親水作用色譜—四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜快速測(cè)定水樣中氨基脲

謝冬冬 沈金燦 淮文蓓 卞學(xué)海??葉剛 康海寧

摘要建立了親水作用色譜四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜快速檢測(cè)水中氨基脲的方法。水樣中加入0.1 mol/L NaOH溶液后，以乙腈為提取劑，加入過量Na2SO4，使乙腈與水分層，乙腈提取液再經(jīng)無水Na2SO4脫水后，采用親水作用色譜柱Amide色譜柱分離，以0.1%甲酸水溶液及0.1%甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜電噴霧正離子、選擇離子監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，氨基脲在 0.2～20 μg/L濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)為0.997，方法的檢出限為0.09 μg/L，定量限為0.30 μg/L。以淡水和海水為空白樣品，在添加濃度為0.5， 1.0和5.0 μg/kg水平下，氨基脲的加標(biāo)回收率為 82.3%～92.0% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.6%。本方法適用于環(huán)境水樣中氨基脲的快速分析。

關(guān)鍵詞 親水作用色譜； 高分辨質(zhì)譜； 水樣； 氨基脲

1引言

氨基脲（Semicarbazide，SEM）屬于聯(lián)胺類化合物中的一種，它是一種重要的工業(yè)原料，可用于制備熱敏記錄紙上的光色染料，也用于醫(yī)藥、農(nóng)藥等有機(jī)合成的中間體[1]。研究表明， 它不僅具有致誘變性和潛在的致癌性，而且還可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能產(chǎn)生影響[2，3]。在日常生產(chǎn)活動(dòng)中多種因素容易導(dǎo)致SEM的產(chǎn)生，如某些含SEM工業(yè)廢水的排放，食品添加劑偶氮甲酰胺在高溫加工條件下分解產(chǎn)生SEM[4，5]，消毒水處理食物產(chǎn)生SEM[6，7]，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中非法使用呋喃西林藥物在動(dòng)物體內(nèi)也可代謝成為SEM[8，9]。由于SEM為水溶性物質(zhì)，各種途徑產(chǎn)生的SEM最終隨著環(huán)境進(jìn)入水體，SEM已逐漸成為環(huán)境中一種全新的環(huán)境污染物[10]。目前，檢測(cè)SEM的主要方法有膠體金免疫層析法[11]、酶聯(lián)免疫分析法[12]、高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法[8，13，14]等。膠體金免疫層析法和酶聯(lián)免疫法通常用于樣品的快速篩選，方法易受樣品基質(zhì)中類似物質(zhì)干擾而產(chǎn)生假陽性；最為常用的分析方法為高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測(cè)的樣品基質(zhì)包括動(dòng)物組織、嬰幼兒食品、甲殼類水產(chǎn)品等。由于SEM分子小、極性強(qiáng)，難以直接進(jìn)行分析，因此目前所報(bào)道的方法通常是先將樣品經(jīng)過2硝基苯甲醛長(zhǎng)時(shí)間衍生、衍生液經(jīng)有機(jī)溶劑提取、固相萃取柱凈化后，再通過反相液相色譜柱分離SEM衍生物，最后以電噴霧質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。該方法靈敏度高，能對(duì)樣品進(jìn)行確證檢測(cè)，但也存在樣品前處理十分繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)。由于SEM極性很強(qiáng)，在常規(guī)的反相色譜柱上沒有保留，質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)受基質(zhì)背景干擾嚴(yán)重，因此難以采用液相色譜電噴霧質(zhì)譜方法直接對(duì)SEM進(jìn)行檢測(cè)。

親水作用色譜技術(shù)[15，16]是近年來發(fā)展起來的新的分離手段，可以保留一些用反相色譜無法簡(jiǎn)單保留的堿性化合物，因此可以在不衍生的條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)強(qiáng)極性分子SEM與其它物質(zhì)的分離。四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱是一種高分辨質(zhì)譜技術(shù)，能夠提供化合物精確分子質(zhì)量測(cè)定， 實(shí)現(xiàn)化合物的快速定性與定量分析[17]，非常適于復(fù)雜基質(zhì)中化合物的快速分析，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和食品安全領(lǐng)域中小分子和大分子的快速測(cè)定[18～20]。采用親水作用色譜高分辨質(zhì)譜技術(shù)直接對(duì)SEM進(jìn)行測(cè)定尚未見報(bào)道。本研究通過采用親水作用色譜技術(shù)，并結(jié)合四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，建立了一種環(huán)境水樣中SEM的靈敏檢測(cè)方法，適用于環(huán)境水樣中痕量SEM污染物的快速分析。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

QExactive四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó) Thermo Fisher 公司），Dionex UltiMate 3000液相色譜（美國(guó) Thermo Fisher 公司）；XBrige Amide液相色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國(guó)Waters公司）。

氨基脲鹽酸鹽和13C15N標(biāo)記的氨基脲同位素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%， 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Merck公司）；甲酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；無水Na2SO4 （分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；NaH2PO4（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；實(shí)驗(yàn)用水由MilliQ 純水儀制備。

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

SEM標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確稱取2.0 mg SEM鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，即得200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，

Symbolm@@ 18℃保存。SEM同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確稱取2.0 mg SEM同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，即得200 mg/L 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液， Symbolm@@ 18℃保存。用乙腈逐級(jí)稀釋SEM與其同位素標(biāo)準(zhǔn)品，獲得所需濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

樣品處理：取2.0 mL水樣，加入40 μL 5.0 mol/L NaOH溶液使其濃度為0.1 mol/L，溶解混勻后加入適量SEM同位素內(nèi)標(biāo)溶液使其濃度為5 μg/L，再往混合溶液中加入1.0 mL乙腈，漩渦振蕩2 min，然后加入1.0 g無水Na2SO4，振蕩提取10 min，然后以10000 r/min離心5min，取上層清液至15 mL離心管中，再加入0.2 g無水Na2SO4脫水，取上層清液于進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

2.4色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析條件

色譜柱：Waters XBridgeTM Amide 色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm）；柱溫：30 ℃； 流速：250 μL/min； 流動(dòng)相：A為0.1% （V/V）甲酸溶液，B為0.1%（V/V）甲酸乙腈溶液； 進(jìn)樣量：20 μL； 分析時(shí)間：12 min。梯度洗脫條件為： 0～5 min，20%～40% A； 5～6 min，40% A； 6～6.5 min，40%～20% A； 6.5～12 min，20% A。

電噴霧離子源； 離子源溫度： 320℃； 傳輸金屬毛細(xì)管溫度： 350℃； 噴霧電壓： 3500 V； 掃描模式為： TaegetedSIM，采用正離子掃描模式； 質(zhì)譜分辨率為70000； Ctrap 最大容量（AGC target） ： 5×104； Ctrap最大注入時(shí)間： 100 ms； 鞘氣35 unit，輔助氣10 unit，掃描分析時(shí)間為12 min。SEM的精確質(zhì)量數(shù)76.05054，13C15NSEM（同位素標(biāo)準(zhǔn)品）的精確質(zhì)量數(shù)為79.04871。

3結(jié)果與分析

3.1色譜分離

SEM分子上帶有多個(gè)氨基（圖1插圖），極性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)反相色譜柱（C18）進(jìn)行分離，化合物完全沒有保留。近年來發(fā)展的親水相互作用液相色譜技術(shù)被認(rèn)為是對(duì)傳統(tǒng)反相色譜方法的有效補(bǔ)充[15，16]，它集成了反相液相色譜、正相液相色譜和離子色譜的優(yōu)點(diǎn)，特別適合于極性化合物的分離分析。為此，實(shí)驗(yàn)選擇Amide色譜柱（氨基柱）作為分離柱，通過優(yōu)化條件其對(duì)SEM有較好的保留。

流動(dòng)相的pH值及組成對(duì)化合物能否在色譜柱上得到有效分離至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)表明，在中性條件下，SEM未能在色譜柱上得到有效保留。由于SEM上帶有氨基，其在酸性條件下能夠質(zhì)子化，這有利于其在氨基柱上的保留，因此采用含有0.1%甲酸的水相及有機(jī)相作為流動(dòng)相。在保持同樣的梯度洗脫條件下，實(shí)驗(yàn)比較了甲醇和乙腈兩種不同有機(jī)相組成對(duì)SEM分離的影響（圖1）。如圖1A所示，以甲醇作為有機(jī)相，化合物保留較弱，峰型差，質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)弱； 相對(duì)于甲醇，采用乙腈流動(dòng)相（圖1B），化合物保留得到顯著增強(qiáng)，保留時(shí)間由原來的2.5 min增加到3.7 min，并且峰形得到明顯改善，其質(zhì)譜信號(hào)也相應(yīng)得到明顯提高，信號(hào)強(qiáng)度是甲醇的46倍。因此，本實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸（A）0.1%甲酸/乙腈（B）作為流動(dòng)相體系。

3.2質(zhì)譜檢測(cè)條件的優(yōu)化

由于SEM分子上帶有多個(gè)氨基，在酸性條件下極容易質(zhì)子化而帶上正電荷，因此采用正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。SEM分子小（分子量為75），實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用目前常用的選擇離子監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行檢測(cè)，在低于10 μg/L時(shí)均無法到明顯的質(zhì)譜信號(hào)，這可能是由于其本身分子體積小碰撞后難以獲得高豐度的碎片，故靈敏度差。由于環(huán)境水樣中的SEM含量低 [10]，通常在μg/L水平，

因此采用該方法無法實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境水樣的有效監(jiān)測(cè)。采用質(zhì)譜的選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式，由于低質(zhì)量端的干擾物質(zhì)較多，因此采用低分辨質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，其背景響應(yīng)值高，信噪比低，檢測(cè)的靈敏度差； 而通過提高質(zhì)譜的分辨率，可以有效較少其它化合物的干擾，降低背景的信號(hào)值，從而提高目標(biāo)物質(zhì)的信噪比。如圖2A所示，采用低分辨率的四極桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，在同等液相條件下，即使在20 μg/L濃度下，在SEM出峰位置（3.7 min）檢測(cè)不到明顯的信號(hào)，但是在其出峰位置附近（保留時(shí)間3.0 min）有一個(gè)很大的干擾峰，該干擾峰在空白溶劑樣品中也存在，由此可知，采用低分辨質(zhì)譜不僅靈敏度低，而且無法排除干擾容易造成誤判； 從圖2B可見，通過采用四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜（質(zhì)譜分辨率為70000）， 3.0 min處的干擾峰消失了，并且基線水平由104降低至102水平，從而大大提升了信噪比，其信噪比達(dá)513，實(shí)現(xiàn)了SEM的高靈敏檢測(cè)。故本實(shí)驗(yàn)采用四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（分辨率70000），實(shí)現(xiàn)了對(duì)SEM的靈敏檢測(cè)。

3.3樣品前處理?xiàng)l件的選擇

根據(jù)3.1節(jié)結(jié)果，在乙腈溶液中，SEM能夠得到較好的分離與檢測(cè)，因此選擇乙腈作為提取劑。SEM的pKa=10.8，在堿性條件下，可以抑制分子上的氨基質(zhì)子化，使其極性變?nèi)?，從而有利于被有機(jī)溶液萃取。實(shí)驗(yàn)采用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，以NaOH為pH值調(diào)節(jié)劑，考察pH（6～13）對(duì)SEM提取的影響。由圖3可見，pH<11時(shí)，SEM基本不能被乙腈提?。ㄌ崛⌒?10%），隨著pH值增加，提取效率快速增長(zhǎng)，pH>13后，提取率趨于穩(wěn)定。SEM為酰胺類物質(zhì)，溶液堿性太強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致其水解。因此實(shí)驗(yàn)最終確定通過在樣品中加入NaOH溶液，并使其濃度為0.1 mol/L（pH≈13），使SEM能被乙腈有效提取。

親水作用色譜分離體系對(duì)于樣品溶液的含水量非常敏感[21]，少量水即可導(dǎo)致色譜峰型變差，影響樣品的分離。對(duì)于乙腈提取液雖然已經(jīng)通過鹽析作用使乙腈層與水層得到分離，但提取液中依然含有少量水，因此需要在提取液中再加入少量無水Na2SO4進(jìn)行二次脫水，以避免水分對(duì)分離的影響。

3.4工作曲線及檢出限

在最佳測(cè)定條件下測(cè)定系列SEM的標(biāo)準(zhǔn)溶液， 其濃度分別為0， 0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0， 10.0和20.0 μg/L，用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，以定量離子的峰面積與同位素內(nèi)標(biāo)的峰峰面積（y）對(duì)含量（x） 進(jìn)行線性回歸計(jì)算，結(jié)果表明在0.2～20.0 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.07312x+0.007655（R2=0.997），以3倍信噪比（S/N=3）作為方法的檢出限（LOD）、10倍信噪比（S/N=10）作為方法的定量限（LOQ），測(cè)得SEM的LOD為0.09 μg/L、LOQ為0.30 μg/L。

以陰性淡水和海水為空白樣，添加水平分別為0.5， 1.0和5.0 μg/L，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6個(gè)樣品，進(jìn)行回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)試，結(jié)果如表1所示。方法的回收率為82.3%～92.0%， RSD<7.6%。林黎明等[8]采用衍生法結(jié)合固相萃取高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定動(dòng)物組織中呋喃西林代謝物SEM，樣品需經(jīng)過衍生16 h，其檢出限為0.5 μg/kg， 回收率為78.9%～85.1%。 本方法的回收率與其相當(dāng)，但靈敏度更高，且分析時(shí)間短（約1 h），可以滿足環(huán)境水樣的快速、準(zhǔn)確測(cè)定的要求。

3.5實(shí)際水樣SEM的測(cè)定

采集深圳地區(qū)不同位置的3份海水樣品及3份河流水樣運(yùn)用本方法進(jìn)行檢測(cè)，在其中1份河水樣品檢測(cè)出SEM含量0.81 μg/L，海水樣品中未檢出SEM。

4結(jié) 論

采用親水作用液相色譜四極桿/軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合同位素質(zhì)譜定量技術(shù)，建立了快速測(cè)定水樣中痕量SEM污染物的新方法。與目前所報(bào)道的高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法相比，本方法更為快速、簡(jiǎn)便，可滿足環(huán)境中水中痕量SEM的污染分析。

References

1YANG JiChun， WU Qiao， FAN YuJie， LI XueJian， LIU ChangLing. Agrochemicals， 2010， 49（11）： 781-786

楊吉春， 吳 嶠， 范玉杰， 李學(xué)建， 劉長(zhǎng)令. 農(nóng)藥， 2010， 49（11）： 781-786

2Choudhary G， Hansen H. Chemosphere， 1998， 37（5）： 801-843

3GAO Su， RU ShaoGuo. Research of Environmental Sciences， 2013， 26（6）： 637-644

高 素， 汝少國(guó). 環(huán)境科學(xué)研究， 2013， 26（6）： 637-644

4Adam B， Benjamin PY L， David L， Stephen W S. J. Agric. Food Chem.， 2004， 52 （18）： 5730-5734

5Ye J， Wang X H， Sang Y X， Liu Q. J. Agric. Food Chem.， 2011， 59 （17）： 9313-9318

6Hoenicke K， Gatermann R， Hartig L. Food Addit. Contam.， 2004， 21（6）： 526-537

7SHEN JinCan， XIE DongDong， KANG HaiNing， ZHENG ZongKun， ZHAO FengJuan， WANG ZhiWei. Chinese J. Food. Sci.， 2015， 10（36）： 1-5

沈金燦， 謝冬冬， 康海寧， 鄭宗坤， 趙鳳娟， 王之維. 食品科學(xué)， 2015， 10（36）： 1-5

8LIN LiMing ， LIN HuiChun， LIU XinTong， WANG ManXia， ZHANG HongWei， WANG JianHua， QIU Fang. Chinese J. Anal. Chem.， 2005， 33（5）： 707-710

林黎明， 林回春， 劉心同， 王曼霞， 張鴻偉， 王建華， 邱 芳. 分析化學(xué)， 2005， 33（5）： 707-710

9Kevin M C， Jeanne V S， Laura P， Christopher T E D. Glenn K. Anal. Chim. Acta， 2007， 592（1）： 64-71

10XU YingJie， SUN YuZeng， SONG XiuKai， TIAN XiuHui， GONG XiangHong， ZHANG XiuZheng， ZHANG LiMing. Oceanologia Et Limnologia Sinica， 2010， 14（4）： 538-542

徐英江， 孫玉增， 宋秀凱， 田秀慧， 宮向紅， 張秀珍， 張利民. 海洋與湖沼， 2010， 14（4）： 538-542

11XIANG JunJian， WANG WuZhou， TANG Yong， YANG HongYu. Chinese J. Food. Sci.， 2009， 30（20）： 291-295

向軍儉， 王五洲， 唐 勇， 楊紅宇. 食品科學(xué)， 2009， 30（20）： 291-295

12Vass M， Diblikova I， Cernoch I， Franek M. Anal. Chim. Acta， 2008， 608（1）： 86-94

13Souza S V C， Junqueira R G， Ginn R. J. Chromatogr. A， 2005， 1077（2） ： 151-158

14YU HongJuan， LI Bing， CAI YouQiong， YE FangTing， TAI JianMing， HUI YunHua， XU Jie， FENG Bing. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（10）： 1530-1535

于慧娟， 李 冰， 蔡友瓊， 葉芳挺， 臺(tái)建明， 惠蕓華， 徐 捷， 馮 兵. 分析化學(xué)， 2012， 40（10）： 1530-1535

15WANG Lian， YANG BiXia， ZHANG XinShen， ZHENG HongGuo， RAN LiangJi. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（5）： 714-722

王 煉， 楊碧霞， 張新申， 鄭洪國(guó)， 冉良驥. 分析化學(xué)， 2015， 43（5）： 714-722

16Olsen B A. J. Chromatogr. A， 2001， 913（12）： 113122

17Jia W， Chu X， Chang J， Zhang F. J. Chromatogr. A， 2015， 1406（8）： 337-341

18Noelia L G， Roberto R G， Patricia P B， José LM V， Antonia G F. Food Chem.， 2015， 173（4）： 607-618

19Jia J， Chen Y， Jiang Y， Li Z， Zhao L， Zhang J， Tang J， Feng L， Liang C， Xu B， Gu P， Ye X. Res. Microbiol.， 2015， 166（8）： 618-625

20Xu M， Frelon S， Simon O， Lobinski R， Mounicou S. Talanta， 2015， 128（10）： 187-195

21ZHANG Ming， TANG FangLiang， FANG XiaoKai， XU JianFen， CHEN Feng， WU ZhiXu. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（10）： 1555-1560

張 明， 唐訪良， 范曉開， 徐建芬， 陳 峰， 吳志旭. 分析化學(xué)， 2012， 40（10）： 1555-1560