韭菜單倍體培養(yǎng)技術(shù)研究

李冰冰

摘要 為了改變傳統(tǒng)育種方式，采用組培方式培育新品種，是近年來(lái)采用的新育種手段。韭菜單倍體培養(yǎng)采用以花藥為培養(yǎng)材料，選擇合適的培養(yǎng)基以及冷處理、暗培養(yǎng)、適宜的溫度、濕度、光照，培育出健壯的瓶苗，繼而移入大田，進(jìn)行繼代繁殖，從中選育出優(yōu)良品種。試驗(yàn)結(jié)果表明，可通過(guò)花藥培養(yǎng)成功誘導(dǎo)出花粉植株。

關(guān)鍵詞 韭菜；組培；單倍體；培養(yǎng)基

中圖分類號(hào) S633.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）09-0067-01

韭菜是百合科多年生草本生植物，適應(yīng)性強(qiáng)，性喜冷涼，抗旱耐熱，全國(guó)各地到處都有栽培。原產(chǎn)亞洲東南部，中國(guó)韭菜品種資源十分豐富。韭菜無(wú)論從營(yíng)養(yǎng)價(jià)值還是藥用價(jià)值，都具有很好的市場(chǎng)。因此，對(duì)我國(guó)韭菜品種進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，對(duì)于提高韭菜的品質(zhì)與產(chǎn)量具有很重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試韭菜選自大田，選取健壯、無(wú)病蟲害的植株。儀器包括75%酒精、0.1%升汞、洗潔精、滅菌三角瓶、無(wú)菌水、解剖刀、無(wú)菌培養(yǎng)皿、鑷子、剪刀、超凈工作臺(tái)。

采摘8月成熟花朵，用醋酸洋紅染色壓片觀察花粉母細(xì)胞、四分體時(shí)期、單核早中期、單核靠邊期、雙核期。其中單核靠邊期是組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)單倍體植株的最佳接種時(shí)期。

1.2 培養(yǎng)基配制

增殖培養(yǎng)基：Ms大量+Ms微量+CaCl2+鐵鹽+Ms有機(jī)+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+瓊脂粉5.5 g/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖20 g/L（pH值5.6～5.8，下同）（A）；Ms大量+Ms微量+CaCl2+鐵鹽+Ms有機(jī)+6-BA 5.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+檸檬酸60 mg/L+瓊脂粉5.6 g/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖20 g/L（B）。生根培養(yǎng)基：1/2Ms大量+Ms微量+CaCl2+鐵鹽+Ms有機(jī)+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+檸檬酸+（GA3+VW+VH）+瓊脂粉6.5 g/L+蔗糖20 g/L（C）；Ms大量+Ms微量+CaCl2+鐵鹽+Ms有機(jī)+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+檸檬酸+（GA3+VW+VH）+瓊脂粉5.5 g/L+蔗糖20 g/L（D）。

1.3 試驗(yàn)實(shí)施

1.3.1 材料消毒。用洗衣粉清洗試驗(yàn)材料，用水沖洗4～5遍，然后放在操凈工作臺(tái)上，再用0.1%升汞浸泡10 min，酒精浸泡30 s，再用無(wú)菌水沖洗5遍，放入三角瓶中。

1.3.2 接種。取一花蕾，將花序的苞葉除去，取出內(nèi)部的花序，用消過(guò)毒的鑷子和刀片，切去花序的底端1/4，將其接種在不同濃度的培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)皿中，一皿放入50粒左右。

1.3.3 花藥培養(yǎng)條件。一般是光照和黑暗周期交替進(jìn)行。把培養(yǎng)皿分成2個(gè)部分，進(jìn)行冷處理和暗培養(yǎng)，分別為24 h和48 h，然后放在鐵架臺(tái)上，用日光燈進(jìn)行光照培養(yǎng)。光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx，光照時(shí)間12 h/d，溫度20～25 ℃。

1.3.4 增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)5 h后，花藥逐漸變?yōu)楹诤稚?0 h左右花藥裂開(kāi)，并在培養(yǎng)基上長(zhǎng)出淡黃色的花粉愈傷組織，30 h以后，愈傷組織會(huì)變成黃色的瘤狀物體，其頂端有小綠點(diǎn)出現(xiàn)，這些綠點(diǎn)在3～5 h后形成芽。愈傷組織在增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)分化，長(zhǎng)出1 cm長(zhǎng)綠芽時(shí)進(jìn)行第2次轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)入10 cm寬、20 cm高的培養(yǎng)瓶中，長(zhǎng)出花苗，在生根培養(yǎng)基上繼續(xù)分化，形成根。7 d觀察1次，記錄花藥萌發(fā)情況。

1.3.5 繼代繁殖。長(zhǎng)成叢生苗后，從培養(yǎng)瓶中取出，放入培養(yǎng)皿中，用剪刀除去叢生苗頂端，剩3～4 cm長(zhǎng)叢生苗。繼續(xù)在適當(dāng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察記載生長(zhǎng)情況。

1.3.6 大田栽植。出瓶前進(jìn)行煉苗，揭去培養(yǎng)瓶上的封口膜，在20 ℃左右的溫室中煉苗，7 d后移入盛有基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，室內(nèi)培養(yǎng)6個(gè)月，第2年3月定植在大田，6月進(jìn)行田間調(diào)查，10月底采收。種在大田后，澆水施肥，進(jìn)行調(diào)查研究。測(cè)量苗高、葉寬、葉色等，與傳統(tǒng)定植韭菜進(jìn)行比較，觀察抗病性、抗逆性、病蟲害防治等。灌溉施肥除草，8月成熟以后，不同品種之間進(jìn)行自交授粉，最后采收種子，以及測(cè)定產(chǎn)量，進(jìn)行區(qū)域試驗(yàn)。計(jì)算千粒重，保存資源。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，可通過(guò)花藥培養(yǎng)成功誘導(dǎo)出花粉植株，由此說(shuō)明可通過(guò)誘導(dǎo)雄核發(fā)育（花藥和小孢子培養(yǎng)）獲得單倍體是韭菜單倍體育種的一條途徑。

常用于組織培養(yǎng)的植物激素有生長(zhǎng)素類與細(xì)胞分裂素類兩大類[1]。生長(zhǎng)素類的主要作用是重新啟動(dòng)有絲分裂，使已停止分裂的植物細(xì)胞恢復(fù)分裂能力[2]。常用生長(zhǎng)素有IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸），對(duì)多數(shù)植物材料的培養(yǎng)而言，2，4-D和NAA是生長(zhǎng)素中誘導(dǎo)愈傷組織最有效的物質(zhì)，常用濃度為0.2～3.0 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中，高濃度的生長(zhǎng)素類結(jié)合低濃度的細(xì)胞分裂素類對(duì)提供胚性愈傷組織的發(fā)生是需要的。細(xì)胞分裂素的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)芽的分化，促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)[3]，常用的細(xì)胞分裂素有6-芐基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）等。細(xì)胞分裂素在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，一般要與生長(zhǎng)素配合使用，增強(qiáng)生長(zhǎng)素的誘導(dǎo)作用和效果，當(dāng)誘導(dǎo)出胚性愈傷組織以后，進(jìn)行其增殖（繼代）、分化再生植株時(shí)，細(xì)胞分裂素起到重要作用。根據(jù)實(shí)際需要選用適當(dāng)?shù)募?xì)胞分裂素種類[4]。

3 結(jié)論與討論

單倍體育種可快速獲得純合自交系，縮短育種年限，具有重要的的研究?jī)r(jià)值。試驗(yàn)結(jié)果表明，韭菜品種可通過(guò)花藥培養(yǎng)成功誘導(dǎo)出花粉植株，說(shuō)明通過(guò)誘導(dǎo)雄核發(fā)育（花藥和小孢子培養(yǎng)）獲得單倍體是韭菜單倍體的一條途徑[5-8]。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 李勝，李唯.植物組織培養(yǎng)原理與技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

[2] 李俊明.植物組織培養(yǎng)教程[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008.

[3] 沈國(guó)林，邵愛(ài)娟，黃璐琦.三葉木通愈傷組織培養(yǎng)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32（10）：899-901.

[4] 杜希華，孫秀玲，郝崗平.不同外植體和激素對(duì)白菜愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響[J].山東師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，23（1）：129-133.

[5] 翟麗華.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)組織培養(yǎng)中不定芽不定根的作用[J].遼寧師專學(xué)報(bào)（自然科學(xué)報(bào)），2008，2（2）：97-99.

[6] 高行英，李梅蘭，王婷婷，等.不同抗生素對(duì)韭菜根愈傷組織誘導(dǎo)及再生的影響[J].分子植物育種，2013，11（4）：559-565.

[7] 屈二軍，張現(xiàn)青，趙楨，等.韭菜愈傷組織誘導(dǎo)條件優(yōu)化的研究[J].種子世界，2008（6）：24-25.

[8] 屈二軍，張現(xiàn)青，趙楨，等.植物激素對(duì)韭菜愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（18）：7574.