牛膝醇提物對兔骨關節(jié)炎模型的療效比較

陳達　廖州偉　馬篤軍　王立新　彭力平廣州中醫(yī)藥大學深圳臨床醫(yī)學院廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東深圳518033

牛膝醇提物對兔骨關節(jié)炎模型的療效比較

陳達廖州偉馬篤軍王立新彭力平▲
廣州中醫(yī)藥大學深圳臨床醫(yī)學院廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東深圳518033

目的比較牛膝醇提物（AEAB）與硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因對于兔骨關節(jié)炎（OA）的療效。方法將35只實驗兔采用隨機區(qū)組分組法分為正常組、模型組、AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組，每組7只。石膏固定制動6周制備OA模型，造模后，分別以蒸餾水、AEAB、硫酸氨基葡萄糖及雙醋瑞因灌胃，正常組不予處理，6周后處死實驗兔，取軟骨標本進行大體觀察、Pelletier評分、Mankin評分，用免疫組化測定軟骨Ⅱ型膠原蛋白含量，用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清和關節(jié)液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）以及基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的含量。結果AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組Pelletier評分、Mankin評分、Ⅱ型膠原蛋白含量、血清和關節(jié)液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量分別與正常組、模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；AEAB組與硫酸氨基葡萄糖組及雙醋瑞因組比較，上述指標差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。結論AEAB可以促進兔OA模型的軟骨修復，其療效與硫酸氨基葡萄糖及雙醋瑞因相當，具有較高的臨床應用價值。

牛膝醇提物；骨關節(jié)炎；硫酸氨基葡萄糖；雙醋瑞因；療效

［Abstract］Objective To compare the effects of alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix（AEAB），glucosamine sulfate and Diacerein in the treatment of rabbits with osteoarthritis（OA）.Methods With blocked randomization，thirtyfive experimental rabbits were divided into normal group，model group，AEAB group，glucosamine sulfate group，Diacerein group，with 7 rabbits in each group.The OA models were established by immobilizing rabbits，knees with plaster cast for 6 weeks，and distilled water，AEAB，glucosamine sulfate，Diacerein were respectively given by lavage after modeling.Normal group was not treated.The experimental rabbits were killed six weeks later，and the cartilage samples were taken to perform gross observation，Pelletier score，Mankin score，and the typeⅡcollagen was measured by immunohistochemistry method and the tumor necrosis factor alpha（TNF-α），interleukin-1β（IL-1β）and matrix metalloproteinase-3（MMP-3）in serum and joint fluid were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method. Results There were all statistically significant differences of Pelletier score，Mankin score，content of typeⅡcollagen，TNF-α，IL-1β and MMP-3 in AEAB group，glucosamine sulfate group，Diacerein group compared with normal group and model group respectively（P＜0.05 or P＜0.01），while there were no statistically significant differences in aforementioned indexes among AEAB group，glucosamine sulfate group and Diacerein group respectively（all P＞0.05）. Conclusion AEAB can promote the cartilage repair in rabbits with OA，and it has equivalent effects with glucosamine sulfate and Diacerein，so it has high value in clinical application.

［Key words］Alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix；Osteoarthritis；Glucosamine sulfate；Diacerein；Effects

骨關節(jié)炎（OA）是以關節(jié)軟骨退行性變?yōu)楹诵牟±砀淖兊穆躁P節(jié)疾病，硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因作為治療OA的西藥代表，可以預防OA的進一步發(fā)展和促進軟骨修復［1-2］。目前有研究證實［3］，部分中藥也有促進軟骨修復的作用。本課題組前期實驗表明，牛膝醇提物（AEAB）能增加兔關節(jié)軟骨細胞增殖［4-5］。本研究進一步探討了AEAB促進軟骨修復的機制，并比較了其與硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因對OA的療效，希望為臨床應用AEAB治療OA提供依據(jù)和指導。

1　材料與方法

1.1實驗動物

健康新西蘭兔35只，兔齡2～3個月，體重（1.86± 0.52）kg，雌雄不限，由廣東省實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（粵）2014-0035；動物飼料許可證號：SCXK（粵）2013-0002。本研究遵循了單位、地區(qū)以及國家所制訂的有關實驗動物保護和使用的指南，并經(jīng)實驗動物倫理委員會批準。

1.2實驗藥物及試劑

硫酸氨基葡萄糖（信東生技股份有限公司提供，批號：7KB0102，國藥產(chǎn)品注冊證號：HC20120036）；雙醋瑞因（昆明積大制藥股份有限公司提供，批號：國藥準字J201000150，進口藥品注冊證號：H20100350）；AEAB（深圳市中醫(yī)院提供，批號：20150731）；Rabbit腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）Kit（貨號：AE90301Rb）、Rabbit白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA Kit、（貨號：AE90731Rb）、Rabbit基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）ELISA Kit（貨號：3460）由AMEKO公司提供；免疫組化第一抗體Anti-Collagen TypeⅡ由德國默克密理博公司提供（貨號：CP18-100UGCN）。

1.3 AEAB的制備

依據(jù)《中國藥典》［6］浸漬法制備：每毫升醇提液相當于含原材料1 g。

1.4實驗方法

1.4.1實驗分組健康新西蘭兔35只，適應性喂養(yǎng)1周后采用隨機區(qū)組分組法進行分組，分為正常組、AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組、雙醋瑞因組及模型組，每組各7只，一兔一籠進行標準喂養(yǎng)，每天觀察實驗兔的食量、大小便、活動度、步態(tài)及精神狀況。

1.4.2造模方法參考曾俊華等［7］的實驗研究進行造模：將兔右膝關節(jié)用棉墊包裹好后于伸直位管型石膏固定制動6周，每天記錄實驗兔肢端血液循環(huán)及石膏穩(wěn)定度情況，若發(fā)現(xiàn)石膏松動脫落，立即重新打制石膏固定，若發(fā)現(xiàn)石膏過緊，肢端血液循環(huán)差、掉毛、皮膚壞死及潰瘍等情況，立即用石膏剪調(diào)整石膏松緊度。

1.4.3藥物干預參照藥理試驗中動物與人體間的等效劑量進行換算：結合體重按相應劑量用蒸餾水稀釋成10 mL后連續(xù)灌服6周：牛膝組：1 mg/（kg·d）；硫酸氨基葡萄糖組：77 mg/（kg·d）；雙醋瑞因：5.1 mg/（kg·d），每天灌胃2次，模型組：蒸餾水10 mL，每天灌胃2次；正常組不予處理。

1.4.4 ELISA法檢測血清和關節(jié)液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量自兔耳緣靜脈取血10 mL，取血清。將兔麻醉，造模膝關節(jié)剪毛、消毒，用l mL生理鹽水沖洗關節(jié)腔，抽出沖洗液，3000 r/min離心10 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。待所有標本均采集完畢后，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量，具體操作嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

1.4.5關節(jié)軟骨常規(guī)病理學檢測灌胃6周后將全部實驗兔以空氣栓塞法處死，將右膝關節(jié)上下1.0～1.5 cm處用銳器切斷，整塊取下股骨髁部和脛骨平臺，首先按Pelletier原則［8］進行關節(jié)軟骨大體形態(tài)學觀察評分，分值越高說明軟骨退變越嚴重；將一部分軟骨標本處理后進行免疫組化染色，測定Ⅱ型膠原蛋白表達含量情況，用陽性百分率表示；然后將另一部分軟骨標本行HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)變化，采用改良Mankin法［9］對結構、細胞、染色以及潮線的完整性進行評分，評分越高說明軟骨退變越嚴重。

1.5統(tǒng)計學方法

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用成組設計的q檢驗；組織病理學評分則采用Kruskal-Wallis法檢驗組間差異；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1動物一般情況

實驗期間有2只實驗兔有腹瀉癥狀，予土霉素灌胃1～2 d后均好轉；其余實驗兔健康狀況良好。

2.2軟骨組織大體觀察、Pelletier評分、HE染色、Mankin評分

正常組軟骨結構未見異常，軟骨細胞數(shù)目正常，軟骨細胞呈圓形，散在分布，基質(zhì)染色呈淺紅色，潮線結構穩(wěn)定；模型組軟骨表面可見不規(guī)則裂隙達輻射層，軟骨細胞數(shù)目減少、結構紊亂，伴炎癥細胞浸潤，可見簇集樣細胞團形成，局部基質(zhì)染色變淺，局部可見多重潮線；AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組局部軟骨表面可見不規(guī)則裂隙達鈣化層，軟骨細胞數(shù)量增多，基質(zhì)染色呈淺紅色，潮線結構稍正常（圖1）。Pelletier評分和Mankin評分在正常組與模型組，以及正常組、模型組分別與AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05），在AEAB組與硫酸氨基葡萄糖組及雙醋瑞因組組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖1　各組兔軟骨組織HE染色結果（100×）

表1　各組Pelletier評分、Mankin評分比較（分，x±s）

2.3免疫組化測定Ⅱ型膠原蛋白表達含量

正常組Ⅱ型膠原蛋白表達含量與模型組比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組提示Ⅱ型膠原表達量增加，結構紋理清晰，三組與正常組及模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。三組兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見圖2（封三）、表2。

表2　各組Ⅱ型膠原蛋白表達含量比較（%，x±s）

2.4各組血清和關節(jié)液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量比較

正常組血清和關節(jié)液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量與模型組比較，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；模型組分別與AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組比較，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），表明三者對兔OA均有較好的治療效果；AEAB組與硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），表明AEAB的治療效果與硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因相當。見表3～4。

表3　各組血清中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量比較（μg/L，x±s）

表4　各組關節(jié)液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量比較（μg/L，x±s）

3　討論

目前OA的發(fā)病機制尚不十分明確，研究表明，軟骨破壞以Ⅱ型膠原和蛋白多糖破壞丟失最明顯［10］，而軟骨基質(zhì)中的主要成分Ⅱ型膠原對維持軟骨的生物力學起決定性作用［11］。相關研究表明各種炎性因子在OA發(fā)病過程中起到重要作用［12］。近年研究提示MMPs對關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)的損傷是OA發(fā)病的“共同通路”［13-14］。MMP-3是MMPs的主要成員之一，其不僅能降解多種基質(zhì)蛋白底物，更為重要的是MMP-3可激活MMP-1、MMP-9、MMP-13等酶原產(chǎn)生級聯(lián)放大效應，加速軟骨破壞［15］。IL-1β和TNF-α是已經(jīng)被證實在OA的發(fā)病中起到重要介導作用的炎性因子［16-17］，具有抑制軟骨合成、加快關節(jié)軟骨降解的作用。

牛膝作為中藥治療OA中較為突出的一味，吸引了許多學者對其作用機制進行研究。本課題組前期實驗表明，牛膝能增加兔關節(jié)軟骨細胞增殖，提高軟骨Ⅱ型膠原表達，促進骨髓源成體干細胞軟骨分化［4-5］。李成付等［11］通過實驗證實AEAB能降低軟骨CKIP-1、Caspase-3蛋白表達，提高Bcl-2/Bax/Akt蛋白表達，從而促進軟骨修復。

OA動物模型構建的方法有很多種，石膏固定制動制備OA模型，具有簡單易行、無創(chuàng)傷、成功率高等特點，重要的是此法沒有手術創(chuàng)傷的干擾，其病理改變更接近人類OA的發(fā)病過程［18］，適用于研究藥物療效及藥物對關節(jié)軟骨成分、炎癥介質(zhì)表達等方面的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，AEAB組軟骨細胞數(shù)量及Ⅱ型膠原蛋白含量較模型組增多，Pelletier評分和改良Mankin評分明顯降低，軟骨基質(zhì)結構紋理變整齊，同時發(fā)現(xiàn)AEAB能降低血清及關節(jié)液中MMP-3、IL-1β、TNF-α的含量，從而減輕其對關節(jié)軟骨基質(zhì)的損害，直接或間接改善軟骨基質(zhì)代謝，促進軟骨修復，其效果和硫酸氨基葡萄糖及雙醋瑞因無明顯差異，說明AEAB與目前治療OA的西藥代表藥物療效相當，可為其臨床使用提供參考及依據(jù)。但是，硫酸氨基葡萄糖與雙醋瑞因存在胃腸道、過敏甚至心血管系統(tǒng)、外周水腫等不良反應［19-20］，而牛膝不但對OA有較好的治療效果，而且根據(jù)現(xiàn)代藥理研究［21］，牛膝還有增強免疫力、保肝、護肝、強心、抑制腫瘤轉移等許多有益健康的作用，而其副作用目前尚無報道，因此本研究認為AEAB具有較高的臨床應用價值，同時，其有效成分的篩選、中西藥聯(lián)合應用的療效以及干預方式的優(yōu)化等尚待進一步探索。

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Effects comparison of alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix in the treatment of rabbits with osteoarthritis

CHEN DaLIAO ZhouweiMA DujunWANG LixinPEND Liping▲
Shenzhen Clinical Medical College Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangdong Province，Shenzhen518033，China

R684.3

A

1674-4721（2016）09（a）-0021-04

2016-05-02本文編輯：張瑜杰）

廣東省深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目（醫(yī)療衛(wèi)生類）（201501041）。