同位素稀釋—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜法測定食用植物油中總氯丙醇脂肪酸酯

李珊 易青 苗虹 吳永寧

摘要建立了食用植物油中總氯丙醇脂肪酸酯（氯丙醇酯）的同位素稀釋氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）檢測方法。樣品經(jīng)甲醇鈉甲醇溶液水解，硅藻土小柱凈化，七氟丁酰咪唑（HFBI）衍生后，GCMS檢測，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。3MCPD酯、2MCPD酯、1，3DCP酯和2，3DCP酯在0.050～2.000 mg/L濃度范圍內(nèi)，均呈良好線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（R）均大于0.9995。3MCPD酯、2MCPD酯、1，3DCP酯和2，3DCP酯的檢出限分別為0.015， 0.015， 0.030和0.030 mg/kg，定量限分別為0.050， 0.050， 0.100和0.100 mg/kg。以空白特級(jí)初榨橄欖油為空白基質(zhì)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的平均回收率為87.0%～110.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10.1%。在74份食用植物油樣品中，3MCPD酯、2MCPD酯和1，3DCP酯的檢出率分別為94.6%， 63.5%和5.4%，未檢出2，3DCP酯；3MCPD酯、2MCPD酯和1，3DCP酯的含量分別在未檢出（ND）～10.646 mg/kg、ND～3.617 mg/kg和ND～0.089 mg/kg之間。本方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，適用于食用植物油中總氯丙醇酯的測定。

關(guān)鍵詞 食用植物油； 氯丙醇脂肪酸酯； 氣相色譜質(zhì)譜法； 同位素稀釋技術(shù)

1引言

氯丙醇脂肪酸酯（氯丙醇酯）是存在于含油脂食品中的一類污染物，是脂肪酸與氯丙醇的結(jié)合產(chǎn)物，包括單氯取代的3氯1，2丙二醇脂肪酸酯（3MCPD酯）和2氯1，3丙二醇脂肪酸酯（2MCPD酯），以及雙氯取代的1，3二氯2丙醇脂肪酸酯（1，3DCP酯）和2，3二氯1丙醇脂肪酸酯（2，3DCP酯）。已有動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，3MCPD酯在體內(nèi)經(jīng)腸脂肪酶水解后轉(zhuǎn)化為3MCPD[1，2]。毒理學(xué)資料表明，3MCPD具有遺傳毒性、腎臟毒性和神經(jīng)毒性[3～5]；2MCPD的結(jié)構(gòu)與3MCPD極其相似，其毒性以及可能引起的健康風(fēng)險(xiǎn)不容忽視；1，3DCP可導(dǎo)致小鼠肝臟和腎臟的損傷，2，3DCP對(duì)腎臟的損傷作用超過1，3DCP[6]。 Liu等[7]研究了3MCPD 棕櫚酸單酯和雙酯對(duì)瑞士小鼠的急性口服毒性以及對(duì)NRK52E 大鼠腎臟細(xì)胞的毒性，結(jié)果表明，3MCPD 棕櫚酸單酯和3MCPD棕櫚酸雙酯均可引起大鼠腎小管壞死、蛋白質(zhì)管型、生精小管的精子細(xì)胞減少等癥狀；3MCPD棕櫚酸單酯可引起大鼠腎臟細(xì)胞的細(xì)胞毒性，而雙酯則未發(fā)現(xiàn)引起細(xì)胞毒性的跡象，可見3MCPD 棕櫚酸單酯毒性強(qiáng)于其雙酯。

食品中氯丙醇酯的檢測方法包括間接測定法[8～10]（即氣相色譜質(zhì)譜法（Gas chromatographymass spectrometry，GCMS））和直接測定法[11，12]（即液相色譜質(zhì)譜法（Liquid chromatographymass spectrometry，LCMS））。GCMS方法應(yīng)用較為普遍，文獻(xiàn)報(bào)道的各種以GCMS測定氯丙醇酯的方法，絕大多數(shù)上是基于德國脂肪科會(huì)（DGF）的CVI 18（10）方法[13]，實(shí)驗(yàn)步驟（見圖1，以3MCPD酯為例）主要包括樣品水解、凈化、衍生。在已報(bào)道的氯丙醇酯的測定方法中，主要是針對(duì)3MCPD酯的測定。鑒于其它氯丙醇及氯丙醇酯的毒性作用，需對(duì)氯丙醇酯總量進(jìn)行測定。

氯丙醇酯主要是在食品加工過程中，尤其是在油脂精煉過程中形成的[14]，污染水平最高的是3MCPD酯[3]，其次是2MCPD酯。食用植物油是人類膳食的重要組成部分。食用植物油中氯丙醇酯污染水平較高[15，16]，由食用植物油引起的氯丙醇酯膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)也隨之增高，這使得氯丙醇酯成為近年來國際食品安全研究的重要熱點(diǎn)問題。在各種氯丙醇酯氣相色譜質(zhì)譜檢測的基礎(chǔ)上，本研究建立了同位素稀釋技術(shù)的固相支持液液萃取凈化GCMS方法測定食用植物油中氯丙醇酯總量的檢測方法，通過對(duì)74份食用植物油樣品的檢測和參加英國食品分析能力評(píng)價(jià)項(xiàng)目（FAPAS）國際比對(duì)考核，證明本方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確、可靠，為進(jìn)行食用植物油中氯丙醇酯的膳食暴露評(píng)估提供了有力的技術(shù)支持。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Agilent7890 GC5975C MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；MilliQ超純水器（美國Millipore公司）；G560E渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；NDO400型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）；氣密針（1 mL，澳大利亞SGS公司）；NEVAPTM 111型吹氮濃縮儀（美國Organomation Associates公司）。

3氯1，2丙二醇脂肪酸酯（3Monochloropropane1，2diol esters，3MCPD， 純度98%，德國Aldrich公司）；D53MCPD（純度>99%，德國DrEhrenstorfer公司）；雙氯取代的1，3二氯2丙醇脂肪酸酯（1，3Dichloropropan2olesters，1，3DCP），以及D51，3DCP，2，3DCP和D52，3DCP，純度均高于97%，購自美國Fluka公司；2MCPD、D52MCPD、3MCPD棕櫚酸雙酯、D53MCPD棕櫚酸雙酯、2MCPD硬脂酸雙酯和D52MCPD硬脂酸雙酯（純度均≥98%，加拿大TRC公司）；正己烷、乙酸乙酯（色譜純，美國J. T. Baker公司）；冰乙酸（色譜純，美國Tedia公司）；甲基叔丁基醚（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；七氟丁酰咪唑（HFBI，分析純，美國Alfa Aesar公司）；甲醇鈉（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；無水Na2SO4（優(yōu)級(jí)純，經(jīng)195℃烘烤4 h后使用，天津市津科精細(xì)化工研究所）。ChemElutTM硅藻土小柱（5 g，美國Agilent公司）。

植物油樣品采集于多個(gè)食用油脂生產(chǎn)加工企業(yè)；將未檢出氯丙醇酯的特級(jí)初榨橄欖油樣品作為空白基質(zhì)樣品。

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

氯丙醇及其氘代氯丙醇，氯丙醇酯及其氘代氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別準(zhǔn)確稱取各氯丙醇、各氘代氯丙醇酯、各氯丙醇酯、各氘代氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)品適量（精確至0.0001 g），置于不同的10 mL容量瓶中，以乙酸乙酯定容，分別制備成濃度為1000 mg/L（以氯丙醇計(jì)）的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于

Symbolm@@ 20℃儲(chǔ)存。將氯丙醇和氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用正己烷稀釋并定容，配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

分 析 化 學(xué)第44卷

第6期李 珊等： 同位素稀釋氣相色譜質(zhì)譜法測定食用植物油中總氯丙醇脂肪酸酯

2.3樣品前處理

2.3.1樣品水解準(zhǔn)確稱取0.1 g食用植物油樣品，分別加入濃度為10 mg/L的D53MCPD棕櫚酸雙酯內(nèi)標(biāo)使用液102 μL（相當(dāng)于0.2 μg，以D53MCPD計(jì)）、D52MCPD硬脂酸雙酯內(nèi)標(biāo)使用液116 μL（相當(dāng)于0.2 μg，以D52MCPD計(jì)）和濃度為10 mg/L 的D51，3DCP和D52，3DCP內(nèi)標(biāo)使用液20 μL，加入500 μL甲基叔丁基醚乙酸乙酯（8∶2， V/V），渦旋混勻，加入1 mL甲醇鈉甲醇溶液（0.5 mol/L），充分振蕩，反應(yīng)4 min后立即加入3 mL冰乙酸10% Na2SO4溶液（1∶29， V/V）和3 mL正己烷，充分渦旋振蕩，棄去上層有機(jī)相溶液。

2.3.2 樣品凈化及衍生化將下層水相溶液倒入ChemElutTM硅藻土小柱中，靜置10 min，加入15 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，在洗脫液中加入4 g無水Na2SO4，放置5 min 后，過濾至透明具塞玻璃試管中，于35℃氮吹至近干（約200 μL），用2 mL正己烷溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，待進(jìn)行衍生化反應(yīng)。用氣密針加入40 μL HFBI，立即密塞，渦旋混合20 s，于70℃恒溫箱中衍生20 min后，取出冷卻至室溫，加入10% Na2SO4溶液2 mL，渦旋混合30 s，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相， 并加入0.2 g無水Na2SO4除水后，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾于進(jìn)樣小瓶中，供GCMS測定。

2.4分析條件

2.4.1色譜條件 色譜柱：DB 5 MS UI 毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：50℃保持1 min，以2℃/min升至90℃，以40℃/min升至250℃，保持5 min；載氣：高純氦；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL；不分流進(jìn)樣。

2.4.2質(zhì)譜條件

離子化方式為電子轟擊（EI），能量70 eV；選擇反應(yīng)離子監(jiān)測；電子倍增器電壓1000 V； 離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；傳輸線溫度280℃；溶劑延遲8 min。

3結(jié)果與討論

3.1目標(biāo)化合物的方法學(xué)參數(shù)的確定

目標(biāo)化合物經(jīng)衍生上機(jī)測定后，目標(biāo)化合物衍生物的保留時(shí)間和主要質(zhì)譜參數(shù)見表1，質(zhì)譜裂解圖見圖2（以3MCPD為例）。

3.2內(nèi)標(biāo)的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[17，18]報(bào)道，食品中3MCPD棕櫚酸雙酯的污染水平較高，加之現(xiàn)可采購到商品化標(biāo)準(zhǔn)品，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇D53MCPD 棕櫚酸雙酯為內(nèi)標(biāo)。對(duì)于2MCPD酯的內(nèi)標(biāo)，只獲得商品化的D52MCPD硬脂酸雙酯。而對(duì)于1，3DCP酯和2，3DCP酯，由于暫不能獲得對(duì)應(yīng)的氘代脂肪酸酯，且鑒于其在食品中的污染水平較低，本實(shí)驗(yàn)暫以D51，3DCP和D52，3DCP分別代替D51，3DCP酯和D52，3DCP酯作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.3水解液萃取過程中萃取劑的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[9，13]報(bào)道，在氯存在時(shí)，縮水甘油酯可能轉(zhuǎn)化為氯丙醇酯，故本實(shí)驗(yàn)比較了20% NaCl， 10% NaCl， 20% Na2SO4和10% Na2SO4溶液作為萃取劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以2014年英國食品分析能力評(píng)價(jià)項(xiàng)目（Food analysis performance assessment scheme，F(xiàn)APAS）的食用植物油考核樣品（T2642，其中3MCPD酯的含量為0.579 mg/kg，縮水甘油酯的含量為0.583 mg/kg）和市售菜籽油為研究對(duì)象，用以上4種溶液按2.3節(jié)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行氯丙醇酯的測定（表2）。由表2可知，20% Na2SO4溶液作為萃取劑時(shí)，測定結(jié)果偏低，可能是萃取后下層水相溶液變渾濁，其中的懸浮物吸附了目標(biāo)化合物；對(duì)于含有0.583 mg/kg縮水甘油酯的T2642樣品， 20%NaCl溶液和10% NaCl溶液作為萃取劑地增加

會(huì)錯(cuò)誤

3MCPD酯的含量，即在樣品前處理過程中，由于使用了含氯試劑，使縮水甘油酯轉(zhuǎn)化為3MCPD酯[19]。由菜籽油樣品的測定結(jié)果可知，10% Na2SO4溶液作為萃取劑的效果更佳，且檢測結(jié)果表明該樣品中基本不含有縮水甘油酯。德國脂肪科學(xué)學(xué)會(huì)（DGF）的CⅥ18（10）方法[13]測定縮水甘油酯即是基于此原理。因此，考慮到食用植物油中可能含有縮水甘油酯，本研究采用10% Na2SO4溶液作為萃取劑。

3.4固相支持液液萃取條件的優(yōu)化

在氯丙醇酯的GCMS測定方法中，大多數(shù)以硅藻土進(jìn)行酯鍵斷裂水解液凈化的文獻(xiàn)[8，19，20]分別以正己烷為淋洗劑，乙醚為洗脫劑。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用10 mL正己烷去除油脂和省略此步驟對(duì)GCMS檢測基本無影響，且長期（兩周）連續(xù)實(shí)驗(yàn)及進(jìn)樣也不會(huì)對(duì)儀器的離子源造成明顯的污染，因此本實(shí)驗(yàn)中省略了正己烷淋洗的步驟。

文獻(xiàn)中采用無水乙醚作為萃取劑時(shí)[8，19，20]，雙氯丙醇酯的空白加標(biāo)回收率較低、響應(yīng)低，即影響方法的準(zhǔn)確度，又影響方法的靈敏度；而且乙醚對(duì)人體健康、環(huán)境及實(shí)驗(yàn)室安全均不利。本實(shí)驗(yàn)以空白特級(jí)初榨橄欖油樣品為基質(zhì)，比較了15 mL無水乙醚、15 mL乙酸乙酯、15 mL二氯甲烷、7.5 mL二氯甲烷和7.5 mL乙酸乙酯順序洗脫，以及15 mL乙酸乙酯二氯甲烷混合液（1∶1， V/V）作為萃取劑的固相支持液液萃取效果。由于本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，雖然有些萃取劑的萃取效果不佳，

但考慮到方法的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)以待測物的峰面積作為評(píng)價(jià)萃取效果的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，乙醚和二氯甲烷的萃取效率較其它3種萃取劑低，乙酸乙酯和二氯甲烷順序萃取對(duì)1，3DCP的萃取效率較低，而乙酸乙酯與乙酸乙酯二氯甲烷（1∶1， V/V）的萃取效率相當(dāng)。因此，實(shí)驗(yàn)最終選用乙酸乙酯為萃取劑。

3.5線性范圍及檢出限和定量限

在所確定的實(shí)驗(yàn)方法條件下，取氯丙醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（濃度分別為0.05， 0.1， 0.2， 0.4， 0.8， 1.6和2.0 mg/L，其中同位素內(nèi)標(biāo)濃度均為0.1 mg/L）各2 mL，經(jīng)HFBI衍生后，以GCMS測定。以氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)衍生物的色譜峰面積與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)衍生物的色譜峰面積之比為縱坐標(biāo)，氯丙醇與其對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在0.05～2.0 mg/L范圍內(nèi)，3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP和2，3DCP的衍生物均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.9995（表1）。當(dāng)樣品中的氯丙醇酯濃度超過上述線性范圍時(shí)，可以正己烷適當(dāng)稀釋樣品后再進(jìn)行檢測。

以空白特級(jí)初榨橄欖油樣品中添加4個(gè)濃度水平10， 15， 30和50 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)，以3倍信噪比（S/N=3）的響應(yīng)對(duì)應(yīng)的含量為檢出限，以空白加回收實(shí)驗(yàn)中的最低加標(biāo)水平為定量限。3MCPD酯和2MCPD酯的檢出限均為0.015 mg/kg，定量限均為0.050 mg/kg；1，3DCP酯和2，3DCP酯的檢出限均為0.030 mg/kg，定量限均為0.100 mg/kg（表1）。

3.6空白加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在0.05～1.0 mg/kg范圍內(nèi)，在空白特級(jí)初榨橄欖油樣品中分別添加4個(gè)不同濃度水平的3MCPD棕櫚酸酯、2MCPD硬脂酸酯、1，3DCP和2，3DCP的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.3和2.4實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，每個(gè)濃度水平做6 份平行樣品，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表3。由表3可知，4種氯丙醇酯的平均回收率在87.0%～110.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10.1%；空白加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

3.7本方法與不同氯丙醇酯檢測方法的比較

將本方法與采用間接法的美國油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)的AOCSCd 29c13方法[2]、德國脂肪協(xié)會(huì)的DGFCVI18（10）方法[13]和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行了比較，詳見表4。這5種檢測方法均是以食用植物油和油

脂作為研究對(duì)象，且樣品檢測的取樣量均為0.1 g；從方法的靈敏度來看，本方法的靈敏度最高，單氯丙醇酯的檢出限為0.015 mg/kg，雙氯丙醇酯的檢出限為0.030 mg/kg；就檢測的氯丙醇酯種類而言，方法4[8]和本方法采用HFBI衍生，能夠測定全部4種氯丙醇酯，而其它方法只能檢測3MCPD酯和/或2MCPD酯。與其它方法相比，本方法在操作簡單、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好以及方法的靈敏度方面亦具有一定的優(yōu)勢。

3.8實(shí)際樣品的測定

本方法參加了2014年9～10月FAPAS的食用植物油中氯丙醇酯的國際比對(duì)考核（T2642），并提交了3MCPD酯的測定結(jié)果0.705 mg/kg（在此次考核提交結(jié)果時(shí)，將測定值0.601 mg/kg以同批次的空白加標(biāo)回收率85.2%進(jìn)行了校正），最終發(fā)布的結(jié)果為T2642食用植物油考核樣品的統(tǒng)計(jì)值為0.579 mg/kg，本實(shí)驗(yàn)室的Z評(píng)分為1.1，成績合格，再次證明本方法的可靠性，其總離子流圖如圖4。

對(duì)采集的74份食用植物油樣品進(jìn)行氯丙醇酯的測定，3MCPD酯、2MCPD酯和1，3DCP酯的檢出率分別為94.6%， 63.5%和5.4%，含量范圍分別為ND～10.646 mg/kg、ND～3.617 mg/kg和ND～0.089 mg/kg， 未檢出2，3DCP酯（表5）。其中，棕櫚油、芝麻油和玉米油樣品中3MCPD酯和2MCPD酯檢出率為100%；除1份菜籽油、1份大豆油、1份花生油和1份橄欖油樣品中未檢出3MCPD酯，其余70份樣品中均檢出3MCPD酯；其中1份精煉稻米油樣品中3MCPD酯含量超過了10 mg/kg；大豆油和花生油樣品中3MCPD酯和2MCPD酯的污染水平較低；而茶籽油、稻米油、棕櫚油和部分菜籽油樣品中3MCPD酯和2MCPD酯污染水平較高，尤其是棕櫚油污染水平最高；橄欖油中3MCPD酯的污染水平最低，且未檢出2MCPD酯。在所有食用植物油品種中，棕櫚油是氯丙醇酯污染水平普遍較高的品種。

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