Lactobacillusparacsei L9冷凍保護劑的優(yōu)化

李讓，武永超，葛紹陽，桑躍，劉松玲，任發(fā)政，崔建云，趙亮*

1(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083) 2(教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室，北京，100083)

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LactobacillusparacseiL9冷凍保護劑的優(yōu)化

李讓1，武永超1，葛紹陽1，桑躍2，劉松玲2，任發(fā)政1，崔建云1，趙亮1*

1(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083) 2(教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室，北京，100083)

副干酪乳桿菌L9(LactobacillusparacseiL9)是1株具有突出益生功能及生產(chǎn)性能的益生菌菌株，現(xiàn)階段高性能發(fā)酵劑的制備是其成功應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。而液氮深冷技術(shù)是高性能發(fā)酵劑制備的有效手段，其中保護劑的應(yīng)用是液氮深冷工藝的關(guān)鍵因素。該研究以菌種存活率作為評價指標，在已有研究基礎(chǔ)上對液氮深冷保護劑種類進行篩選，對保護劑濃度進行正交優(yōu)化，并確定菌體與保護劑最佳混合比例。結(jié)果表明脫脂乳粉、果糖、海藻酸鈉及Vc四種保護劑能對副干酪乳桿菌L9 起到良好的保護作用；通過正交實驗優(yōu)化了保護劑配方：脫脂乳粉質(zhì)量分數(shù)為10%，果糖質(zhì)量分數(shù)為5%，海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為5%，Vc質(zhì)量分數(shù)為0.075%，可使菌體冷凍后存活率達到(92.23±0.86)%，顯著提高在凍藏過程中菌體的存活率(P<0.05)，較好地優(yōu)化了LactobacillusparacseiL9發(fā)酵劑的制備技術(shù)，并為實際的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

液氮深冷；保護劑優(yōu)化；副干酪乳桿菌L9

副干酪乳桿菌L9(LactobacillusparacseiL9)分離自健康人腸道，益生功能突出。已有研究證明L9具有調(diào)節(jié)免疫[1]，緩解過敏[2]，改善健康人群腸環(huán)境等功能[3]，是極具潛力的益生菌。同時L9發(fā)酵性能優(yōu)良[4]，具有廣闊的應(yīng)用及開發(fā)前景。

發(fā)酵劑的制備是益生菌應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)，傳統(tǒng)的發(fā)酵劑制備方法主要是采用真空冷凍干燥的方法，但存在設(shè)備復(fù)雜、生產(chǎn)成本較高、菌種存活率低及發(fā)酵劑投料后復(fù)活時間較長等問題[5]。因此發(fā)酵劑制備工藝的改善及發(fā)酵劑活力的提高成為發(fā)酵劑研究的重要目標。液氮深冷發(fā)酵劑制備方式因操作簡便、處理過程中菌體損傷較小、菌體復(fù)活速度快、活力高等優(yōu)勢成為極具潛力的發(fā)酵劑制備新技術(shù)[6]。發(fā)酵劑制備工藝中保護劑的選擇是影響發(fā)酵劑性能的關(guān)鍵因素。根據(jù)保護劑的作用機理，可以分為滲透性保護劑，半滲透保護劑，非滲透保護劑及抗氧化保護劑，不同作用類型保護劑的有效組合成為提高保護劑性能的重要手段。

本研究在已有研究基礎(chǔ)上進一步深入，依據(jù)保護劑的常用類型，采用單因素試驗確定不同類型中的有效保護劑[7]，通過正交實驗對保護劑組成及濃度進行優(yōu)化，獲得最佳保護劑配方，并進一步確定菌體與保護劑的最佳配比。通過研究獲取最佳保護劑應(yīng)用方案，提高發(fā)酵劑中LactobacillusparacaseiL9的存活率及菌株工業(yè)化生產(chǎn)效率。

1　材料與方法

1.1菌種

LactobacillusparacaseiL9 (CGMCC No.9800)，由教育部北京市共建功能乳品實驗室分離保藏。

1.2材料

MRS培養(yǎng)基；甘油、二甲基亞礬(天津市登峰化學(xué)試劑廠)；海藻酸鈉、果糖、海藻糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇(北京世紀華林科技有限公司)；工業(yè)用脫脂乳粉、淀粉、酵母粉、纖維素、β-環(huán)糊精(新西蘭OCC公司)；Vc、Cys、L-Glu(國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司)；液氮(中科院半導(dǎo)體研究所)；其他試劑為化學(xué)純試劑。

1.3主要設(shè)備(表1)

表1　實驗儀器與設(shè)備

1.4菌株培養(yǎng)

將保藏的菌種接種至液體MRS培養(yǎng)基活化2代，鏡檢培養(yǎng)液菌體形態(tài)，將活化好的菌種以接種量1%(107CFU/mL)接種至1 L培養(yǎng)瓶，37 ℃培養(yǎng)12 h，4 000 r/min離心10 min，收集菌泥。

1.5液氮深冷直投式發(fā)酵劑制備流程

按照表2及表3所示比例將保護劑加入菌泥，振蕩搖勻，得到的菌體與保護劑混合液，通過顆粒炸蒸法[8]，用無菌滴管取1 mL混合液滴入裝有液氮的離心管中，形成球狀顆粒，倒掉液氮，發(fā)酵劑顆粒保存于-80℃超低溫冰箱。

表2　保護劑單因素篩選水平設(shè)計

1.6菌株計數(shù)

冷凍后取出冷凍濃縮物，每管加入9 mL生理鹽水，室溫融化，搖勻，進行10倍梯度稀釋，于MRS瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h計數(shù)。

1.7細菌存活率計算

細胞存活率/%=深冷處理后樣品測得的活菌總數(shù)/深冷處理前樣品測得的活菌總數(shù)×100

1.8數(shù)據(jù)分析

采用Excel及SPSS對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

2　結(jié)果與分析

2.1保護劑的單因素篩選

保護劑按照類型可主要分為滲透性保護劑、半滲透保護劑、非滲透性保護劑及抗氧化保護劑[9]。本實驗在已有分類的基礎(chǔ)上，選擇不同類型保護劑，通過單因素試驗進一步探究甘油、二甲基亞砜、海藻糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、脫脂乳粉、淀粉、酵母粉、纖維素、β-環(huán)糊精、Vc、Cys及L-Glu保護劑在冷凍過程中對菌體的保護效果。

2.1.1滲透性保護劑

如圖1所示，在滲透性保護劑中選取常用的甘油與DMSO(二甲基亞砜)，相比空白對照組，甘油對菌種的保護效果更為明顯。甘油屬于小分子物質(zhì)，易與溶液中的水分子水合，增加溶液黏性，阻礙水的結(jié)晶過程，可對菌種細胞起到保護作用，而DMSO作用效果不明顯，可能是由于對菌種產(chǎn)生了毒害作用[10]。

圖1　滲透性保護劑對冷凍后菌體存活率的影響Fig.1　The effect of the permeable protective agent on viable count after freezing帶有相同字母代表各組菌體存活率沒有顯著性差異(P > 0.05)

有研究表明，甘油可較好地滲透到細胞內(nèi)部，其羥基與細胞內(nèi)大分子形成氫鍵，在缺水條件下仍能保證生物體中的蛋白質(zhì)、碳水化合物及脂肪等大分子化合物保持原有結(jié)構(gòu)，利于與水緊密結(jié)合，防止細胞過多脫水，并能阻止細胞內(nèi)大冰晶形成，較好的維持生物活性。但考慮到后續(xù)需對菌體進行冷凍干燥處理，而甘油無法凍干，因此滲透性的保護劑不予添加。

2.1.2半滲透性保護劑

由圖2可知，半滲透性保護劑可對菌體起到較好保護作用。單糖果糖的效果最好，天然多糖海藻酸鈉其次，整體上糖類保護劑效果優(yōu)于醇類保護劑。

圖2　半滲透性保護劑對冷凍后活菌數(shù)的影響Fig.2　The effect of semi permeable protective agent on viable count after freezing帶有相同字母代表各組菌體存活率沒有顯著性差異(P> 0.05)

果糖為低分子半滲透性保護劑，能夠進入細胞膜，在溶液中與水分子強烈結(jié)合，增加溶液黏性。在低溫條件下，溶液內(nèi)冰晶的增長速度減緩，水轉(zhuǎn)化為冰的效率降低，在一定程度上減弱了由于細胞外溶質(zhì)濃度升高所導(dǎo)致的細胞膜系統(tǒng)損傷。同時，由于低分子保護劑能夠進入細胞，升高細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，使細胞內(nèi)外壓力相近，細胞外結(jié)冰引起的細胞脫水皺縮的程度減輕，從而降低了低溫細胞造成的損傷[11]。

天然多糖海藻酸鈉在已有的研究中，廣泛用于保護劑及微膠囊壁材中[12]，具有成膜黏性及網(wǎng)狀類似蜂窩狀的孔隙結(jié)構(gòu)，有較高的機械強度，可在菌體表面設(shè)置屏障，阻擋外界冷熱等不良因素的破壞，保證菌體在極端條件下有較高存活率[13]。

2.1.3非滲透性保護劑

由圖3可知，非滲透性保護劑中，脫脂乳粉的保護效果最好，而其他保護劑的保護效果不顯著。

圖3　非滲透性保護劑對冷凍后菌體存活率的影響Fig.3　The effect of non permeable protective agent on viable count after freezing帶有相同字母代表各組菌體存活率沒有顯著性差異(P> 0.05)

脫脂乳粉含有較高比例的大分子物質(zhì)，可在細胞表面形成保護層，增加細胞周圍溶液的黏性，抑制冰晶的生成，從而保護細胞使其免受冰晶的引起的機械損傷[9]。同時脫脂乳中含的蛋白質(zhì)對菌體有較好地保護作用，可以取代其他添加物大分子的作用，因此在保護劑的配方優(yōu)化中，選取脫脂乳粉作為主要影響因素。

2.1.4抗氧化保護劑

LactobacillusparacseiL9是兼性厭氧菌，易受具有氧化作用的因子影響。因此保護劑中需要加入抗氧化成分，由圖4可知，Vc的保護效果高于Cys和L-Glu。

圖4　抗氧化保護劑對冷凍后菌體存活率的影響Fig.4　The effects of antioxidant protective agent on viable count after freezing帶有相同字母代表各組菌體存活率沒有顯著性差異(P > 0.05)

根據(jù)單因素實驗結(jié)果最終選取脫脂乳粉、果糖、海藻酸鈉及Vc作為保護劑主要因素。

2.2正交實驗優(yōu)化配方濃度

為進一步選取最優(yōu)配方濃度，設(shè)計四因素三水平正交試驗，在已有研究基礎(chǔ)上選取脫脂乳粉質(zhì)量分數(shù)為：5%、10%、15%；果糖質(zhì)量分數(shù)為：2.5%、5%、7.5%； 海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為：2.5%、5%、7.5%；Vc質(zhì)量分數(shù)為：0.025%、0.05%、0.075%；實驗因素及水平設(shè)計如表3所示，結(jié)果如表4所示。

表3　正交分析因素與水平

表4　正交設(shè)計數(shù)據(jù)及結(jié)果

從表4中可以看出，因素水平不同造成試驗指標的變異RA=11.10，RB=3.30，RC=10.13,RD=4.02。所以保護劑最佳搭配方式為A2B2C2D3，通過正交實驗及驗證實驗確定最佳配方為脫脂乳粉10%，果糖5%，海藻酸鈉5%，Vc 0.075%，冷凍后菌體存活率達到(92.23±0.86)%，顯著提高了冷凍過程中菌體的存活率(P< 0.05)。

2.3保護劑配比優(yōu)化

為獲得更好保護效果，進行保護劑對菌泥的質(zhì)量倍數(shù)的優(yōu)化。由圖5可知，添加保護劑可對菌體起到較為明顯地保護作用，隨著保護劑倍數(shù)的增加，活菌數(shù)出現(xiàn)了先增加，后減小的趨勢，結(jié)合相關(guān)研究推斷，保護劑倍數(shù)較少時，滲透及半滲透型保護劑不能充分進入細胞內(nèi)部與溶劑相作用，影響對細胞的保護效果；非滲透型保護劑在部分細胞的表面覆蓋程度不夠，從而影響外部保護結(jié)構(gòu)的建立，在冷凍時細胞保護的機械強度不夠，從而引起菌體存活率下降；而保護劑倍數(shù)過高，對細胞易產(chǎn)生一定程度的毒害作用，同時較厚的保護劑包裹對細胞的通透性影響較大，也易對細胞存活率產(chǎn)生影響[14]。本實驗確定保護劑對菌泥的質(zhì)量倍數(shù)為6倍時保護效果最好。

圖5　保護劑對菌泥的質(zhì)量倍數(shù)對冷凍后菌體存活率的影響Fig.5　The effect of the mass ratio of protective agent to bacterial sludge on viable count after freezing帶有相同字母代表各組菌體存活率沒有顯著性差異(P> 0.05)

2.4保護劑效果驗證

2.4.1冷凍后的菌體存活率

采用實驗優(yōu)選保護劑配方及最佳配比，將添加保護劑的與未添加保護劑的直投發(fā)酵劑同時進行液氮深冷處理，采用梯度稀釋倒板的方式進行活菌計數(shù)，計算菌體的存活率，以冷凍處理前的菌液進行對照，結(jié)果如圖6所示。

圖6　保護劑菌體存活率的影響Fig.6　The effect of protective agent ratio on viable count after freezing帶有不同字母代表各組菌體存活率有顯著性差異(P< 0.05)

加入保護劑的菌液在液氮深冷處理后，存活率可達(95.32±1.11)%，顯著高于未加保護劑的實驗組(P<0.05)，可說明實驗獲得的保護劑配方可用于液氮深冷法制備直投式發(fā)酵劑，可保證較高的菌體存活率。

2.4.2冷凍后菌體產(chǎn)酸性能

將添加保護劑的與未添加保護劑的直投發(fā)酵劑同時進行液氮深冷處理，以2%的接種量接入脫脂乳中，用滴定酸度的方式研究其產(chǎn)酸特性，以冷凍處理前的菌液作為對照。結(jié)果如圖7所示，加入保護劑的發(fā)酵劑產(chǎn)酸曲線與未添加保護劑的相比產(chǎn)酸能力有了一定的提高，說明保護劑可以起到一定程度對菌種產(chǎn)酸性能的保護作用。與冷凍處理前的菌液產(chǎn)酸能力相比，較為接近。說明本保護劑可使得液氮深冷方式制備的發(fā)酵劑在產(chǎn)酸能力上維持在較理想的水平。

圖7　保護劑對深冷發(fā)酵劑產(chǎn)酸能力的影響Fig.7　The effect of protective agent ratio on acid producing after freezing

3　討論

為研究液氮深冷發(fā)酵劑耐儲藏性能，將制得的直投式發(fā)酵劑置于-80 ℃冰箱中儲藏3個月，對儲藏過程中發(fā)酵劑的菌體存活率和產(chǎn)酸能力進行測定。結(jié)果顯示在3個月的儲藏過程中，菌體的存活率及產(chǎn)酸能力均未發(fā)生顯著變化，說明保護劑可使液氮深冷法制備的發(fā)酵劑在儲藏過程中保持較好的發(fā)酵穩(wěn)定性[15]。同時優(yōu)化保護劑后液氮深冷法制備發(fā)酵劑的菌體存活率可達(93.72%±4.24)%，顯著高于傳統(tǒng)真空冷凍干燥法(77.58±5.33)%，且其產(chǎn)酸性能也顯著高于真空冷凍干燥法[15]。

本研究采用的液氮深冷制備技術(shù)，具有操作簡便、菌種的存活率高、能耗小等優(yōu)點，為發(fā)酵劑的制備提供了更高效便捷的制備方式。本文對保護劑種類進行篩選，確定脫脂乳粉、果糖、海藻酸鈉及Vc四種保護劑對LactobacillusparacseiL9在液氮中的處理起到良好的保護作用；借助正交實驗及驗證實驗對保護劑濃度進行優(yōu)化，確定保護劑配方為脫脂乳粉質(zhì)量分數(shù)為10%，果糖質(zhì)量分數(shù)為5%，海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為5%，Vc質(zhì)量分數(shù)為0.075%；確定保護劑對菌泥的質(zhì)量倍數(shù)為6 倍時，保護效果最佳。液氮深冷發(fā)酵劑的儲存期試驗證明，在為期3個月-80 ℃條件下的儲藏過程中，優(yōu)化保護劑的發(fā)酵劑可以保持穩(wěn)定活性；相較于傳統(tǒng)真空冷凍干燥工藝較好地提高了菌種存活率及產(chǎn)酸性能。優(yōu)化的LactobacillusparacseiL9液氮深冷保護劑配方，可顯著提高在凍藏過程中菌體的存活率及發(fā)酵穩(wěn)定性(P<0.05)，提高菌株工業(yè)化生產(chǎn)效率。

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The optimization of cryogenic protectant forLactobacillusparacaseiL9

LI Rang1, WU Yong-chao1, GE Shao-yang1, SANG Yue2,LIU Song-ling2, REN Fa-zheng1,CUI Jian-yun1, ZHAO Liang1*

1(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)2(Key Laboratory of Functional Dairy Co-constructed by Ministry of Education and Beijing Government,Beijing 100083,China)

LactobacillusparacseiL9 was a probiotic strain with health benefit and productive performances. The preparation of high-performance starter was the key technology for successful application in industrial production. To improve starter's activity, the liquid nitrogen cryogenic treatment was employed in the preparation of starter cultures, and protective agents were important to strain activity during the liquid nitrogen cryogenic process. The optimal formula of cryoprotectant was determined by single-factor experiments. Then the concentration of preferred cryoprotectant was optimized by orthogonal test. The definitive protection formulations wereω(skim milk powder) 10%,ω(fructose) 5%,ω(alginate) 5%, andω(Vc) 0.075%. The viability of bacteria cells could reach (92.23±0.86)% after freezing with our cryoprotectant. It indicated that the optimized cryoprotectant could improve the viability of L9 cells during the freezing and storage process.

liquid nitrogen freeze；LactobacillusparacaseiL9； the optimization of anti-freeze

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608012

碩士研究生(趙亮副教授為通訊作者)。

中央在京高校重大成果轉(zhuǎn)化項目“益生菌生產(chǎn)關(guān)鍵科技成果轉(zhuǎn)化中”。

2016-01-16，改回日期：2016-03-25