UPLC-MS/MS測定葡萄酒中3種雙酰胺類殺蟲劑

張　云，程立軍，侯　杰，陳澤宇，朱海燕

（1.三明出入境檢驗檢疫局，福建 三明 365000；2.三明學院 資源與化工學院，福建 三明 365000）

UPLC-MS/MS測定葡萄酒中3種雙酰胺類殺蟲劑

張云1，程立軍1，侯杰1，陳澤宇1，朱海燕2

（1.三明出入境檢驗檢疫局，福建 三明 365000；2.三明學院 資源與化工學院，福建 三明 365000）

建立了葡萄酒中氰蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟苯蟲酰胺等3種雙酰胺類殺蟲劑殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）檢測方法。葡萄酒中的3種雙酰胺類殺蟲劑經(jīng)乙腈提取后，用GCB/NH2固相萃取柱凈化，以乙腈-5 mmol/L乙酸銨-甲酸作為流動相，梯度洗脫，通過UPLC-MS/MS進行測定。結(jié)果表明，3種雙酰胺類殺蟲劑在質(zhì)量濃度1～20 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R）≥0.999 5，方法檢出限＜1.0 μg/kg；以1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10 μg/kg為添加水平，平均回收率在76.3%～91.1%之間，相對標準偏差（RSD）為3.9%～9.8%。表明該方法快速簡便、凈化效果好、準確度較好、精密度較高，可應用于葡萄酒中3種雙酰胺類殺蟲劑的同時測定。

葡萄酒；雙酰胺類殺蟲劑；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；測定

葡萄酒是以新鮮的葡萄為原料，經(jīng)過發(fā)酵釀造而成的酒精飲料［1］。其中富含多種營養(yǎng)成分，具有預防心腦血管疾病和抗衰老等保健功效［2］。隨著人們生活水平的不斷提高，葡萄酒的需求量逐年增加。然而葡萄在種植過程中容易受病蟲害感染，防治病蟲害的主要農(nóng)藥有苯并咪唑類和雙酰胺類等［3］。氰蟲酰胺（cyantraniliprole）、氯蟲苯甲酰胺（chloranteraniliprole）和氟苯蟲酰胺（flubendiamide）是目前市面上常見的3種雙酰胺類殺蟲劑。該類殺蟲劑的最大特點是能有效刺激昆蟲體內(nèi)的魚尼丁受體（ryanodine receptor，RyR），促進細胞內(nèi)鈣離子的過量流失，引起昆蟲癱瘓導致死亡［4］，可有效防治鱗翅目、鞘翅目和半翅目等昆蟲［5-6］。研究表明，長期飲用含有農(nóng)藥殘留的葡萄酒會導致慢性中毒。

目前，國內(nèi)外有關(guān)雙酰胺類殺蟲劑檢測報道，主要集中在原藥［7］、土壤和植物性食品［8-9］以及動物性食品［10-11］中，而同時測定葡萄酒中氰蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺等雙酰胺類殺蟲劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測方法鮮有報道。本試驗結(jié)合固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）技術(shù)，研究了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）多反應檢測模式（multiple reaction monitoring，MRM）條件下，對葡萄酒中3種雙酰胺類目標物有效成分進行定性定量分析。該方法填補了國內(nèi)葡萄酒中檢測雙酰胺類殺蟲劑的研究空白。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葡萄酒：市售。氰蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟苯蟲酰胺標準品（純度均≥97%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸、乙腈（均為色譜純）：德國默克公司；乙酸胺（色譜純）：美國Tedia公司；無水硫酸鎂、無水硫酸鈉（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

LC-30AD超高效液相色譜：日本SHIMADZU公司；AB SCIEX 3500三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子（electronicsprayion，ESI）源）：美國ABSCIEX公司；Sepline-4自動固相萃取裝置：北京萊伯泰科公司；GCB/NH2固相萃取柱（500 mg/500 mg，6 mL）、PSA固相萃取柱（500mg，3mL）、C18固相萃取柱（500 mg，3 mL）、HLB固相萃取柱（500 mg，3 mL）：北京艾杰爾科技有限公司；L-550離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；AE240電子天平：瑞士梅特勒公司；EV311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京萊伯泰科公司；KQ-500DE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司：Direct8超純水機：美國Millipore公司。

1.3實驗方法

1.3.1樣品前處理

取5 mL葡萄酒于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，漩渦混勻1 min，超聲提取10 min，加入5 g無水硫酸鎂，迅速振蕩漩渦混勻1min，4000r/min離心5min，取10mL上清液，待凈化。

1.3.2樣品凈化

在固相萃取柱上添加1g無水硫酸鈉，用5 mL乙腈活化固相萃取柱，將10 mL待凈化的樣品溶液上柱，再用10 mL乙腈淋洗，固相萃取裝置流速為3 mL/min。收集樣液和淋洗液，于35℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈洗脫液（9∶1，V/V）洗脫并定容至2 mL，過膜，待高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

1.3.3色譜條件

色譜柱：ThermosyncronicC18（2.1mm×50mm，1.7μm）；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：5mmol/L乙酸銨-甲酸溶液和乙腈溶液梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4質(zhì)譜條件

霧化溫度650℃；氣簾氣（氮氣）流速：25Psi；噴霧電壓：5000V；霧化氣流速：65Psi；電噴霧離子源（ESI）（+）正離子模式；多反應監(jiān)測（multiplereactionmonitoring，MRM）模式；定性定量檢測的離子對、去簇電壓（declustering potential，DP）、碰撞能（collisionenergy，CE）、碰撞池出口電壓（collision cell exit potential，CXP）參數(shù)見表2。

表2　氰蟲酰胺、氟苯蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of cyantraniliprole，flubendiamide and chloranteraniliprole

1.3.5標準溶液的制備

100 mg/L標準儲備溶液的配制：準確稱取氰蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺標準品10.0 mg，分別用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標準儲備溶液，于4℃避光貯存。

標準工作溶液的配制：根據(jù)需要，臨用時吸取一定量的標準儲備溶液用5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈（9∶1，V/V）樣品溶解液稀釋，配制成適當濃度的標準工作液。

1.3.6定性定量方法

定性方法：對標準工作液及處理好的樣液按上述的檢測條件進行測定時，如果樣液的色譜峰保留時間與標準工作溶液一致（變化范圍在±2.5%之內(nèi)）；定量方法：根據(jù)樣液中被測物質(zhì)的含量，選定質(zhì)量濃度相近的混合標準工作溶液，對樣品溶液進行外標法定量，標準工作溶液和待測樣液中目標物質(zhì)的響應值均應在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。

2　結(jié)果與分析

2.1凈化條件的選擇

葡萄酒由于基質(zhì)成分較為復雜，檢測時存在較多干擾因素，尤其是一些可溶性色素和甾醇類物質(zhì)對色譜分離的效果和檢測靈敏度有較大影響，因此，前處理過程需對樣品進行適當?shù)膬艋?，以提高檢測靈敏度。農(nóng)藥殘留檢測的樣品凈化方法主要有液液萃取法［12］和固相萃取法［13-14］。其中液液萃取法主要是使用多種溶劑反復萃取，以使樣品達到分析要求，該類方法存在操作較為復雜、費時費力、有機溶劑使用量大等缺陷；自動固相萃取技術(shù)由于回收率高，溶劑用量少，操作方便等特點，近年來廣泛用于食品、飲料以及酒類產(chǎn)品中藥物殘留的測定［15-16］。本研究對比了PSA柱、C18柱、HLB柱以及GCB/NH2柱的凈化效果。結(jié)果表明，GCB/NH2柱能有效吸附基質(zhì)中的甾醇類物質(zhì)、色素以及酚類和芳香類物質(zhì)，可將樣品中的雜質(zhì)有效分離，雜峰干擾較少，凈化效果最佳。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對化合物的質(zhì)譜條件進行尋優(yōu)，母離子主要選擇［-H］、［+H］、［+NH4］等3個質(zhì)量數(shù)進行比較。本研究采用正負離子質(zhì)譜掃描模式，在混合標準溶液質(zhì)量濃度均為1 mg/L條件下，對氰蟲酰胺、氟苯蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺的質(zhì)譜條件進行優(yōu)化。掃描負離子模式，其母離子信號強度均在1×103左右，強度較低，不適合采用；在正離子模式下，分別掃描［+H］和［+NH4］的信號強度，3種物質(zhì)母離子強度均超過了1×107，但在碎片離子掃描模式下，氰蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺只有［+H］產(chǎn)生的子離子強度較穩(wěn)定。因此，經(jīng)過多方比較，最后選擇信號強且穩(wěn)定的m/z：474.9/285.9、474.9/177.0、483.9/452.9、483.9/285.9、683.0/408.0和683.0/273.9為定性離子對，其中信號較高的m/z：474.9/285.9、483.9/452.9和683.0/408.0為定量離子對。氰蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺的UPLC-MS/MS色譜圖見圖1。

圖1　氰蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺的UPLC-MS/MS色譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS chromatogram of cyantraniliprole，chlorantraniliprole and flubendiamide

2.3方法學考察

2.3.1線性方程和相關(guān)系數(shù)及測定低限

準確配制雙酰胺類系列標準溶液，質(zhì)量濃度分別為1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L。按照1.3中儀器條件進樣分析后，以峰面積（y）為縱坐標，氰蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，繪制工作曲線，結(jié)果見表3。由表3可知，3種雙酰胺類殺蟲劑的線性相關(guān)系數(shù)R均≥0.999 5，說明在質(zhì)量濃度1～20 μg/L范圍內(nèi)3種雙酰胺類呈良好的線性關(guān)系。對空白樣品進行加標回收試驗，根據(jù)信噪比S/N≥10為定量限（limitofquantitation，LOQ）和S/N≥3為檢出限（limit of detection，LOD）的參考規(guī)定，結(jié)合樣品處理過程中的稀釋倍數(shù)，計算各組分的方法檢出限分別為0.08 μg/kg、0.29 μg/kg和0.06 μg/kg，定量限分別為0.24 μg/kg、0.94 μg/kg和0.19 μg/kg。

表3　3種雙酰胺類殺蟲劑的相關(guān)系數(shù)、線性回歸方程、檢出限和定量限Table 3 Correlation coefficients，linear regression equations，LOD and LOQ of 3 kinds of diamides insecticides

2.3.2方法的準確度和精密度

以不含氰蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺的葡萄酒樣品為空白基質(zhì)，分別添加3個系列質(zhì)量濃度的待測物標準溶液，按照1.3節(jié)試驗方法測定，進行加標回收率試驗，重復測定6次，計算加標回收率及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表4。

表4　3種雙酰胺類殺蟲劑的加標回收率和精密度試驗結(jié)果（n=6）Table 4 Results of adding standard recovery rate and precision tests of 3 kinds of diamide insecticides（n=6）

由表4可知，以1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10.0 μg/kg添加水平測定回收率，葡萄酒中3種雙酰胺類殺蟲劑平均回收率為76.3%～91.1%，RSD為3.9%～9.8%，該方法的準確度較好、精密度較高。

2.4樣品的測定

應用本研究所建立的方法對10種葡萄酒樣品中3種雙酰胺類殺蟲劑進行檢測，結(jié)果表明，有一種樣品中檢出氰蟲酰胺0.12 mg/kg，2種樣品檢出氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺分別為0.08 mg/kg和0.17 mg/kg，其余葡萄酒樣品中均未檢出3種雙酰胺類殺蟲劑。

3　結(jié)論

本研究采用固相萃取和UPLC-MS/MS檢測技術(shù)相結(jié)合的方法測定葡萄酒中氰蟲酰胺、氟苯蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺等3種雙酰胺類殺蟲劑殘留量。結(jié)果表明，選用GCB/NH2固相萃取柱凈化，能有效地將樣品中的雜質(zhì)分離，雜峰干擾較少，凈化效果最佳。3種雙酰胺類殺蟲劑在質(zhì)量濃度1～20 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（R≥0.999 5），分別為0.08μg/kg、0.29μg/kg和0.06μg/kg，定量限分別為0.24μg/kg、0.94 μg/kg和0.19 μg/kg。以1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10 μg/kg添加水平測定平均回收率，范圍在76.3%～91.1%，相對標準偏差（RSD）在3.9%～9.8%。表明該方法凈化效果好、快速簡便、準確度較好、精密度較高，可為葡萄酒樣品中3種雙酰胺類殺蟲劑的同時測定提供參考依據(jù)。

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Determination of three kinds of diamides insecticides in wine by UPLC-MS/MS

ZHANG Yun1，CHENG Lijun1，HOU Jie1，CHEN Zeyu1，ZHU Haiyan2
（1.Sanming Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Sanming 365000，China；2.School of Resources and Chemical Engineering，Sanming Universtiy，Sanming 365000，China）

The detection method of three kinds of diamides insecticides（including cyantraniliprole，chlorantraniliprole，flubendiamide in wine）residual amount in wine was established by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.The three kinds of diamides insecticides in wine was extracted by acetonitrile，and the extracting solution was purified by GCB/NH2solid-phase extraction column，with acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate-methanoic acid as mobile phase，then determined by UPLC-MS/MS after gradient elute.The results showed that three kinds of diamides insecticides had a good linear relationship in the range of 1.2-12.0 μg/ml（R≥0.999 5）.The limit of detection of method was less than 1.0 μg/kg.With 1.0 μg/kg，2.0 μg/kg and 10 μg/kg as adding level，the average recovery rate was 76.3%-91.1%.The relative standard deviation（RSD）was 3.9%-9.8%，which indicated that the method was fast，simple，good purifying effect，good accuracy and high precision，could be applied to the simultaneous determination of three kinds of diamides insecticides in wine.

wine；diamide insecticide；UPLC-MS/MS；determination

O657.7

0254-5071（2016）09-0172-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.039

2016-05-18

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2015IK034）

張云（1984-），男，工程師，碩士，研究方向為食品農(nóng)獸藥殘留檢測。