs) purification. MethodsRat RGCs were separated by using flow cytometric (FC) technology combined with immunopanning. Then flow cytometry and fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) were performed to analyze the purity of RGCs. Results(4.37±0.22)×106cells per retina and (5.70±0.21)×103Thy 1.1-positive RGCs per retina were separated by using flow cytomety. The results of fluorescence quantitative PCR and flow cytometry showed that the purity of RGCs isolated by this method was as high as 90.11%, and the purity of the isolated cells was controllable. ConclusionsThe study provides a rapid method for sorting rat RGCs based on the flow cytometric technology. The sorting method is stable and efficient, and can be used for further research.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:234-238)

Retinal ganglion cells; Cell purification; Flow cytometric cell sorting; Cell identification

國家自然科學基金(81470624)

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院實驗中心上海市視覺損害與重建重點實驗室衛(wèi)生部近視眼重點實驗室 上海200031

吳繼紅(Email：jihongwu@fudan.edu.cn)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.04.002

2016-05-04)

楊伯齊和高鳳娟為共同第一作者