甘肅黃芪和紅芪中總皂苷含量測定對比研究

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甘肅黃芪和紅芪中總皂苷含量測定對比研究

葉迎包強王瑞海柏冬劉衛(wèi)東彭建平陳永剛田生華劉培元楊麗霞姜良恩劉麗梅

目的建立甘肅不同產(chǎn)地黃芪和紅芪藥材中總皂苷含量測定的方法，比較不同產(chǎn)地黃芪和紅芪總皂苷含量。方法以黃芪甲苷為對照品，采用香草醛-高氯酸顯色法，檢測波長為540 nm，測定甘肅5縣1區(qū)28批黃芪和28批紅芪樣品中總皂苷的含量。結(jié)果黃芪甲苷對照品質(zhì)量在0.0498～0.1638 mg范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好(r=0.9993)，黃芪和紅芪的平均加樣回收率分別為96.87%和98.96%，相對標準偏差分別為2.00%和2.86%(n=6)。甘肅各地區(qū)黃芪樣品中總皂苷平均含量分別為宕昌5.10%、武都4.41%、隴西等3地4.21%；紅芪樣品中總皂苷平均含量分別為宕昌3.41%、武都4.15%、隴西等4地3.06 %。結(jié)論本研究建立的黃芪和紅芪總皂苷含量測定方法簡便、準確，重復性好，可用于甘肅地區(qū)黃芪和紅芪中總皂苷含量測定及其對比研究。甘肅不同產(chǎn)地黃芪和紅芪藥材中總皂苷含量存在差異，宕昌黃芪總皂苷含量最高，武都紅芪總皂苷含量最高，且同一地區(qū)黃芪總皂苷含量高于紅芪總皂苷。

黃芪；紅芪；總皂苷；紫外-可見分光光度法；含量測定

《中華人民共和國藥典》2015年版(一部)規(guī)定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根；紅芪為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz的干燥根；二者均具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌的功效[1]。目前，對于紅芪中是否含有黃芪甲苷尚未達成共識[2-4]，但是二者均含有豐富的皂苷類成分，黃芪和紅芪總皂苷均具有抗氧化、增強免疫功能等多種藥理活性[5-8]。化學成分含量是影響中藥臨床療效的重要因素之一，因此，開展黃芪和紅芪總皂苷含量對比研究，有助于探索《中華人民共和國藥典》將具有同一功效的二者列為兩個品種的部分原因。本研究將建立一種可以同時測定二者總皂苷含量的方法，并進行二者總皂苷含量的對比研究，為黃芪和紅芪的合理使用提供參考依據(jù)。

1　材料

8453紫外-可見分光光度計(美國，安捷倫)；CP2202S電子分析天平(瑞士，梅特勒-托利多)；SPS202F電子分析天平(中國，奧豪斯公司)；DZKW-4電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海振捷實驗設(shè)備有限公司)；KQ-250超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

黃芪、紅芪藥材分別采自甘肅宕昌、武都、隴西、渭源、岷縣、禮縣，并經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所胡世林教授鑒定為2010版《中華人民共和國藥典》收載的正品黃芪和紅芪；黃芪甲苷(批號20141119，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備

取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL含有0.7120 mg的對照品溶液，備用。

2.2供試品溶液的制備

取紅芪、黃芪粉末(過50目篩)約0.8 g，精密稱定，分別置平底燒瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流3小時，取出， 放冷， 再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液12.5 mL，減壓回收溶劑至干，用水溶解殘渣，并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，加水飽和正丁醇溶液萃取(4次×5 mL)，合并正丁醇溶液，減壓回收溶劑至干，用甲醇溶解殘渣，并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，精密吸取3 mL定容至25 mL量瓶中，搖勻即得紅芪、黃芪供試品溶液(含生藥濃度為0.02 g/L)。

表1　三種顯色方法對黃芪和紅芪總皂苷含量測定波長的影響

2.3檢測方法和檢測波長的確定

根據(jù)文獻報道[9-11]，本實驗嘗試了3種顯色方法，實驗結(jié)果如表1所示。由表1可知：硫酸甲醇法測定總皂苷含量偏高且供試品和對照品最大吸收波長相差較大；香草醛-冰醋酸-高氯酸法與香草醛-硫酸法含量測定結(jié)果相差不大，但香草醛-硫酸法對照品與樣品的最大吸收波長相差較大(543～530 nm)，而香草醛-冰醋酸-高氯酸法樣品和對照品波長基本一致(540±2 nm)。綜合考慮，選擇香草醛-冰醋酸-高氯酸法作為紅芪、黃芪總皂苷的顯色方法，檢測波長為540 nm。

2.4顯色條件的篩選

2.4.1顯色溫度精密吸取“2.1”項下對照品和 “2.2”項下黃芪和紅芪供試品溶液和純水(作為空白溶液)各0.15 mL，分為3份，置具塞刻度試管中，90℃水浴揮干溶劑，放冷，分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和高氯酸1.6 mL，搖勻，分別置于80℃、90℃、100℃水浴中加熱15分鐘，取出，立即置冰浴中冷卻5分鐘，加入冰醋酸8 mL，搖勻，在400～800 nm范圍內(nèi)掃描，測定最大吸光度，進行對比，結(jié)果見表2。由表2可知，100℃時，對照品和2個樣品的最大吸收波長基本一致，其他溫度下對照品和樣品最大吸收波長相差較大，故選擇在100℃顯色。

2.4.25%香草醛-冰醋酸用量篩選精密吸取“2.1”項下對照品和 “2.2”項下黃芪和紅芪供試品溶液和純水(作為空白溶液)各0.15 mL，各5份，分別置具塞刻度試管中，90℃水浴揮干溶劑，放冷，分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL和高氯酸1.6 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15分鐘，取出，立即置冰浴中冷卻5分鐘，加入冰醋酸8 mL，搖勻，在540 nm處測定吸光度，進行對比，結(jié)果見圖1。由圖1可知：紅芪、黃芪樣品的吸光度隨著香草醛用量的增加而逐漸增大，當5%香草醛用量在0.4～0.5 mL之間，吸光度趨于穩(wěn)定，故選取0.4 mL的5%香草醛-冰醋酸。

表2　不同顯色溫度對黃芪和紅芪總皂苷吸收波長的影響

圖1　5%香草醛-冰醋酸用量對總皂苷吸光度的影響

2.4.3高氯酸用量篩選精密吸取“2.1”項下對照品和“2.2”項下黃芪和紅芪供試品溶液和純水(作為空白溶液)各0.15 mL，分為9份，置具塞刻度試管中，90℃水浴揮干溶劑，放冷，分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和高氯酸0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱15分鐘，取出，立即置冰浴中冷卻5分鐘，加入冰醋酸8 mL，搖勻，在540 nm處測定吸光度，進行對比，結(jié)果見圖2。由圖2可知：黃芪和紅芪樣品隨著高氯酸用量的增加，吸光度逐漸降低，高氯酸用量在1.4～1.8 mL之間吸光度趨于穩(wěn)定，加1.6 mL高氯酸黃芪和紅芪樣品吸光度變化最小，故選擇加1.6 mL高氯酸顯色。

圖2　高氯酸用量對總皂苷吸光度的影響

2.4.3顯色時間精密吸取“2.1”項下對照品和“2.2”項下黃芪和紅芪供試品溶液和純水(作為空白溶液)0.15 mL，各6份，分別置具塞刻度試管中，90℃水浴揮干溶劑，放冷，分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和高氯酸1.6 mL，搖勻，置100℃水浴中分別加熱5、10、15、20、25、30分鐘，取出，立即置冰浴中冷卻5分鐘，加入冰醋酸8 mL，搖勻。在540 nm波長處測定吸光度，進行對比，結(jié)果見圖3。由圖3可知：隨著顯色時間的增加，供試品的吸光度呈上升趨勢，當顯色時間在20～25分鐘之間，吸光度變化較平緩，選擇在吸光度相對穩(wěn)定的時間范圍進行測定方法穩(wěn)定可靠，故選取水浴時間為20分鐘。

圖3　不同顯色時間對黃芪和紅芪總皂苷吸光度的影響

2.5方法學考察

2.5.1線性關(guān)系考察精密吸取“2.1”項下黃芪甲苷對照品溶液 0.07、0.11、0.15、0.19、0.23 mL，和蒸餾水0.15 mL，分別置具塞刻度試管中，蒸干溶劑，按照“2.4”項下顯色方法顯色后，搖勻，在540 nm下測定吸光度。以吸光度(Y)值為縱坐標，質(zhì)量(mg)為橫坐標進行回歸，繪制標準曲線，計算回歸方程。得Y=4.785C-0.021，r=0.9993，說明對照品質(zhì)量在0.0498～0.1638 mg范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.5.2精密度考察精密吸取“2.1”項下黃芪甲苷對照品溶液和蒸餾水各0.15 mL，分別置具塞刻度試管中，蒸干溶劑，按照“2.4”項下的顯色方法顯色后搖勻，在540 nm處測定吸光度，連續(xù)測定6次，記錄吸光度值，計算相對標準偏差(relative sfandard deviation,RSD)。結(jié)果表明對照品溶液吸光度的RSD為0.26%，說明儀器精密度良好。

2.5.3重復性考察取同一批次的黃芪和紅芪藥材粉末約0.8 g(過50目篩)，各6份，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，取供試品溶液及黃芪甲苷對照品溶液各0.15 mL置具塞刻度試管中，按照“2.4”項下顯色方法顯色后搖勻，在540 nm波長處測定吸光度，運用外標一點法計算樣品中總皂苷的含量及RSD。結(jié)果表明黃芪和紅芪樣品中總皂苷含量分別為3.58 %和2.91 %，RSD分別為1.38%和2.79%。說明本方法重復性良好。

2.5.4穩(wěn)定性考察取“2.2”項下的黃芪和紅芪供試品溶液及黃芪甲苷對照品溶液各0.15 mL置具塞刻度試管中，按照“2.4”項下顯色方法顯色后搖勻，分別于0、10、20、30、40分鐘在540 nm波長處測定吸光度，運用外標一點法計算樣品中總皂苷的含量及RSD。結(jié)果表明黃芪和紅芪供試品總皂苷含量RSD分別為1.19%與2.62%，說明黃芪和紅芪供試品顯色后40分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5加樣回收率考察(1)對照品的配制：精密稱取黃芪甲苷對照品40.68 mg和35.89 mg分別置于50 mL容量瓶中，加無水甲醇定容至刻度，搖勻即得濃度為0.8136 mg/L和0.7178 mg/L的黃芪甲苷對照品溶液。另精密稱取2.21 mg黃芪甲苷對照品置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，精密吸取2.5 mL至5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即得濃度為0.1105 mg/L的黃芪甲苷對照品溶液。(2)供試品的制備：取6個100 mL平底燒瓶，編號為1～6，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液8 mL(0.8136 mg/L)，90℃蒸干溶劑，精密加入同一批次已知總皂苷含量的黃芪藥材粗粉(過50目篩)(總皂苷含量3.5801%)，每份0.2000 g，另取6個100 mL平底燒瓶，編號為7～12，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液8 mL(0.7178 mg/L)，90℃蒸干溶劑，精密加入同一批次已知總皂苷含量的紅芪藥材粗粉(過50目篩)(總皂苷含量2.9052%)，每份0.2000 g，12個燒瓶中分別加入70%的乙醇12 mL，按照“2.2”項下方法，萃取蒸干溶劑后定容至50 mL容量瓶，精密吸取2 mL至5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。(3)含量測定及計算：取黃芪甲苷對照品溶液(0.1105 mg/L)、供試品溶液、蒸餾水各1 mL，各兩份，置具塞試管中，90℃蒸干溶劑，按照”2.4”項下顯色方法顯色后，搖勻，在400～800 nm處掃描，于540 nm處測定吸光度值，運用外標一點法計算樣品加樣回收率及RSD。結(jié)果見表3、4。由表3和表4可知，黃芪總皂苷平均加樣回收率及RSD分別為96.87%和2.00%，紅芪總皂苷平均加樣回收率和RSD分別為98.96%和2.86%，說明本方法準確性良好。

2.6黃芪和紅芪樣品總皂苷含量測定

實驗用紅芪、黃芪藥材采自甘肅省紅芪主產(chǎn)區(qū)1年生樣本。采集分為3大區(qū)域：(1)主產(chǎn)區(qū)宕昌縣(采集時間：2014年11月2日～16日)；(2)主產(chǎn)區(qū)隴南市武都區(qū)(采集時間：2014年12月12日～18日)；(3)其他紅芪產(chǎn)區(qū)4縣：禮縣、岷縣、渭源、隴西(采集時間：2014年10月25日～11月10日)，在紅芪主產(chǎn)區(qū)采集紅芪的同時，采集當?shù)氐狞S芪。采集信息包括：采樣編號，采樣地點(縣鄉(xiāng)村)，地理位置(經(jīng)緯度、海拔高度)，地貌特點(陰坡、陽坡、陡地)及種植面積等。按當?shù)夭墒諘r間采集，按當?shù)丶庸し椒庸ち罆?。共收集到紅芪、黃芪藥材各28批次樣品。按“2.4”項下方法顯色，以相應(yīng)的試劑為空白，在540 nm波長處測樣品、黃芪甲苷對照品的吸光度值，計算樣品總皂苷含量，實驗結(jié)果見表5、6、7。結(jié)果表明，甘肅各地區(qū)黃芪樣品中總皂苷平均含量分別為宕昌5.10%、武都4.41%、隴西等3地4.21%，黃芪總皂苷平均含量為4.55%；紅芪樣品中總皂苷平均含量分別為宕昌3.41%、武都4.15%、隴西等4地3.06 %，紅芪總皂苷平均含量為3.56%。對同一地區(qū)黃芪和紅芪總皂苷含量進行統(tǒng)計學分析，得到組內(nèi)P值分別為：隴西4縣P=2.62×10-5；宕昌P=3.10×10-4；武都P=0.16，總P=3.894×10-6。

表3　黃芪總皂苷加樣回收率結(jié)果

表4　紅芪總皂苷加樣回收率結(jié)果

表5　甘肅禮縣、岷縣、魏源、隴西4地黃芪及紅芪總皂苷含量測定結(jié)果

表6　甘肅宕昌黃芪及紅芪總皂苷含量測定結(jié)果

表7　甘肅武都黃芪及紅芪總皂苷含量測定結(jié)果

3　討論

3.1樣品提取純化方法建立

根據(jù)文獻[12]，本實驗前期對于黃芪和紅芪總皂苷量測定前處理方法進行篩選，對比了甲醇和70%乙醇、超聲和回流、水飽和正丁醇和水飽和乙酸乙酯萃取、提取時間、提取溶劑量等因素，實驗結(jié)果表明：采用25 mL 70%乙醇回流提取3小時、水飽和正丁醇萃取總皂苷含量高于其他條件，最終確定本實驗樣品含量測定前處理方案。

3.2顯色方法的建立

文獻報道[9-11]總皂苷常用的顯色方法有香草醛-高氯酸-冰醋酸法和香草醛-濃硫酸法，其中在硫酸體系中誤差大于在高氯酸體系[13]。本實驗嘗試了很多文獻中的方法[14-21]，發(fā)現(xiàn)黃芪和紅芪供試品的最大吸收與對照品均不一致；同時發(fā)現(xiàn)顯色溫度是影響總皂苷含量測定樣品與對照品吸收波長的關(guān)鍵因素，當溫度在60～90℃范圍內(nèi)，黃芪甲苷對照品和紅芪、黃芪供試品的最大吸收波長不一致，而在100℃時2個供試品和對照品最大吸收波長基本一致，這與文獻報道[11]在100℃測定黃芪總皂苷的溫度相符。本實驗對其他顯色參數(shù)進行了篩選，最終確定的顯色條件為：5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和高氯酸1.6 mL，100℃水浴中加熱2分鐘，立即冰浴冷卻5分鐘至室溫，加入冰醋酸8 mL，搖勻。并考察了顯色的穩(wěn)定性，樣品應(yīng)在40分鐘之內(nèi)測完。雖然有文獻報道[13]隨著溫度的增高，雜質(zhì)的影響增大，但是本實驗嘗試其他溫度條件下，對照品和供試品的最大吸收波長不在一處，用于測定含量誤差也較大，該文獻同時指出，香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色方法不是總皂苷特征顯色方法，此種方法只能測定皂苷的相對含量，并且比真實值要高一些。本實驗主要是對黃芪和紅芪總皂苷含量的對比研究，雖然有雜質(zhì)干擾，但是二者含量的差異對比依然有意義。

3.3含量統(tǒng)計學分析、平均含量對比

本研究按產(chǎn)地傳統(tǒng)采收期，在2014年采集了甘肅省內(nèi)紅芪主產(chǎn)地1年生28批藥材，同時采集當?shù)?年生黃芪28批藥材(個別樣品不是同一產(chǎn)地)，對其總皂苷進含量進行了對比。(1)從數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析可知，甘肅省5縣、1市區(qū)28批紅芪和28批黃芪總皂苷的含量有極顯著性差異(P<0.01)，但武都地區(qū)總皂苷含量沒有顯著性差異(P>0.05)。(2)從平均含量可知，隴西等4縣、宕昌地區(qū)、武都區(qū)黃芪總皂苷平均含量均高于紅芪總皂苷平均含量。

3.4品種、地區(qū)優(yōu)勢

(1)地區(qū)優(yōu)勢：從總皂苷含量對比，黃芪總皂苷以宕昌(10批)最高，平均值為5.10%，武都(10批)次之，平均值為4.41%，隴西、渭源、岷縣3縣(8批)含量較低，平均值為4.21 %，相比之，宕昌黃芪質(zhì)量好；紅芪總皂苷以武都(10批)最高，平均值為4.15 %，宕昌(10批)次之，平均值為3.41%，隴西、渭源、岷縣、禮縣4地(8批)樣品含量最低，平均值為3.06 %，相比之，武都紅芪質(zhì)量好。武都、宕昌產(chǎn)紅芪、黃芪質(zhì)量總體優(yōu)于隴西、岷縣、渭源、禮縣所產(chǎn)紅芪、黃芪。(2)品種優(yōu)勢：宕昌、武都、隴西、渭源、岷縣、禮縣4縣黃芪總皂苷含量均高于紅芪，即甘肅各地同一產(chǎn)區(qū)的黃芪和紅芪，黃芪總皂苷含量高于紅芪。

3.5對比分析

由上述實驗數(shù)據(jù)可知：甘肅同一地區(qū)黃芪總皂苷的含量高于紅芪總皂苷的含量，提示二者質(zhì)量存在差異，僅從總皂苷含量分析，黃芪的質(zhì)量可能優(yōu)于紅芪，但需做進一步藥效學研究。同時，可以看出，甘肅5縣、1市區(qū)宕昌黃芪總皂苷含量最高，武都紅芪總皂苷含量最高，提示甘肅地區(qū)發(fā)展黃芪和紅芪產(chǎn)業(yè)化種植可重點選擇這兩個地區(qū)。

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(本文編輯： 董歷華)

Comparative study on content of total saponins of Astragalus and Radix Hedysari in Gansu

YEYing，BAOQiang，WANGRui-hai，etal.

InstituteofBasicTheoryResearchofTCM，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China

LIULi-mei，E-mail：liulimeihrb@sina.com

ObjectiveTo establish a method for determining the total saponins content of Astragali and Radix Hedysari in Gansu Province, and compare the total saponins content of Astragali and Radix Hedysari in different areas of Gansu Province. MethodsThe vanillin-perchloric acid colorimetric method was used to detect the total saponins content of 28 batches of Radix Astragali and 28 batches of Radix Hedysari samples which were got from five regions of Gansu Province, Astragalus saponins was used as the control sample and 540 nm was chosen as the detection wavelength. ResultsThe absorbance and the concentration had a good linear relationship (r=0.9993), and the absorbance of astragaloside IV was linear in range of 0.0498～0.1638 mg.The average recoveries of Astragali and Radix Hedysari were 96.87% and 98.96% respectively, the RSD were 2.00% and 2.86% (n=6) respectively. The average content of the total saponins in the sample of Astragalus in Tangchang was 5.10%, Wudu was 4.41%, Longxi and another two areas were 4.21%. The average content of total saponins of Radix Hedysari samples in Tangchang was 3.41%, Wudu was 4.15%, Longxi and another two areas were 3.06%. ConclusionThe method for detecting the total saponins content of Astragali and Radix Hedysari in Gansu Province was simple, accurate and reproducible, and can be used for the comparative study on the content of total saponins of Astragalus and Radix Hedysari. There are differences in the content of total saponins of Radix Astragali and Radix Hedysari in Gansu Province. The total saponin content of Astragalus in Wudu is highest, and the total saponin content of Radix Hedysari in Tangchang was the highest. Total saponin content of Astragalus was higher than that of Radix Hedysar in the same area of Gansu Province.

Astragalus；Radix Hedysari；Total saponins；Ultraviolet visible spectrophotometry；Content determination

中國中醫(yī)科學院自主選題(YZ-1438)

100700北京，中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所中藥分析室[葉迎(碩士研究生)、王瑞海、柏冬、劉麗梅]；甘肅省中醫(yī)院藥學部(包強、楊麗霞、姜良恩)；甘肅省宕昌縣中藥材產(chǎn)業(yè)開發(fā)中心(劉衛(wèi)東、彭建平、陳永剛)；甘肅省隴南市武都區(qū)中藥材中心(田生華、劉培元)

葉迎(1991- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：質(zhì)量標準研究。E-mail：1011153961@qq.com

劉麗梅(1965- )，女，本科，研究員。研究方向：中藥化學質(zhì)量分析。E-mail：liulimeihrb@sina.com

R284.1

Adoi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.10.009

2016-03-15)