復(fù)合成骨誘導(dǎo)劑對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

甘升遠(yuǎn)，夏德林，肖 鳴，邵學(xué)壘，吳雙江，張 磊

復(fù)合成骨誘導(dǎo)劑對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

甘升遠(yuǎn)，夏德林，肖 鳴，邵學(xué)壘，吳雙江，張 磊

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科四川 瀘州646000）

目的：探討復(fù)合成骨誘導(dǎo)劑對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Stromal Stem Cells， BMSCs）成骨分化的影響。方法：選取2月齡SD雄性大鼠2只，處死后沖洗股骨，脛骨骨髓腔獲得骨髓組織，采用貼壁培養(yǎng)法純化大鼠BMSCs，并進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。取第三代BMSCs，將細(xì)胞分A～G 7個(gè)組，A組為對(duì)照組：在不含任何誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；B組為常規(guī)誘導(dǎo)組：在僅含有誘導(dǎo)劑（10.0mmol/β-甘油酸鈉，10-8mol/L地塞米松，50mg/L抗壞血酸）的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；C，D，E，F(xiàn)，G組為復(fù)合誘導(dǎo)組，在含有復(fù)合誘導(dǎo)劑（常規(guī)誘導(dǎo)劑+阿侖膦酸鈉）的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，其中阿侖膦酸鈉的濃度分別是10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L。觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)增殖及形態(tài)變化，western-blot法檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）的表達(dá)。結(jié)果：觀察發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞均存活，E組細(xì)胞體積變得肥大，長(zhǎng)出多個(gè)胞漿突起呈多角形，細(xì)胞周圍可見云霧狀分泌物。A組中細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形增殖，形態(tài)未見明顯變化，分泌物最少。各周各組western檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BMP-2表達(dá)量順序均如下：10-8mol/L 組＞10-7mol/L組＞10-9mol/L組＞10-6mol/L組＞10-10mol/L組＞常規(guī)誘導(dǎo)組＞空白對(duì)照組。結(jié)論：阿侖膦酸鈉在低濃度（10-8mol/L）時(shí)對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化具有促進(jìn)作用。

阿侖膦酸鈉；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；大鼠；成骨分化；

隨著組織工程骨的發(fā)展為修復(fù)骨組織缺損提供了新方法，多因素誘導(dǎo)骨組織的發(fā)生，而基因強(qiáng)化的組織工程程序復(fù)雜，實(shí)施困難，因此需尋找復(fù)合成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)骨組織的發(fā)生。雙膦酸鹽可以降低骨組織吸收，形成并維持骨質(zhì)的結(jié)構(gòu)和礦化程度，調(diào)節(jié)骨更新［1］。阿侖膦酸鈉屬于第三代含氮二膦酸鹽，是目前治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥物之一，其主要機(jī)制是抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能［2］。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓基質(zhì)中的一種非造血干細(xì)胞，易于擴(kuò)增且具有多潛能分化能力。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是最先且最早的骨組織工程種子細(xì)胞。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins， BMP）是BMSCs分泌的糖蛋白，可以促進(jìn)骨的生長(zhǎng)。目前BMP蛋白種類較多，其中比較具有代表性的是BMP-2，在BMSCs成骨分化的過程中能夠自分泌BMP-2，因此本實(shí)驗(yàn)評(píng)估BMSCs的成骨分化是利用westernblot檢測(cè)BMP-2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。阿侖膦酸鈉對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化是否具有作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度阿侖膦酸鈉與傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)劑共同作用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，觀察并探討其對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器：2月齡雄性SD大鼠2 只，體重100 g（由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；FBS胎牛血清，L-DMEM低糖培養(yǎng)基（eHylone公司，美國）；0.25% 胰蛋白酶，地塞米松，維生素C，β-甘油磷酸鈉（Sigma 公司，美國）；阿侖膦酸鈉（杭州默沙東制藥有限公司）；青霉素-鏈霉素溶液、Hank’s液（碧云天生物科技有限公司）； Na2HPO3·12H2O、 NaH2PO3·2H2O（上海國藥）；倒置相差顯微鏡XSJ-D型（日本OLYMPUS光學(xué)儀器有限公司）；蛋白電泳儀（創(chuàng)博環(huán)球生物科技有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司）。

1.2BMSCs的采集、分離、培養(yǎng)和鑒定：取2月齡雄性SD大鼠2只，體重100g經(jīng)脫頸處死后，予以75%酒精浸泡消毒10min；無菌操作下分離大鼠股骨、脛骨，去除雙側(cè)干骺端，以含有肝素的DMEM 5ml充分沖洗髓腔3次，沖洗液1 000r/min離心10min。取膜狀的有核細(xì)胞層（BMSCs層即包含在該層中）接種于培養(yǎng)瓶（含DMEM培養(yǎng)液，10%入胎牛血清）中培養(yǎng)，換液去除懸浮細(xì)胞。14d后貼壁細(xì)胞達(dá)約80%融合，即得到原代培養(yǎng)細(xì)胞。以0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，每2d換液一次并在倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs形態(tài)生長(zhǎng)變化。取活力旺盛的細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/L。取細(xì)胞懸液2 000r/min離心10min，棄上清，分別加入抗CD44、CD45，混勻后室溫孵育30min，經(jīng)PBS洗滌離心2次后，加入FITC標(biāo)記的二抗避光反應(yīng)15min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD44、CD45的表達(dá)情況［3-4］。

1.3不同濃度阿倫膦酸鈉的成骨誘導(dǎo)：取融合至80%第3代大鼠BMSCs，以0.25%胰蛋白酶消化離心后重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105/ml，接種于3塊 96孔板中，選取其中91孔分為七組（A～G）接種培養(yǎng)，接種細(xì)胞混懸液100μl。待細(xì)胞貼壁后向B、C、D、E、F、G組加入常規(guī)誘導(dǎo)劑，含有濃度為10-8mol/L地塞米松， 10mmol/L，β-甘油酸鈉，50mg/L抗壞血酸；A組不加入任何誘導(dǎo)劑，再往C、D、E、F、G組中加入不同濃度阿侖膦酸鈉溶液，從C-G組中分別為10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L。將3個(gè)96孔板分別標(biāo)記為1，2，3板。1板培養(yǎng)7d，2板培養(yǎng)14d，3板培養(yǎng)21d。培養(yǎng)期間每2d換液一次。

1.4western-blot檢測(cè)BMP-2的表達(dá)：將每組細(xì)胞收集，加入PBS溶液清洗，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心提取上清液蛋白。每個(gè)樣品槽內(nèi)加入5×SDS上樣緩沖液及等體積蛋白樣品，然后接通電源進(jìn)行電泳。通過電轉(zhuǎn)印法將凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將轉(zhuǎn)印后的膜脫色置于一抗液面上室溫下孵育2h，再次脫色后將膜置于SuperSignal化學(xué)發(fā)光試劑中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)1h。使用Phoretix 1D軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0軟件計(jì)算實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)所有參數(shù)均以xˉ±s表示。采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有顯著性意義。

2　結(jié)果

2.1BMSCs培養(yǎng)結(jié)果：原代培養(yǎng)的細(xì)胞在48～72h后，細(xì)胞貼壁，胞體圓形或多邊形。培養(yǎng)4d后，細(xì)胞體積增大，胞體呈梭形，伴長(zhǎng)突起，胞核大，扁圓形（圖1）。在7d左右，細(xì)胞相互融合，成片生長(zhǎng)。細(xì)胞達(dá)80%貼壁融合時(shí)胰酶消化傳代。傳代后細(xì)胞形態(tài)更均勻，呈長(zhǎng)梭形（圖2）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)的細(xì)胞CD44表達(dá)陽性，而CD45表達(dá)呈陰性（圖3、4），表示培養(yǎng)的細(xì)胞是BMSCs。

2.2BMP-2的表達(dá)：使用Phoretix 1D軟件進(jìn)行灰度值分析各組組中BMP-2均有表達(dá)，在第7天時(shí)各組BMP-2出現(xiàn)表達(dá)量出現(xiàn)明顯差異（圖5）；第14天表達(dá)量差異較第7天更加明顯（圖6）；第21天時(shí)表達(dá)差異達(dá)到最高（圖7）。各周各組western檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BMP-2表達(dá)量順序均如下：10-8mol/L組＞10-7mol/L組＞10-9mol/L組＞10-6mol/L組＞10-10mol/L組＞常規(guī)誘導(dǎo)組＞空白對(duì)照組。常規(guī)誘導(dǎo)劑與其他濃度阿侖膦酸鈉共同作用時(shí)BMP-2表達(dá)量均不及10-8mol/L組。B組單一使用常規(guī)誘導(dǎo)劑其BMP-2表達(dá)量較C、D、E、F、G組最低。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照相比，其表達(dá)存在明顯差異（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Phoretix 1D軟件讀取各條帶灰度值，比值及標(biāo)準(zhǔn)差如表1所示。

圖1　原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（倒置相差顯微鏡下拍攝，×200)

　　圖2 第3代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（倒置相差顯微鏡下拍攝，×200）

圖3　CD44表達(dá)結(jié)果

圖4　CD45表達(dá)結(jié)果

圖5　第7天Western-blot圖

圖7　第21天Western-blot圖

表1　各組第7、14、21天Western-blot檢測(cè)BMP-2的蛋白表達(dá)

3　討論

BMSCs是骨髓基質(zhì)中的多能干細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)可以成骨，成纖維，成軟骨，成脂肪，成肌肉等細(xì)胞方向分化［5］。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中加入成骨誘導(dǎo)劑可以明顯誘導(dǎo)其成骨分化［6］。誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化需要特定的外界環(huán)境，經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑（地塞米松，甘油酸鈉，維生素C）作用溫和，成本較低，能增強(qiáng)堿性磷酸酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生骨鈣素，從而誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞向分化。由于經(jīng)典的成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)效率較低不能滿足臨床構(gòu)建大塊組織工程骨的需要［7-8］。如何提高BMSCs成骨分化的能力，滿足構(gòu)建大塊骨組織工程骨解決臨床治療所需，是目前骨組織工程研究的難點(diǎn)之一。

雙膦酸鹽作為治療骨質(zhì)疏松的首選藥物，減少骨吸收改建治療骨質(zhì)疏松癥。阿侖膦酸鈉第三代雙膦酸鹽典型代表，能抑制破骨細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)使其發(fā)生程序性細(xì)胞凋亡，同時(shí)還能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和成熟，從而抑制骨的吸收，維持骨質(zhì)密度。如Mathov阿侖膦酸鹽誘導(dǎo)了大鼠顱蓋骨源性成骨細(xì)胞的增殖［9］促進(jìn)人松質(zhì)骨成骨細(xì)胞數(shù)的增加，增強(qiáng)堿性磷酸酶（alkaline phosphataseALP）活性及BMP-2、I型膠原和骨鈣素的表達(dá)。Fu LJ等研究表明阿侖膦酸鈉不僅可誘導(dǎo)BMSCs成骨向分化還抑制BMSCs的成脂向分化［10］。董群偉等［11］研究不同濃度阿侖膦酸鈉對(duì)BMSCs成骨向分化能力的影響，發(fā)現(xiàn)10-8mol/L阿侖膦酸鈉組增殖速度（0.366±0.012）明顯大于對(duì)照組（0.184±0.031）。因此，一定濃度的阿侖膦酸鈉可作為一種成骨誘導(dǎo)劑來促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的阿侖膦酸鈉與成骨誘導(dǎo)劑（10-8mol/L地塞米松，10.0mmol/β-甘油酸鈉，50mg/L維生素C）混合后加入培養(yǎng)基共同培養(yǎng)BMSCs，與單一的經(jīng)典誘導(dǎo)劑進(jìn)行比較，并觀察阿侖膦酸鈉誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的作用。采用貼壁法結(jié)合密度梯度離心法分離培養(yǎng)BMSCs，經(jīng)檢測(cè)細(xì)胞CD44、CD45的表達(dá)，成功分離純化傳代BMSCs，同時(shí)不影響細(xì)胞的干細(xì)胞特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：第7天時(shí)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)所有組中BMP-2均有不同程度的表達(dá)，在第14天表達(dá)量的差異明顯；21d時(shí)差異達(dá)到最高。10-8mol/LALN+常規(guī)誘導(dǎo)劑共同作用于BMSCs時(shí)BMP-2的表達(dá)水平最高。其他濃度ALN+常規(guī)誘導(dǎo)劑組表達(dá)明顯減弱，但是混合后對(duì)BMSCs的誘導(dǎo)作用也明顯高于空白對(duì)照組的誘導(dǎo)作用。無任何誘導(dǎo)劑組，其表達(dá)劑量最低。表明阿侖膦酸鈉和常規(guī)骨誘導(dǎo)劑能促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率，且阿侖膦酸鈉在10-8mol/L濃度的時(shí)與常規(guī)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)BMSCs成骨轉(zhuǎn)化作用最強(qiáng)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究表明復(fù)合骨誘導(dǎo)劑能促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。通過改良種子細(xì)胞為構(gòu)建大塊骨組織功提供一種新的方法。

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編輯/張惠娟

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本刊編輯部

Experimental study on composite osteogenic inducer promoted rat bone marrow stromal cells to differentiate into osteoblast in vitro

GAN Sheng-yuan， XIA De-lin， XIAO Ming， SHAO Xue-lei，WU Shuang-jiang， ZHANG Lei
（Department of Oral and Maxillofacial Surgery， Affiliated Stomatological Hospital， Southwest Medical University， Luzhou 646000， Sichuan，China）

ObjectiveTo investigate the effect of compound osteogenic inducer on ost-eogenic differentiation of bone marrow stromal cells.MethodsThe BMSCs were isolated by gradient centrifugation with adherent culture from Sprague Dawley rats of two months old. The third generation of bone marrow stromal stem cells with 1×108/L concentration was divided into seven groups with A to G. The group A was blank group， which cultured in L-DMEM with 10% FBS. The group B was Conventional induction group， which cultured in L-DMEM with 10-8mol/L dexamethasone， 10.0 mmol/l β- glycerin， sodium and 50mg / L ascorbic acid. The group C to G was Compound induced group which cultured the cultured in the same concentration osteoblast-induced fluid the same as group B. Then the group C to G was separately added with 10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/ L ALN. Changes of proliferation and morphology of cells were observed under inverted microscope. The expression of the BMP-2 was tested by western-blot. The test was used for statistical analysis.ResultsThe cells of every group were survived and live well. The cells become hypertrophy， multi angle， and the high secretory activity in the E group than other groups. The number of cells in the A group change at least， the lowest secreti-on obviously. The order of the result of the expression of BMP-2 was 10-8mol/L group＞10-7mol/L group＞10-9mol/L group＞10-6mol/L group＞10-10mol/L group＞Conventional induction group＞blank group.ConclusionAllen alendronate at low concentration （10-8mol/L） can promote osteogenic differentiation on bone marrow stromal cells.

alendronate； bone marrow stromal cells；rat； osteogenetic differentiation

Q813.1

A

1008-6455（2016）09-0074-04

2016-05-27

2016-08-29

夏德林，男，四川瀘州人，西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科主任，碩士研究生導(dǎo)師，教授，主要從事顱頜面畸形整復(fù)與重建，頜面部腫瘤治療；E-mail：xiadeln@163.com

甘升遠(yuǎn)，男，四川省宜賓市人，西南醫(yī)科大學(xué)口腔頜面外科在讀碩士；E-mail：414737415@qq.com