殷世亮,張弘,金戈,王俊平,周凡
(1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,遼寧沈陽110034;2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院生理學(xué)教研室;3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院血液科)
高三尖杉酯堿與伊馬替尼協(xié)同誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞凋亡
殷世亮1,張弘2*,金戈1,王俊平1,周凡3
(1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,遼寧沈陽110034;2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院生理學(xué)教研室;3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院血液科)
目的:考察高三尖杉酯堿(HHT)與伊馬替尼(STI571)對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)細(xì)胞株KU812細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。方法:采用AO-EB熒光染色法及PI染色的流式細(xì)胞術(shù),考察HHT和STI571分別和聯(lián)合給藥對(duì)KU812細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用;采用Western blot技術(shù)考察HHT和STI571對(duì)KU812細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果:HHT能夠與STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡,且兩者的協(xié)同誘導(dǎo)作用呈時(shí)間及劑量依賴效應(yīng);能顯著引起PARP蛋白裂解,并顯著下調(diào)Bcl-XL蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論:HHT與STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡,具有協(xié)同抗CML作用。
高三尖杉酯堿;伊馬替尼;細(xì)胞凋亡;慢性粒細(xì)胞
[Abstract]Objective:To investigate the apoptotic induction effects of homoharringtonine(HHT)combined with imatinib(STI571)on human chronic myeloid leukemia(CML)KU812 cells.Methods:KU812 cells were treated with HHT or/and STI571.Total cell numbers were counted by using hemocytometer.Apoptotic cells were determined by using fluorescence microscope and FACS after staining with AO-EB and PI respectively.The cleavage of poly ADP-ribose polymerase(PARP)and the expression of anti-apoptotic proteins were determined by Western blot.Results:HHT could prompt the apoptotic induction of imatinib in KU812 cells,which was in a time and dose dependent manner.Apoptosis induced by HHT and imatinib was correlated with the down-regulation of Bcl-XL and the cleavage of PARP.Conclusion:HHT prompt apoptotic induction of imatinb in KU812 cells and the combination of HHT with imatinib will provide a more effective strategy for the clinical treatment of CML.
[Key words]homoharringtonine;imatinib;apoptosis;CML
高三尖杉酯堿(homoharringtonine,HHT)是從紅豆杉科三尖杉屬三尖杉(Cephalotaxus fortumei Hook f.)的枝葉、種子、樹皮和根部分離出的具有抗腫瘤活性的生物堿[1-3]。HHT和它的類似物能夠抑制蛋白質(zhì)和DNA的合成。甲磺酸伊馬替尼(STI571)是基于人慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia,CML)特異表達(dá)的融合蛋白BCR/ABL的酪氨酸激酶活性位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的小分子化合物,2001年經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市,用于治療慢性期CML。臨床報(bào)道表明,STI571耐藥的CML細(xì)胞對(duì)HHT仍然敏感[4-5]。本研究將HHT和BCR/ABL蛋白的小分子抑制劑STI571聯(lián)合,考察HHT與STI571對(duì)CML細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用,以期為CML的臨床治療提供更為有效的治療方案。
1.1材料人CML細(xì)胞株KU812(美國(guó)ATCC公司);RPMI-1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司);碘化丙啶(PI)、丫啶橙(AO)、溴化乙啶(EB)(美國(guó)Sigma公司);Western blot抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);鼠抗PARP和鼠抗Mcl-1單克隆抗體(美國(guó)Cell-Signaling公司);化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑盒(英國(guó)Amersham Biosciences公司)。
1.2細(xì)胞培養(yǎng)人CML細(xì)胞株KU812細(xì)胞均培養(yǎng)于含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、1 mmol/L谷氨酰胺及10%(v/v)經(jīng)加熱滅活的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。所有實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3AO-EB雙染法進(jìn)行凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以每孔1×105/ml的細(xì)胞密度接種于24孔板中,每孔加入2 ml培養(yǎng)液。藥物作用后,取1 ml細(xì)胞懸液,3 000 r/min離心1 min,棄上清液,重懸于50 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中,然后加入AO/EB等體積混合液5 μl(100 μg/ml AO,100 μg/ml EB),混勻。取12 μl混合液點(diǎn)于潔凈載玻片上,用蓋玻片封片,在熒光顯微鏡490 nm波長(zhǎng)下記錄并觀察細(xì)胞的染色情況和形態(tài)學(xué)改變。細(xì)胞呈現(xiàn)AO著色的綠色熒光同時(shí)EB拒染,并出現(xiàn)核皺縮、邊緣化、發(fā)芽、發(fā)泡以及凋亡小體等典型凋亡形態(tài)的細(xì)胞被認(rèn)為是早期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞若呈現(xiàn)EB著色的紅色熒光,說明細(xì)胞已經(jīng)死亡,為壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞。
1.4細(xì)胞PI染色的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)藥物處理相應(yīng)時(shí)間后離心收集細(xì)胞(2×106個(gè)),經(jīng)PBS洗滌后用300 μl PBS重懸細(xì)胞,加入20 ml冰預(yù)冷的70%乙醇中固定12 h后收集樣品。離心收集細(xì)胞,于800 μg/ml的RNase溶液中37℃孵育20 min后,加入PI染色液。待測(cè)樣品DNA含量采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,吸收波長(zhǎng)為625 nm??v坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)量,橫坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度即DNA含量。樣品經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)采集10 000個(gè)細(xì)胞。所得數(shù)據(jù)采用CELLQuest軟件(Becton Dickinson)進(jìn)行處理分析。
1.5Western blot檢測(cè)研究表明,HHT可以誘導(dǎo)CML細(xì)胞的凋亡并下調(diào)Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達(dá)水平,發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用[3],因此應(yīng)用Western blot法檢測(cè)了HHT和STI571分別及聯(lián)合處理KU812細(xì)胞后Bcl-XL的蛋白水平,以及細(xì)胞凋亡指示蛋白PARP(poly-(ADP-ribose)-polymerase)的活化情況。凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞總蛋白(300 μg)通過RIPA裂解緩沖液[60 mmol/L Tris鹽酸,180 mmol/L氯化鈉,0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS),1%NP-40,0.6%脫氧膽酸鈉,1 mmol/L PMSF,200 μmol/L leupeptin和3 μg/ml aprotinin,pH 8.0]裂解得到。應(yīng)用Bradford蛋白定量法定量蛋白,通過SDS-凝膠電泳法分離蛋白,采用Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀將蛋白濕轉(zhuǎn)到
PVDF膜上。采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h后,加入20 ml稀釋濃度的待測(cè)蛋白特異性單克隆抗體,于4℃結(jié)合12 h。TBST洗滌3次后與標(biāo)記的二抗室溫結(jié)合1 h后TBST洗滌1次,PVDF膜經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL kit,Amersham Biosciences)處理5 min,PVDF膜與富士膠片于曝光板中壓片曝光,經(jīng)顯影液和定影液處理后掃描采集圖像。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用One-way ANOVA,兩兩比較采用q檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1HHT與STI571聯(lián)合給藥誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察通過AO-EB染色的熒光顯微鏡觀察HHT和STI571分別給藥以及聯(lián)合給藥對(duì)KU812細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。0.2 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571單獨(dú)處理KU812細(xì)胞24 h,均不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;聯(lián)合給予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞24 h,可觀察到顯著的細(xì)胞凋亡形態(tài)圖,HHT能夠協(xié)同STI571誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡,見圖1。
2.2HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的時(shí)間依賴性關(guān)系分別將0.1 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571單獨(dú)以及聯(lián)合處理KU812細(xì)胞12、24、48 h,及培養(yǎng)12、24、48 h的KU812細(xì)胞作為對(duì)照組,采用AO-EB染色的細(xì)胞形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法,結(jié)果顯示,單獨(dú)給予0.1 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞12、24、48 h,誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡無明顯的的時(shí)間依賴關(guān)系;1 μmol/L STI571聯(lián)合0.1 μmol/L HHT處理細(xì)胞12、24、48 h,分別有20%、47%、86%細(xì)胞凋亡,可見HHT與STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡具有顯著的時(shí)間依賴關(guān)系,見圖2。
2.3HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的劑量依賴性關(guān)系分別將不同濃度HHT和STI571單獨(dú)以及聯(lián)合處理KU812細(xì)胞24 h,采用AO-EB染色的細(xì)胞形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法,結(jié)果顯示,單獨(dú)給予0.1、0.2 μmol/L HHT或單獨(dú)給予1、2 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞24 h,誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡均無明顯的劑量依賴關(guān)系;1 μmol/L STI571聯(lián)合0.1、0.2 μmol/L HHT處理細(xì)胞24 h,分別有42%和66%細(xì)胞凋亡,2 μmol/L STI571聯(lián)合0.1、0.2 μmol/L HHT處理細(xì)胞48 h,分別有72%和87%細(xì)胞凋亡,HHT與STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡具有顯著的劑量依賴關(guān)系,見圖3。
圖1 HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×400)
圖2 HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的時(shí)間依賴性關(guān)系
圖3 HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的劑量依賴性關(guān)系
2.4HHT與STI571聯(lián)合給藥誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)0.1 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571單獨(dú)處理KU812細(xì)胞24 h,PI染色的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,分別有8.5%和4.9%的細(xì)胞發(fā)生凋亡,未出現(xiàn)顯著的凋亡誘導(dǎo)作用。0.1 μmol/L HHT和1 μmol/LSTI571聯(lián)合處理KU812細(xì)胞24 h,采用PI染色的流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)到顯著的SubG1凋亡峰,約42%的KU812細(xì)胞發(fā)生凋亡,見圖4。
2.5HHT與STI571聯(lián)合給藥對(duì)KU812細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響分別給予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞24 h,并不顯著改變抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達(dá)水平,聯(lián)合給予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞24 h,可以顯著下調(diào)Bcl-XL蛋白的表達(dá)水平,并協(xié)同活化PARP凋亡指示蛋白,見圖5。
圖4 HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
圖5 HHT聯(lián)合STI571對(duì)KU812細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響
近年來的臨床研究顯示,STI571不能完全根除CML惡性克隆,并已出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性,據(jù)報(bào)道,對(duì)STI571耐藥的CML細(xì)胞對(duì)HHT仍然敏感,并且HHT對(duì)帶有T315I BCR/ABL酪氨酸激酶點(diǎn)突變的STI571耐藥細(xì)胞仍然有治療效果[6-7]。因此將HHT與STI571聯(lián)合給予CML患者將會(huì)取得良好的治療效果,并克服腫瘤的耐藥。
本實(shí)驗(yàn)中HHT聯(lián)合STI571協(xié)同誘導(dǎo)CML細(xì)胞系KU812細(xì)胞凋亡,并呈良好的時(shí)間依賴和劑量依賴關(guān)系。0.1和0.2 μmol/L HHT處理KU812細(xì)胞24、48 h不能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,同樣單獨(dú)給予1和2 μmol/L STI571處理KU812細(xì)胞24、48 h也不能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,但將兩者聯(lián)合給藥可顯著地誘導(dǎo)KU812細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明,HHT與STI571聯(lián)合能夠顯著誘導(dǎo)CML細(xì)胞系KU812凋亡,二者具有協(xié)同抗CML作用。
HHT聯(lián)合STI571可以顯著地引起KU812細(xì)胞Bcl-XL的表達(dá)下調(diào),并伴隨著凋亡標(biāo)準(zhǔn)性蛋白PARP的裂解活化。Bcl-XL為Bcl-2家族中重要凋亡抑制蛋白,Bcl-XL的下調(diào)表達(dá)可以引起腫瘤細(xì)胞的凋亡[8]。本研究提示HHT可能通過下調(diào)Bcl-XL抗凋亡蛋白發(fā)揮協(xié)同STI571誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗CML作用。
[1]Kantarjian HM,Talpaz M,Santini V,et al.Homoharringtonine:history,current research,and future directions[J].Cancer,2001,92(6):1591-1605.
[2]Powell RG,Weisleder D,Smith CR Jr.Anritumor alkaloids for Cephalataxus harringtoninia:structure and activity[J].J Pharm Sci,1972,61(8):1227-1230.
[3]Yin S,Wang R,Zhou F,et al.Bcl-XL is a dominant antiapoptotic protein that inhibits homoharringtonine-induced apoptosis in leukemia cells[J].Mol Pharmacol,2011,79(6):1072-1083.
[4]Chen R,Varsha G,Plunkett W.A sequential blockade strategy for the design of combination therapies to overcome oncegene addiction in chronic myelogenous leukemia[J].Cancer Res,2006,66(22):10959-10966.
[5]O'Brien S,Giles F,Talpaz M,et al.Results of triple therapy with interferon-alpha,cytarabine,and homoharringtonine,and the impact of adding imatinib to the treatment sequence in patients withPhiladelphiachromosome-positivechronicmyelogenous leukemia in early chronic phase[J].Cancer,2003,98(5):883-893.
[6]Quintás-Cardama A,Kantarjian H,Cortes J.Phase 1/2 study of subcutaneous homoharringtonine in patients with chronic myeloid leukemia who have failed prior therapy[J].Cancer,2007,109(5):248-255.
[7]de Lavallade H,Khorashad JS,Davis HP,et al.Interferonalpha or homoharringtonine as salvage treatment for chronic myeloid leukemia patients who acquire the T315I BCR-ABL mutation[J]. Blood,2007,110(7):2779-2780.
[8]Amaracte-Mendes GP,McGahon AJ,Nishioka WK,et al.Bcl-2independentBcr-Abl-mediatedresistancetoapoptosis:protection is correlated with up regulation of Bcl-XL[J]. Oncogene,1998,16(11):1383-1390.
Homoharringtonine Prompt Apoptotic Induction of Imatinib in CML Cells
YIN Shiliang1,ZHANG Hong2*,JIN Ge1,WANG Junping1,ZHOU Fan3
(1.Department of Pharmacology,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China;2.Department of Physiology,School of Life Science and Biopharmaceutics,Shenyang Pharmaceutical University;3.Shenyang Military General Hospital)
R965
A
1008-2344(2016)05-0332-04
10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.05.004
2016-03-16
(文敏 編輯)
沈陽醫(yī)學(xué)院優(yōu)秀人才項(xiàng)目(No.20123045);遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(No.L2013402)
殷世亮(1980—),男(漢),博士,講師,研究方向:抗腫瘤藥物作用機(jī)制研究.E-mail:yslal@163.com
張弘(1981—),女(漢),博士,講師,研究方向:抗腫瘤藥物作用機(jī)制研究.E-mail:song0688@sina.com