降解煙堿細(xì)菌K9發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

王麗萍 岳耀穩(wěn) 張仲友

摘要 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)法篩選出K9菌株培養(yǎng)基中的最佳碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源和關(guān)鍵無(wú)機(jī)鹽因子，然后用正交試驗(yàn)確定無(wú)機(jī)鹽的最佳含量，最后用旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法確定培養(yǎng)基中可溶性淀粉、蛋白胨及硝酸銨的最佳濃度，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的優(yōu)化。利用Design Expert軟件進(jìn)行分析，得到各因素的最佳水平值為可溶性淀粉35.0 g/L、蛋白胨5.14 g/L、硝酸銨3.73 g/L，活菌數(shù)達(dá)到32.4×108 cfu/mL，比優(yōu)化前提高了4.4倍。通過(guò)研究?jī)?yōu)化出的發(fā)酵培養(yǎng)基為今后降解煙堿菌劑的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 煙草節(jié)桿菌K9；發(fā)酵培養(yǎng)基；降解煙堿菌劑；響應(yīng)面分析法

中圖分類號(hào) S572；S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）09-0289-03

據(jù)科學(xué)研究分析，煙草煙霧中含有的有毒有害成分高達(dá)數(shù)百種，包括煙堿、煙焦油、氧化碳、放射性物質(zhì)等，同時(shí)煙草中還含有丙烯醛、氰化鉀、甲醛、鎳、汞、砷、氨、鎘等對(duì)人體有致命危害的成分[1-2]。煙堿（尼古?。┦菬煵葜兄饕飰A，卷煙中的尼古丁含量大約為1 mg/支。其具有神經(jīng)毒性，煙堿對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)具有刺激作用，同時(shí)具有一定的麻痹作用，少量攝入煙堿會(huì)產(chǎn)生興奮感，而大量攝入則會(huì)影響大腦皮質(zhì)的神經(jīng)活動(dòng)，導(dǎo)致暈眩、嘔吐等不良癥狀，使人的智力減退；煙堿會(huì)引起血管的痙攣癥狀，還會(huì)改變胃液的酸堿度；煙堿可刺激交感神經(jīng)，引起血管內(nèi)膜損害；并且因煙堿會(huì)增加血液黏度而使血管收縮，增加發(fā)生心臟病的幾率，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致煙堿中毒死亡。研究表明，成年人攝入煙堿量為40～60 mg即可致死。若將1支雪茄煙或3支香煙所含有的尼古丁注入人的靜脈內(nèi)，3～5 min即可致死。因此，煙草制品中的煙堿含量對(duì)吸煙者的健康影響較大。與此同時(shí)，煙堿還具有令人可畏的成癮性，包括生理成癮性和心理成癮性。生理成癮性是指人體在吸入煙草煙霧后，其中的煙堿經(jīng)過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入大腦，刺激腦部受體而釋放出引起大腦興奮的多巴胺，而隨著刺激的增加，受體的敏感性降低，需要越來(lái)越多的煙堿的刺激才能產(chǎn)生興奮，導(dǎo)致人體對(duì)煙草的依賴性增加。若停止吸煙，則血液中煙堿含量降低，導(dǎo)致興奮度降低，生理快感降低，從而使人體產(chǎn)生一系列諸如頭疼、焦慮、煩躁等不適癥狀，即產(chǎn)生戒斷綜合征，這也是戒煙難度較大的重要原因之一。

本文主要研究煙草節(jié)桿菌K9對(duì)于煙堿的降解培養(yǎng)基優(yōu)化條件。煙草節(jié)桿菌K9[3]是降解煙堿的高效菌株，用NB培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草節(jié)桿菌K9時(shí)，細(xì)胞濃度僅能達(dá)到7.4×108 cfu/mL左右，故為提高菌體濃度，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化，以獲得高濃度的煙草節(jié)桿菌K9。研究以易于細(xì)菌生長(zhǎng)的改良培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，利用單因素實(shí)驗(yàn)法對(duì)煙堿節(jié)桿菌的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽生長(zhǎng)強(qiáng)化因子進(jìn)行篩選，為研制煙草降堿菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況

本研究于2015年在安徽皖南煙葉有限責(zé)任公司技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試菌株為煙草節(jié)桿菌K9，為云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施

先利用單因素實(shí)驗(yàn)方法篩選出K9的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽離子，再利用響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，從而得出培養(yǎng)基最佳成分和濃度。然后進(jìn)一步用響應(yīng)面法中的旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，以獲得菌株生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 降堿菌K9在NB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

以活菌數(shù)為衡量標(biāo)準(zhǔn)，每隔3 h取樣1次，將樣品稀釋涂平板，培養(yǎng)48 h，檢測(cè)活菌數(shù)，繪制降堿菌K9在NB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線（圖1），可以看出降堿菌K9在NB培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)48 h，在0～9 h為菌體的延滯期，菌體生長(zhǎng)9 h之后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體濃度迅速增長(zhǎng)，42 h左右達(dá)到最高，為35×108 cfu/mL，48 h之后進(jìn)入衰亡期。

2.2 降堿菌K9最適培養(yǎng)基的篩選

2.2.1 不同碳源、氮源對(duì)降堿菌生長(zhǎng)的影響。不同碳源對(duì)降堿菌K9生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)表1，可知最佳碳源為可溶性淀粉，菌濃度達(dá)到7.30×108 cfu/mL。不同氮源對(duì)降堿菌的影響結(jié)果見(jiàn)表2，可知最佳有機(jī)氮源為蛋白胨，菌濃度達(dá)到4.97×108 cfu/mL。最佳無(wú)機(jī)氮源為硝酸銨，菌濃度達(dá)到6.94×107 cfu/mL。而不添加氮源物質(zhì)時(shí)降堿菌的生長(zhǎng)情況最差，菌濃度僅為1.00×106 cfu/mL。因此，選定可溶性淀粉、蛋白胨和硝酸銨作為最佳的碳源、氮源進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)[1-4]。

2.2.2 不同無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)降堿菌生長(zhǎng)的影響。

（1）無(wú)機(jī)鹽單因子篩選。通過(guò)對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的8種無(wú)機(jī)鹽離子進(jìn)行逐一篩選發(fā)現(xiàn)不同無(wú)機(jī)鹽離子的有無(wú)對(duì)降堿菌生長(zhǎng)的影響各不相同。從表3可知，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽離子中無(wú)K2HPO4時(shí)菌濃度最小，為2.35×103 cfu/mL，說(shuō)明該無(wú)機(jī)鹽對(duì)降堿菌的生長(zhǎng)影響最大，同理分別缺少ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O、MnSO4·5H2O時(shí)對(duì)降堿菌的生長(zhǎng)影響較大。而缺少CuSO4和NaCl時(shí)對(duì)降堿菌的生長(zhǎng)基本沒(méi)有影響。因此，影響降堿菌生長(zhǎng)的無(wú)機(jī)鹽離子有K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O。然后用正交試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步確定每種無(wú)機(jī)鹽的含量[5-9]。

（2）正交試驗(yàn)確定無(wú)機(jī)鹽的含量。通過(guò)對(duì)不同無(wú)機(jī)鹽離子進(jìn)行篩選，選取影響降堿菌生長(zhǎng)的6種無(wú)機(jī)鹽離子作為優(yōu)化因素，每個(gè)因素選取5個(gè)水平，以菌濃度為優(yōu)化指標(biāo)按表4進(jìn)行L25（56）的正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由效應(yīng)曲線圖可以看出K2HPO4和MgSO4·7H2O 2種物質(zhì)的含量沒(méi)有達(dá)到最大值。

（3）2種主要無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行篩選。選取K2HPO4的含量分別設(shè)4個(gè)水平，MgSO4·7H2O的含量分別設(shè)3個(gè)水平如表5所示。然后加入5%的可溶性淀粉和3%的硝酸銨制成100 mL的培養(yǎng)液，并調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，裝入250 mL的三角瓶中。滅菌后分別接入8%的50 mL菌懸液在150 r/min的搖床上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[10-12]。

由表5中結(jié)果可知，2種無(wú)機(jī)鹽的最佳組合為K2HPO4 0.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.125 g/L，此時(shí)菌濃度為3.13×106 cfu/mL，遠(yuǎn)大于其他組合。因此，無(wú)機(jī)鹽離子的最佳濃度為K2HPO4 0.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.125 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g/L，CaCl2 0.005 g/L。

2.2.3 響應(yīng)面分析優(yōu)化煙草節(jié)桿菌K9培養(yǎng)基。進(jìn)行K9菌體濃度多元二次模型方程的建立及檢驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了20組試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表6。

表6中，x1=（X1-25）/10；x2=（X2-5）/2；x3=（X3-5）/2。

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得K9菌體濃度的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

Y=35.14-3.37x1+0.69x2-1.06x3-0.46x1x2-3.09x1x3-0.69 x2x3-2.87x12-5.63x22-1.70x32

式中，Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值，x1、x2、x3分別為可溶性淀粉、蛋白胨以及硝酸銨的編碼值。由K9菌體濃度的二次多項(xiàng)式回歸方程得出K9的菌體濃度預(yù)測(cè)值（表6），方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，該模型極顯著（P<0.000 1），失擬項(xiàng)在α=0.1水平上不顯著，模型的校正確定系數(shù)RAdj2=0.984 7，表明模型能解釋煙草節(jié)桿菌K9菌體濃度響應(yīng)值的變化。

3 結(jié)論與討論

我國(guó)烤煙煙堿的平均含量為3%～4%，不同部位的煙葉中上部煙葉的煙堿含量最高，因而在葉組配方中一般因其煙堿含量較高而難以應(yīng)用。近年來(lái)，隨著消費(fèi)者對(duì)自身健康的關(guān)注度提高，對(duì)于煙草的煙堿含量也有較高的要求。目前卷煙產(chǎn)品正在逐漸向低煙堿含量的方向發(fā)展，并且已經(jīng)出現(xiàn)了許多降低煙草中煙堿含量的技術(shù)方法，包括一些農(nóng)業(yè)技術(shù)措施及煙葉浸提法等，但是上述降低煙堿含量的技術(shù)方法在實(shí)施過(guò)程中也降低了煙草的綜合品質(zhì)，而應(yīng)用微生物降解煙堿技術(shù)則具有高效且負(fù)面作用小的特點(diǎn)，因此研究利用微生物降低煙葉中的煙堿對(duì)于國(guó)內(nèi)煙草業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

本研究通過(guò)對(duì)菌體在NB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定發(fā)現(xiàn)在NB培養(yǎng)基中菌體的延滯期時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間也較長(zhǎng)，考慮到菌體的最佳生長(zhǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一般為42 h，為了節(jié)省細(xì)菌培養(yǎng)所需要的時(shí)間以及培養(yǎng)細(xì)菌材料的使用，本試驗(yàn)采用制作菌懸液直接接入改良培養(yǎng)基中對(duì)碳氮源進(jìn)行篩選。本次試驗(yàn)得到煙堿節(jié)桿菌的最佳培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽離子（K2HPO4 0.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.125 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g/L，CaCl2 0.005 g/L）+35.0 g/L可溶性淀粉+5.14 g/L蛋白胨+3.73 g/L硝酸銨。在優(yōu)化試驗(yàn)條件下，得出K9菌體濃度為32.4×108 cfu/mL，比優(yōu)化前用NB培養(yǎng)基得到的菌濃度（7.4×108 cfu/mL）提高了4.4倍，從而為研究真空冷凍干燥降煙堿菌劑奠定了基礎(chǔ)。

由于煙堿的毒性較高，作為高毒性的化合物，能夠有效降解煙堿的微生物種類不多。根據(jù)目前的研究結(jié)果，能夠有效降解煙堿的菌類主要包括煙草節(jié)桿菌、爭(zhēng)論產(chǎn)堿菌、球形節(jié)桿菌、噬煙堿節(jié)桿菌、惡臭假單胞菌、纖維單胞菌等，同時(shí)有相關(guān)報(bào)道稱部分蒼白桿菌屬的細(xì)菌由于可以破壞芳香化合物的結(jié)構(gòu)而具有降解煙堿的作用，但相關(guān)驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果未見(jiàn)報(bào)道，其降解煙堿的具體機(jī)理、作用及安全效果有待進(jìn)一步研究。利用部分煙堿降解微生物能夠代謝煙堿的生物特點(diǎn)，可以有效降低卷煙以及生活環(huán)境中的煙堿含量，全球各地的科研工作者已經(jīng)開(kāi)展了大量的相關(guān)研究，包括對(duì)代謝煙堿微生物的種類、代謝途徑、分子生物學(xué)原理及酶學(xué)進(jìn)行深入研究。自然界中的煙堿代謝微生物能夠以煙堿作為碳源與氮源，其代謝過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的生理、生化過(guò)程，主要包括吡啶途徑、吡咯途徑、脫甲基化途徑、吡啶途徑與吡咯途徑的混合途徑等，不同的微生物種類其代謝途徑也不同，并且據(jù)最新研究發(fā)現(xiàn)仍然存在未知的煙堿代謝途徑，有待進(jìn)一步探明。微生物對(duì)煙堿進(jìn)行代謝的過(guò)程主要在于煙葉的醇化過(guò)程，不僅能降低煙堿的含量，減少刺激性，還能夠增加煙草的香氣，從而提高煙草的安全性。因此對(duì)降解煙堿微生物的研究意義顯著[13-20]。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 李梅云.煙堿的微生物降解研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2006，26（3）：94-97.

[2] 馬林，張峻松，曾曉鷹，等.產(chǎn)煙堿脫氫酶菌株節(jié)桿菌Z3的發(fā)酵條件研究[J].煙草科技，2007（10）：61-64.

[3] 袁勇軍，陸兆新，別小妹，等.DN2菌降解煙堿的動(dòng)力學(xué)及其應(yīng)用研究[J].中國(guó)生物工程雜志，2006（3）：52-55.

[4] 萬(wàn)虎，趙海剛，宋紀(jì)真，等.高濃度煙堿降解菌的篩選、鑒定及降解特性[J].煙草科技，2009（4）：51-54.

[5] 雷麗萍，夏振遠(yuǎn)，郭榮君，等.降煙堿節(jié)桿菌發(fā)酵條件研究[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2006（3）：48-50.

[6] 李玨，趙建新，田豐偉，等.一株降煙堿細(xì)菌的篩選、鑒定及降解特性研究[J].中國(guó)生物工程雜志，2007（11）：87-90.

[7] 李雪梅，陳育如，駱躍軍，等.兩株芽胞菌對(duì)煙草廢料煙堿與綠原酸降解的研究[J].生物加工過(guò)程，2005（4）：61-64.

[8] 袁勇軍，陸兆新，黃麗金，等.煙堿降解細(xì)菌的分離、鑒定及其降解性能的初步研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2005（2）：52-54.

[9] 楊虹琦，周冀衡，羅澤民，等.微生物和酶在煙葉發(fā)酵中的應(yīng)用[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（1）：65-68.

[10] 王春利，羅昭標(biāo)，寇霄騰，等.煙堿的微生物代謝研究進(jìn)展[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011（4）：32-36.

[11] 楊艷坤，席宇，張廣樂(lè)，等.微生物降解尼古丁的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2010（4）：84-89.

[12] 袁勇軍，陸兆新，戚向陽(yáng).菌株DN2對(duì)煙草薄片制備液中煙堿的降解[J].生物工程學(xué)報(bào)，2009（6）：104-109.

[13] 侯軼，李友明，胡松青.煙草薄片生產(chǎn)廢水中煙堿的厭氧降解及反硝化強(qiáng)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009（9）：274-278.

[14] 金云峰，王莎莎，張建波，等.生長(zhǎng)溫度對(duì)烤煙生物堿含量及煙堿代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2016（3）：128-140.

[15] 王威威，席飛虎，楊少峰，等.煙草煙堿合成代謝調(diào)控研究進(jìn)展[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2016（1）：64-69.

[16] 李文正，宋中邦，高玉龍，等.煙堿合成分子調(diào)控研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（14）：51-53.

[17] 周通，謝曉陽(yáng)，徐波，等.降解煙堿細(xì)菌的分離·篩選及初步鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（36）：204-206.

[18] DEWEY R E，SIMINSZK Y B，BOWEN S W，et al.煙堿N-脫甲基酶基因的功能描述[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2007（3）：21.

[19] 徐曉燕，孫五三，李章海.煙堿的生物合成及控制煙堿形成的相關(guān)因素[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（5）：103-104.

[20] 龍章德，韋方立，李俊芳，等.一株高濃度煙堿降解菌的篩選、分離和初步鑒定[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2013（5）：57-60.