添加淀粉和通氣對(duì)固定化Fusarium.sp修復(fù)煤礦區(qū)老化污染土壤HMW-PAHs的影響

張雪娜，賈海濱，李　橙，王　偉，張麗秀，馮圣東*，楊志新，2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；3.河北省環(huán)境科學(xué)研究院，石家莊 050000）

添加淀粉和通氣對(duì)固定化Fusarium.sp修復(fù)煤礦區(qū)老化污染土壤HMW-PAHs的影響

張雪娜1，賈海濱1，李橙3，王偉1，張麗秀1，馮圣東1*，楊志新1，2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；3.河北省環(huán)境科學(xué)研究院，石家莊 050000）

為了提高Fusarium.sp對(duì)PAHs的修復(fù)效果，在典型煤礦區(qū)老化污染土壤中添加淀粉和通氣，經(jīng)為期60 d的土壤培養(yǎng)試驗(yàn)，研究玉米秸稈固定化Fusarium.sp對(duì)土壤10種HMW-PAHs的修復(fù)效果及不同處理下土壤中酶活性變化規(guī)律。結(jié)果表明：HMWPAHs（High molecular weight-PAHs）總量去除率表現(xiàn)為固定化菌劑+淀粉+通氣處理（J+D+O，29.19%）≈固定化菌劑+淀粉處理（J+D，25.89%）＞固定化菌劑處理（J，16.54%）；4環(huán)、5環(huán)和6環(huán)PAHs去除率在J+D+O和J+D兩組處理間的差異均不顯著，且與J處理相比均有顯著提高（P＜0.05）；三組處理對(duì)單個(gè)HMW-PAH的去除率分別為9.12%～21.73%、17.93%～43.12%、24.34%～35.79%，J+D+O 和J+D處理對(duì)單個(gè)HMW-PAH的修復(fù)效果均有顯著促進(jìn)作用，其中，對(duì)BkF的去除增幅最大，分別增加了68.09%、63.78%。從酶活性規(guī)律看，土壤過(guò)氧化氫酶活性呈CK＞J＞J+D＞J+D+O（P＜0.05）的規(guī)律，且與10種PAHs單體的去除率呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；土壤木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性卻與Chry、BkF、InP、DbA、BghiP去除率呈顯著正相關(guān)。綜上認(rèn)為，不同處理對(duì)單個(gè)PAHs的去除具有其選擇性，且添加淀粉的兩處理均顯著提高了土壤中HMW-PAHs的修復(fù)效果。

典型煤礦區(qū)；HMW-PAHs；固定化Fusarium.sp；淀粉；通氣；土壤酶活性

張雪娜，賈海濱，李橙，等.添加淀粉和通氣對(duì)固定化Fusarium.sp修復(fù)煤礦區(qū)老化污染土壤HMW-PAHs的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35 （9）：1709-1716.

ZHANG Xue-na，JIA Hai-bin，LI Cheng，et al.Effect of starch and aerationon addition on degradation of HMW-PAHs by immobilized Fusarium.sp in a polluted and aged soil of a coal mining area［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（9）：1709-1716.

多環(huán)芳烴（Polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs）是由兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)組成的一類化合物，具有致癌、致畸、致突變的性質(zhì)［1-2］，是美國(guó)環(huán)境保護(hù)署優(yōu)先控制的持久性有機(jī)污染物［3］，其中4環(huán)及4環(huán)以上的高環(huán)PAHs（High molecular weight-PAHs，HMW-PAHs），因疏水性、親脂性、穩(wěn)定性更強(qiáng)，不易被去除［4-5］，最終會(huì)通過(guò)食物鏈和其他暴露途徑對(duì)人體產(chǎn)生威脅［6］。環(huán)境中絕大多數(shù)的PAHs積累于土壤中［7］，煤礦區(qū)、焦化廠區(qū)及其影響的農(nóng)田土壤范圍是典型的多環(huán)芳烴污染場(chǎng)地［8］，如本課題組前期對(duì)河北省某煤礦區(qū)農(nóng)田土壤中PAHs進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，89%土壤存在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)［9］，10種HMW-PAHs總含量為3 392.77 μg·kg-1，而一般污染農(nóng)田土壤中以低環(huán)PAHs積累為主［10］。目前許多研究主要集中于土壤中PAHs的含量分布、來(lái)源、遷移轉(zhuǎn)化特征以及PAHs的物化性質(zhì)與其環(huán)境行為間的關(guān)系、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)等方面，對(duì)煤礦區(qū)附近土壤中PAHs污染修復(fù)的研宄較少［11］，煤礦區(qū)農(nóng)田污染土壤的修復(fù)迫在眉睫。

目前，環(huán)境友好的微生物修復(fù)是土壤中PAHs修復(fù)的主要途徑之一。在真菌修復(fù)中，關(guān)于白腐真菌的研究報(bào)道較為深入［12-13］，而鐮刀屬真菌（Fusarium.sp）修復(fù)PAHs老化污染土壤僅見(jiàn)零星報(bào)道［14］。本課題組前期在煤礦區(qū)污染土壤中篩選出的Fusarium.sp培養(yǎng)7 d對(duì)無(wú)機(jī)鹽溶液 BaP、BKF、DbA、BghiP、InP單個(gè)PAH的去除率均達(dá)38%以上，證實(shí)了它是具有去除HMW-PAHs潛力的菌株。微生物固定化技術(shù)是一種有效的土壤修復(fù)技術(shù)，能夠顯著增強(qiáng)微生物的環(huán)境適應(yīng)能力和污染物去除能力，極大地提高污染土壤修復(fù)效果［15-17］，Su等［16］證實(shí)固定化的真菌對(duì)環(huán)境具有更強(qiáng)適應(yīng)能力和更快的反應(yīng)啟動(dòng)速度。此外，許多學(xué)者已證實(shí)，通過(guò)外加碳源如水楊酸、鄰苯二甲酸、鄰苯二酚、礦物油、葡萄糖等可提高微生物對(duì)PAHs的去除效果［18-22］，而大分子淀粉的作用影響研究尚少［23］。課題組前期發(fā)現(xiàn)，添加淀粉可顯著促進(jìn)Fusarium.sp對(duì)無(wú)機(jī)鹽溶液中HMW-PAHs的去除，1 g·L-1淀粉使Fusarium.sp對(duì)其去除率達(dá)到了83.07%，該菌株在淀粉外加碳源的條件下效果卓越。

本研究針對(duì)通過(guò)淀粉強(qiáng)化固定化Fusarium.sp修復(fù)煤礦區(qū)老化HMW-PAHs污染土壤是否也能達(dá)到較為理想的效果，以及其降解效果與前人研究的對(duì)PAHs去除相關(guān)的土壤酶活性是否有關(guān)等問(wèn)題［24-26］，以河北某典型煤礦區(qū)長(zhǎng)期污染的農(nóng)田土壤為研究對(duì)象，利用玉米秸稈載體材料將Fusarium.sp ZH-H2固定化，在添加淀粉并伴隨通氣措施下，研究該菌劑對(duì)污染土壤HMW-PAHs的修復(fù)效果以及土壤酶活性變化規(guī)律，以期為煤礦區(qū)農(nóng)田土壤HMW-PAHs的修復(fù)提供理論依據(jù)及技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用土取自河北某典型煤礦區(qū)周邊農(nóng)田，陰干后過(guò)2 mm篩，4℃冰箱內(nèi)保藏待用。其基本性質(zhì)見(jiàn)表1，10種HMW-PAHs總含量為3 392.77 μg·kg-1，各PAHs含量比例如圖1所示。

供試菌株ZH-H2（Fusarium.sp）為本課題組前期在煤礦區(qū)農(nóng)田土壤中篩選的HMW-PAHs高效去除菌。保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏號(hào)：CGMCC No.9316，已申請(qǐng)專利（專利號(hào)：201410432336.5）。

表1　土壤基本理化性質(zhì)Table 1 The basic physical and chemical properties of soil

圖1　土壤中單個(gè)PAH在∑10種PAHs的百分含量Figure 1 The proportion of individual PAHs content in total

供試載體玉米秸稈，取自河北省保定市，將其洗凈，殺青30 min（105℃），陰干粉碎，過(guò)1 mm篩，并分別與草炭土按1∶2混合均勻，121℃滅菌20 min，備用。

有機(jī)試劑丙酮、二氯甲烷、氘代三聯(lián)苯（替代物），4溴-2氟聯(lián)苯（替代物）、氘代苝（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)）等均購(gòu)于北京百靈威試劑公司。

1.2樣品制備

菌種培養(yǎng)：從斜面挑取一株ZH-H2菌接入高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿用封口膜封口，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。用無(wú)菌水反復(fù)沖洗吹打菌落，菌液經(jīng)滅菌的4層紗布過(guò)濾后，得到孢子懸浮液，再用滅菌水調(diào)節(jié)孢子的數(shù)量為1.25×107cfu·mL-1，作為原液備用。取出5 mL原液放入20 mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)2 d得到菌絲懸液。

載體菌劑制備：分別稱取1.1中制備的秸稈材料90 g放入500 mL錐形瓶（共9瓶）。于121℃高溫高壓滅菌20 min，降溫后分別加入上述菌液，并適當(dāng)補(bǔ)充無(wú)菌水，在30℃、150 r·min-1搖床條件下培養(yǎng)3 h，即得到固定化ZH-H2的玉米載體材料，用于土壤培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.3試驗(yàn)方案

采用上口直徑13 cm，底面直徑9 cm，高11 cm的試驗(yàn)用塑料盆缽，土壤培養(yǎng)試驗(yàn)處理見(jiàn)表2。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，共12個(gè)盆缽。取210 g陰干土放入每個(gè)盆缽中，依據(jù)表2處理方案按3∶7質(zhì)量比向土壤中添加滅菌載體材料和玉米秸稈固定化ZH-H2載體材料，淀粉添加量為5 g·kg-1，充分混合后調(diào)節(jié)水分含量為田間持水量的60%，將盆缽置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d補(bǔ)水一次，通氣時(shí)間設(shè)定在灌水以后，由空氣壓縮機(jī)注入，輸氣管平鋪于土壤中，由土壤的體積質(zhì)量、孔隙度和體積含水率計(jì)算注入空氣量，通氣量系數(shù)為0.05，以2 d為一個(gè)通氣周期，60 d后采集土壤樣品。將每盆土壤混合均勻后采用四分法分取樣品，一半土壤樣品過(guò)1 mm篩，密封，置于4℃冰箱中保存，用于測(cè)定PAHs的殘留量；另一半自然陰干后過(guò)1 mm篩，用于測(cè)定土壤酶活性。

表2　土壤HMW-PAHs去除的試驗(yàn)方案Table 2 The treatments of HMW-PAHs degradation in soil

1.4樣品的測(cè)定指標(biāo)及方法

土壤基本理化性質(zhì)采用土壤農(nóng)化常規(guī)分析法［27］。

HMW-PAHs指標(biāo)測(cè)定及分析方法：Flt、Pyr、BaA、Chry、BbF、BkF、BaP、DbA、BghiP、InP，總計(jì) 10 種HMW-PAHs。采用超聲-索式聯(lián)合提取法提取，稱取土壤樣品20 g及10 g無(wú)水硫酸鈉，混合均勻后，加入替代物（20 μg·mL-1氘代三聯(lián)苯與4-溴-2氟聯(lián)苯）20 μL，用丙酮與正己烷體積比1∶1的提取劑超聲提取30 min，索氏水浴溫度70℃提取12 h，經(jīng)過(guò)干燥、濃縮、凈化、再次濃縮定容，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS，Aglient 7890/5975c）測(cè)定樣品［28］。GC-MS程序升溫步驟：起始溫度為80℃，保持2 min；以10℃· min-1上升到140℃，保持3 min；再以10℃·min-1上升到210℃保持3 min；最后以5℃·min-1上升到290℃保持3 min。進(jìn)樣口溫度為280℃，進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣，流速為1.1 mL·min-1，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃［28］。

土壤酶活性測(cè)定指標(biāo)及分析方法：土壤過(guò)氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定，以20 min每克土壤消耗0.1 mol·L-1KMnO4的毫升數(shù)表示：土壤木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性以每分鐘使1 μmol黎蘆醇氧化成黎蘆醛所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）表示，黎蘆醛的摩爾吸光系數(shù)ε=9300 L·mol-1·cm-1［29］。

氣相色譜儀-質(zhì)譜儀聯(lián)用，氣相色譜儀為安捷倫7890，質(zhì)譜儀為美國(guó)HP5975系列。

回收率和檢測(cè)限的測(cè)定參考EPA標(biāo)準(zhǔn)方法?；厥章什捎猛寥阑|(zhì)加標(biāo)法，氘代三聯(lián)苯與4-溴-2氟聯(lián)苯回收率控制在70%～130%，同時(shí)設(shè)置樣品的20%進(jìn)行平行提取試驗(yàn)［28，30］。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

HMW-PAHs的去除率（Rs）=（C0-Ct）/C0×100%式中：C0為對(duì)照土壤HMW-PAHs的含量；Ct為土壤中HMW-PAHs的殘留含量（相對(duì)去除率）。

本論文數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1淀粉和通氣促進(jìn)固定化ZH-H2菌劑修復(fù)土壤HMW-PAHs的研究

2.1.1ZH-H2菌劑修復(fù)土壤HMW-PAHs總量

在不同處理?xiàng)l件下，固定化ZH-H2菌劑對(duì)土壤10種HMW-PAHs總量及不同環(huán)數(shù)成分的去除效果見(jiàn)圖2。HMW-PAHs總量去除率在J+D和J+D+O處理間差異不顯著（P＞0.05），分別為25.89%和29.19%，但均顯著高于處理J（16.54%），分別提高了56.5%、76.0%，說(shuō)明添加淀粉能夠顯著促進(jìn)固定化ZH-H2菌劑對(duì)土壤中10種HMW-PAHs總量的去除，而增加空氣對(duì)其去除影響并不顯著。

比較不同環(huán)數(shù)的去除率可知（圖2），在J+D和J+ D+O兩組處理下，6環(huán)PAHs總量的去除率均高于4環(huán)和5環(huán)，分別為38.31%和35.73%，J處理下不同環(huán)數(shù)之間的去除效果差異不顯著。另外，各環(huán)在J+D+O 和J+D兩組處理間的差異均不顯著，且與J處理相比均有顯著提高（P＜0.05），J+D+O與J相比，4環(huán)、5環(huán)和6環(huán)PAHs去除率分別提高了61%、100%和80%，去除效果提高顯著；J+D與 J相比分別提高了39.34%、54.89%和92.81%，去除效果提高顯著?？梢?jiàn)，添加淀粉并伴隨通氣條件對(duì)5環(huán)PAHs總量的去除提高最突出，而只添加淀粉處理對(duì)6環(huán)PAHs總量的

圖2　不同措施下固定化ZH-H2菌劑對(duì)土壤總量及不同環(huán)數(shù)PAHs的去除效果Figure 2 The degradation of the total PAHs and the PAHs with different rings in soil by immobilized ZH-H2 in the different treatments

去除提高更明顯。

2.1.2ZH-H2菌劑修復(fù)土壤單個(gè)HMW-PAH

如圖3所示，在J處理下，單個(gè)PAH去除率范圍為9.12%～21.73%。經(jīng)檢驗(yàn)，BaA的去除效果最佳，去除率達(dá)21.73%；其次為Flt、Pry、Chry、DbA、InP和BghiP；BkF和BaP的去除效果最差，去除率為9.12%、11.66%。但與課題組前期向老化污染土壤中添加0.1 g·kg-1游離菌相比，ZH-H2對(duì) BbF、BKF、BaP、InP、DbA、BghiP的去除率（5.49%、8.46%、0.35%、6.75%、5.79%、7.06%）分別提高了1.94、0.08、32.32、1.29、2.60、1.66倍，對(duì)PAHs的去除效果顯著。這說(shuō)明在該礦區(qū)長(zhǎng)期污染的老化土壤中添加該固定化菌劑對(duì)10種單個(gè)HMW-PAHs均有不同程度的去除潛力且比游離菌對(duì)老化污染土壤的修復(fù)效果高。在J+D處理下，10種HMW-PAHs去除率范圍為17.93%～43.12%。經(jīng)檢驗(yàn)，在10種PAHs中，各PAH的去除效果由大到小依次為InP（43.12%）＞DbA、BghiP（31.56%，33.92%）＞BaA （30.60%）＞Flt、Pry、Chry、BkF、BaP＞BbF（17.93%）。在J+D+O處理下，10種單個(gè)PAH去除率范圍為24.34%～35.81%，其中BaA、BghiP、InP的去除率顯著高于其他7種HMW-PAHs，分別為35.81%、35.67%、35.79%。與J處理相比，J+D處理下Flt、Chry、BkF、BaP、DbA、BghiP、InP 7種HMW-PAHs的去除率顯著提高，其中BkF的增幅最大，增加了63.78%，表明添加淀粉對(duì)不同種類HMW-PAHs的去除促進(jìn)作用有一定差異；J+D+O處理中10種單個(gè)HMW-PAHs去除率比J處理均有顯著增加，其中BkF的增幅最明顯，增加了68.09%。對(duì)比J+D和J+D+O處理不難發(fā)現(xiàn)，除BbF外，其余9種PAHs的去除率在兩組處理之間差異均不顯著，通氣對(duì)單個(gè)HMW-PAH的修復(fù)未產(chǎn)生顯著影響。

2.2不同處理對(duì)土壤酶活性影響的研究

不同處理土壤酶活性的變化見(jiàn)表3。J處理下木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性大于CK，但未達(dá)到顯著水平，J+ D、J+D+O處理下木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性顯著高于CK和J，與HMW-PAHs總量去除率的結(jié)果一致，推測(cè)土壤HMW-PAHs的降解可能與該酶活性有關(guān)，過(guò)氧化氫酶活性大小順次為J+D+O＜J+D＜J＜CK（P＜0.05）。同時(shí)，研究?jī)煞N土壤酶活性與PAHs去除率的相關(guān)性（表4）可以看出，土壤過(guò)氧化氫酶活性與Chry、BkF、BaP、DbA、BghiP、InP的去除率呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Flt、BaA的去除率呈顯著負(fù)相關(guān)；土壤木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性與Chry、BkF、InP、DbA、BghiP的去除率呈顯著正相關(guān)。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該酶可能與鐮刀真菌ZH-H2降解HMW-PAHs的效率有關(guān)。

圖3　不同措施下固定化ZH-H2菌劑對(duì)土壤各HMW-PAHs的去除效果Figure 3 The degradation of individual HMW-PAHs in soil by immobilized ZH-H2 in the different treatments

表3　不同處理下土壤酶活性的測(cè)定結(jié)果Table 3 Soil enzymatic activities in different treatments

3　討論

向土壤中添加高效去除菌、高效去除菌載體或者其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等共代謝底物來(lái)提高污染物去除效果的方法被稱為生物強(qiáng)化［31-32］。本研究采用生物強(qiáng)化的方法向PAHs長(zhǎng)期污染土壤中添加玉米秸稈固定化Fusarium.sp修復(fù)HMW-PAHs，并結(jié)合添加淀粉以及通氣措施來(lái)提高HMW-PAHs的修復(fù)效率。

表4　酶活性與各HMW-PAHs去除率的相關(guān)性分析Table 4 The correlation analysis about the soil enzyme activity and the degradation of ten different HMW-PAHs

與課題組前期向土壤中添加0.1 g·kg-1游離菌的研究結(jié)果相比，ZH-H2經(jīng)固定化后顯著促進(jìn)了PAHs的去除。這可能是因?yàn)閆H-H2經(jīng)固定化后單位體積介質(zhì)中微生物的數(shù)量顯著增加，增加了ZH-H2與PAHs接觸的機(jī)會(huì)；或者是ZH-H2經(jīng)固定化后微環(huán)境有利于屏蔽土著菌的競(jìng)爭(zhēng)作用，降低了污染物對(duì)ZHH2的毒害作用，使其可以保證高效的修復(fù)效果［33］。另外，過(guò)氧化氫酶分解土壤中過(guò)氧化氫，是H2O2的解毒劑，有利于防止過(guò)氧化氫對(duì)生物體的毒害作用，可用作PAHs引起的氧化脅迫的生物標(biāo)志物［34］。本研究土壤過(guò)氧化氫酶活性隨去除率升高而降低，與王洪等［35］研究得出的PAHs修復(fù)效果與過(guò)氧化氫酶活性呈負(fù)相關(guān)結(jié)論相一致，可能是由于PAHs或者其中間代謝產(chǎn)物的毒性作用，促使微生物固定化、添加淀粉等措施增強(qiáng)了對(duì)ZH-H2的保護(hù)作用，導(dǎo)致土壤過(guò)氧化氫酶活性降低。

本研究中土培60 d后，固定化ZH-H2、固定化ZH-H2-淀粉處理均能夠顯著促進(jìn)固定化Fusarium. sp對(duì)HMW-PAHs污染農(nóng)田土壤的修復(fù)。淀粉加強(qiáng)HMW-PAHs去除效果一方面歸于淀粉基質(zhì)可能改善了土壤微生物的營(yíng)養(yǎng)條件，利于固定化降解菌ZHH2及土著微生物的生長(zhǎng)［36］，改變了微生物種群結(jié)構(gòu)，課題組前期已證實(shí)淀粉促進(jìn)Fusarium.sp對(duì)HMWPAHs降解的顯著效果；另一方面，添加淀粉可能促進(jìn)了固定化ZH-H2及土著微生物分泌一些關(guān)鍵的去除酶［37］。Wang［38］已證實(shí)，P.Chrysosporium分泌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶是土壤中PAHs去除的主要酶，且其酶活性隨著土壤有機(jī)質(zhì)含量的提高而增加，Collybia.sp和Rhizoctonia在土壤多環(huán)芳烴修復(fù)應(yīng)用中產(chǎn)生木質(zhì)素過(guò)氧化物酶［39-40］，而且本研究中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性與Chry、BkF、InP、DbA、BghiP的去除率呈顯著正相關(guān)。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明不同處理措施對(duì)土壤HMW-PAHs的去除影響可能與分泌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶有關(guān)；同時(shí)，固定化ZH-H2—淀粉處理中過(guò)氧化氫酶活性顯著低于固定化ZH-H2，也可能是添加淀粉促進(jìn)了對(duì)ZH-H2的保護(hù)作用。綜合以上兩方面因素認(rèn)為，添加淀粉可能是提升HMWPAHs去除的主要原因。另外，鄒德勛等［41］證明通氣促進(jìn)微生物生長(zhǎng)，提高了PAHs修復(fù)效果，但Teng［23］等卻得到了不同的結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)在通氣的處理中，BaP的含量高于未通氣處理。在本研究中，通氣措施對(duì)HMW-PAHs修復(fù)的影響也不顯著，與Teng等的結(jié)論相符，可見(jiàn)，通氣對(duì)不同菌種降解PAHs的影響差異較大。

在添加淀粉、淀粉-通氣兩組處理下，6環(huán)PAHs總量的去除率均高于4環(huán)和5環(huán)。一般來(lái)說(shuō)，隨著PAHs環(huán)數(shù)的增加，去除率因其生物可利用性降低而降低。孫鐵珩等［42］指出，PAHs的難去除性與其分子量和環(huán)數(shù)呈正相關(guān)性，與本研究結(jié)果相反，不過(guò)有學(xué)者已證明淀粉能夠增加BaP的水溶性［43］。這可能是解釋本研究結(jié)果的重要證據(jù)之一。另外，Olivier等［14］也發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬對(duì)5環(huán)、6環(huán)HMW-PAHs的修復(fù)效果高于4環(huán)PAHs，與本研究結(jié)果一致。這可能與該菌種的去除特性有直接關(guān)系。

縱觀國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)不難發(fā)現(xiàn)，添加淀粉伴隨通氣與固定化Fusarium.sp菌劑相結(jié)合修復(fù)HMW-PAHs長(zhǎng)期老化污染土壤中10種單體的研究尚未檢索到相關(guān)文獻(xiàn)。有學(xué)者已證實(shí)添加可溶性淀粉促進(jìn)了土著微生物對(duì)BaP的去除效果［20］，但尚未有添加淀粉與固定化Fusarium.sp菌劑相結(jié)合的方法用以修復(fù) HMWPAHs長(zhǎng)期污染老化土壤的研究。本研究證實(shí)了淀粉與固定化Fusarium.sp菌劑相結(jié)合措施對(duì)6環(huán)PAHs有較好的去除效果。

4　結(jié)論

（1）添加淀粉能夠顯著促進(jìn)固定化ZH-H2菌劑的降解能力，而通氣對(duì)其降解影響不大。

（2）隨著淀粉、通氣調(diào)控因子的改變，單個(gè)HMWPAH的去除能力隨之發(fā)生了改變。在J+D+O處理下固定化菌劑對(duì)BaA、BghiP、InP的修復(fù)效果最佳，且對(duì)6環(huán)PAHs有較好的去除效果，在J+D處理下對(duì)InP的去除最高。

（3）不同處理土壤過(guò)氧化氫酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性可能影響對(duì)HMW-PAHs的去除。

［1］Hunter R D，Ekunwe S I N，Dodor D E，et al.Bacillus subtilis is a potential degrader of Pyrene and Benzo［a］pyrene［J］.International Journal of Environmental Research and Public Health，2005，2（2）：267-271.

［2］毛健，駱永明，滕應(yīng)，等.一株副球菌對(duì)污染土壤中多環(huán)芳烴的降解研究［J］.土壤，2009，41（3）：448-453.

MAO Jian，LUO Yong-ming，TENG Ying，et al.Biodegradation of PAHs by Paracoccus aminovorans HPD-2 in contaminated soil［J］.Soils，2009，41（3）：448-453.

［3］Benner B A，Bryner N P，Wise S A，et al.Polycyclic aromatic hydrocarbon emissions from the combustion of crude oil on water［J］.Environ SciTechnol，1990，24：1418-1427.

［4］Shree N S，Rudra D T.Environmental bioremediation technologies［M］. Berlin：Springer，2007：409-443.

［5］羅 霂.高效降解高分子量多環(huán)芳烴的混合菌劑的開(kāi)發(fā)［D］.北京：輕工業(yè)環(huán)境保護(hù)研究所，2013：1-7.

LUO Lin.Develoment of a mixed microbial-agent efficiently degrading High-molecular-weight-polycyclic-aromatic-hydrocarbons［D］.Beijing：Environmental Production Institute of Light Industry，2013：1-7.

［6］徐瑩.高分子量多環(huán)芳烴降解菌的篩選、鑒定及其降解特性研究［D］.南京：南京大學(xué)，2014：1-9. XU Ying.Isolation，identification and characteristics of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons degradation strains［D］. Nanjing：Nanjing University，2014：1-9.

［7］Wild S R，Jones K C.Polynuclear aromatic hydrocarbons in the united kingdom environment：A preliminary source inventory and budget［J］. Environ Pollut，1995，88（1）：91-108.

［8］劉大錳，王 瑋，李運(yùn)勇.首鋼焦化廠環(huán)境中多環(huán)芳烴分布賦存特征研究［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24（4）：746-749.

LIU Da-meng，WANG Wei，LI Yun-yong.Distribution and occurrence of polycyclic aromatic hydrocarbons from the Shougang coking plant［J］. Acta Scientiae Circumstantiae，2004，24（4）：746-749.

［9］趙歐亞，馮圣東，石維，等.煤礦區(qū)農(nóng)田土壤多環(huán)芳烴生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法比較［J］.安全與環(huán)境學(xué)報(bào)，2015，15（2）：352-358.

ZHAO Ou-ya，F(xiàn)ENG Sheng-dong，SHI Wei，et al.A method for assessing the ecological risks due to the polycyclic aromatic hydrocarbons in the farming soil near coal mine area［J］.Journal of Safety and Environment，2015，15（2）：352-358.

［10］肖春燕，邰超，趙同謙，等.燃煤電廠附近農(nóng)田土壤中多環(huán)芳烴的分布特征［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（8）：1579-1585.

XIAO Chun-yan，TAI Chao，ZHAO Tong-qian，et al.Distirbution characteristics of polycyclic aromatic hydrocarbons in the soil around theJiaozuoPowerPlant［J］.Acta Scientiae Circumstantiae，2008，28（8）：1579-1585.

［11］劉靜靜.典型煤礦區(qū)土壤中烴類化合物的地球化學(xué)循環(huán)研究［D］.合肥：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2014：1-15.

LIU Jing-jing.Geochemical cycling of hydrocarbon compounds in soil of tipical coal mine district［D］.Hefei：University of Science and Technology of China，2014：1-15.

［12］Tony H，Risky A K.Fate and cometabolic degradation of benzo［a］pyrene by white-rot fungus Armillaria sp.F022［J］.Bioresource Technology，2012，107：314-318.

［13］Andrzej M，Christian J，Aloys H.Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons by laccase of Trametes versicolor［J］.Enzyme and Microbial Technology，1998，22（5）：335-341.

［14］Olivier P，Catherine R，Etienne V，et al，Bioremediation of an aged polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）-contaminated soil by filamentous fungi isolated from the soil［J］.International Biodeterioration& Biodegradation，2004，54：45-52.

［15］王新，李培軍，鞏宗強(qiáng)，等.混合固定化酵母菌對(duì)苯并（a）芘污染土壤的修復(fù)［J］.環(huán)境污染與防治，2008，30（1）：1-8.

WANG Xin，LI Pei-jun，GONG Zong-qiang，et al.Remediation of soil contaminated with benzo（a）pyrene using mixed immobilized yeast strains［J］.Environmental Pollution&Control，2008，30（1）：1-8.

［16］Su D，Li P J，Wang X，et al.Biodegradation of benzo［a］pyrene in soil by immobilized fungus［J］.Environmental Engineering Science，2008，25 （8）：1181-1188.

［17］王新，李培軍，鞏宗強(qiáng)，等.蓮藕狀固定化真菌（鐮刀菌）對(duì)土壤中菲、芘的降解［J］.中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2002，22（1）：44-47.

WANG Xin，LI Pei-jun，GONG Zong-qiang，et al.The degradation of phenanthrene and pyrene in soil with the lotus-root form to immobilized Fusarium sp.［J］.China Environmental Science，2002，22（1）：44-47.

［18］呂雪峰，王堅(jiān).污染土壤生物修復(fù)的共代謝機(jī)制研究進(jìn)展［J］.科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)，2013（3）：49-52.

Lü Xue-feng，WANG Jian.Recent advances in cometabolism mechanics for bioremediation of contaminated soil［J］.Science and Technology Innovation Herald，2013（3）：49-52.

［19］Mahaffey W R，Gibson D T，Cerniglia C E.Bacterial oxidation of chemical carcinogens：Formation of polycyclic aromatic acids from benz［a］anthracene［J］.Applied and Environmental Microbilogy，1988，54（10）：2415-2423.

［20］Lun F Y，Ying T，Luo Y M，et al.Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）by Trichoderma reesei FS10-C and effect of bioaugmentation on an aged PAH-contaminated soil［J］.Bioremediation Journal，2015，19（1）：9-11.

［21］溫繼偉.白腐真菌Pseudotrametes gibbosa共代謝降解芘的研究［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2011.

WEN Ji-wei，Co-metabolie degradation of pyrene by white-rot fungus Pseudotrametes gibbosa［D］.Harbin：Northeast Forestry University，2011.

［22］Tittle P C.Use of alternative growth sub-strates to enhance PAH degradation.In：R.E.Hinchee（eds）［J］.Bioremediation of Recalcitrant Organics，1995：1-7.

［23］Teng Y，LuoY M，Li F P，et al.Effects of soil amendment with different carbon sources and other factors on the bioremediation of an aged PAH-contaminated soil［J］.Biodegradation，2010，21：167-178.

［24］周禮凱.土壤酶學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1987：107-240. ZHOU Li-kai.Soil enzymology［M］.Beijing：Science Press，1987：107-240.

［25］劉世亮，駱永明，丁克強(qiáng)，等.黑麥草對(duì)苯并［a］芘污染土壤的根際修復(fù)及其酶學(xué)機(jī)理研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（2）：52632.

LIU Shi-liang，LUO Yong-ming，DING Ke-qiang，et al.Rhizosphere remediation and its mechanism of benzo［a］pyrene-contaminated soil by growing ryegrass［J］.Journal of Agro-Environment Science，2007，26（2）：52-63.

［26］藍(lán)靖.木質(zhì)素過(guò)氧化物酶對(duì)疏水性芳香化合物的高效降解及機(jī)制研究［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)，2008.

LAN Jing.Studies on the degradation of hydrophobic aromatic compounds with lignin peroxidase and the related mechanism［D］.Jinan：Shandong University，2008.

［27］鮑士旦.土壤農(nóng)化分析［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000：30-163.

BAO Shi-dan，Soil analysis［M］.Beijing：Chinese Agricultural Press，2000：30-163.

［28］趙歐亞.淀粉和苜蓿促進(jìn)煤礦區(qū)土壤高環(huán)PAHs污染的真菌修復(fù)研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015：12-14.

ZHAO Ou-ya.Study on enhancing fungi remediation of coal mine area soil comtaminated with HMW-PAHs by starch and alfalfa［D］.Baoding：Agricultural University of Hebei，2015：12-14.

［29］程曉濱，裂褶菌F17錳過(guò)氧化物酶的分離純化及其對(duì)偶氮染料脫色的研究［D］.合肥：安徽大學(xué)，2008：8-10.

CHENG Xiao-bin，Purification of a new manganese peroxidase of the White-rot Fungus Schizophyllum sp.F17，and decolorization of Azo Dyes by the enzyme［D］.Hefei：Anhui University，2008：8-10.

［30］EPA 8270d，Semivolatile organic compounds by gas chromatographymass spectrometry［S］.United States Environmental Protection Agency. 1998.

［31］Thompson I P，Van G C，Ciric L，et al.Bioaugmentation for bioremediation：The challenge of strain selection［J］.Environmental Microbiology，2005，7（7）：909-915.

［32］Seklemova E，Pavlova A，Kovacheva K.Biostimulation-based bioremediation of diesel fuel：Field demonstration［J］.Biodegradation，2001，12 （5）：311-316.

［33］胡廣軍，梁成華，李培軍，等.固定化微生物對(duì)多環(huán)芳烴污染土壤的降解［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2008，27（5）：745-750.

HU Guang-jun，LIANG Cheng-hua，LI Pei-jun，et al.Degradation of soil polycyclic aromatic hydrocarbons by immobilized microbes［J］.Chinese Journal of Ecology，2008，27（5）：745-750.

［34］Lionetto M G，Caricato R，Giordano M E，et al.Integrated use of biomarkers（acetyl cholinesterase and antioxidant enzymes activities）in Mytilus galloprovincialis and Mullus barbatus in an Italian coastal marine area［J］.Marine Pollute Bulletin，2003，46：324-330.

［35］王洪，李海波，孫鐵珩，等.生物修復(fù)PAHs污染土壤對(duì)酶活性的影響［J］.生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，20（4）：691-695.

WANG Hong，LI Hai-bo，SUN Tie-heng，et al.Bioremediation of PAHs contaminated soil and its impacts on soil enzyme activity［J］.E－cology and Environmental Sciences，2011，20（4）：691-695.

［36］Ana-Maria R，Catherine R，Gheorghe S，et al.Synthesis of alkylated potato starch derivatives and their potential in the aqueous solubilization of benzo［a］pyrene［J］.Carbohydrate Polymers，Carbohydrate Polymers，2013，93：184-190.

［37］姜巖，楊穎，張賢明.典型多環(huán)芳烴生物降解及轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.石油學(xué)報(bào)（石油加工），2014，30（6）：1137-1150.

JIANG Yan，YANG Ying，ZHANG Xian-ming，Review on the biodegradation and conversion mechanisms of typical polycyclic aromatic hydrocarbons［J］.Acta Petrolei Sinica（Petrol Eum Processing Section），2014，30（6）：1137-1150.

［38］Wang C P，Sun H W，Li J M，et al.Enzyme activities during degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by white rot fungus Phanerochaete chrysosporium in soils［J］.Chemosphere，2009，77（6）：733-738.

［39］許華夏，李培軍，劉宛，等.真菌細(xì)胞色素P450與多環(huán)芳烴濃度及降解率的相互關(guān)系 ［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23（5）：972-976.

XU Hua-xia，LI Pei-jun，LIU Wan，et al.Interrelationship between Cytochrome P450 in fungi and contents and degradation rates of PAHs ［J］.Journal Agro-Environment Science，2004，23（5）：972-976.

［40］McErlean，C，Marchant，R，Banat，I M.An evaluation of soil colonization of selected fungi and their production of ligninolytic enzymes for use in soil bioremediation applications［J］.Anton Leeuw Int J G，2006，90：147-158.

［41］鄒德勛，駱永明，滕應(yīng)，等.多環(huán)芳烴長(zhǎng)期污染土壤的微生物強(qiáng)化修復(fù)初步研究［J］.土壤，2006，38（5）：652-656.

ZOU De-xun，LUO Yong-ming，TENG Ying，et al.Enhanced microbial remediation of long-term polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）polluted soils［J］.Soils，2006，38（5）：652-656.

［42］孫鐵珩，宋玉芳，許華夏，等.植物法生物修復(fù)PAHs和礦物油污染土壤的調(diào)控研究［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，1999，10（2）：225-229.

SUN Tie-heng，SONG Yu-fang，XU Hua-xia，et al.Plant bioremediation of PAHs and mineral oil contaminated soil［J］.Chinese Journal of Applied Ecology，1999，10（2）：225-229.

［43］Ana-Maria R，Catherine R，Gheorghe S，et al.Synthesis of alkylated potato starch derivatives and their potential in the aqueous solubilization of benzo［a］pyrene［J］.Carbohydrate Polymers，2013，93（1）：184-190.

Effect of starch and aeration addition on degradation of HMW-PAHs by immobilized Fusarium.sp in a polluted and aged soil of a coal mining area

ZHANG Xue-na1，JIA Hai-bin1，LI Cheng3，WANG Wei1，ZHANG Li-xiu1，F(xiàn)ENG Sheng-dong1*，YANG Zhi-xin1，2*
（1.College of Resource and Environment Science，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China；2.Key laboratory for Farm Land Eco-environment，Baoding 071000，China；3.Hebei Institute of Environmental Science，Shijiazhuang 050000，China）

The soil incubation experiment was performed to study the effect of starch and aeration addition on HMW-PAHs degradation by Fusarium.sp in polluted and aged soil of a coal mining area.After 60 days incubation，the degradation rate of 10 HMW-PAHs as well as the change rule of soil enzyme activities were analyzed.The results showed that the treatments were in the following order in terms of∑10 HMW-PAHs degradation rate：immobilized Fusarium.sp+starch+aeration（J+D+O，29.19%）≈immobilized Fusarium.sp+starch（J+D，25.89%）＞immobilized Fusarium.sp（J，16.54%）.There was no significant difference between J+D+O and J+D for the degradation of∑4-rings，∑5-ring and∑6-ring PAHs，but their degradation rates were higher than J significantly（P＜0.05）.The degradation range of 10 individual HMW-PAHs were 9.12%～21.73%，17.93%～43.12%，24.34%～35.79%in J，J+D and J+D+O treatments respectively.The results demonstrated that far higher degradation rates of the 10 individual HMW PAHs were achieved in J+D+O and J+D treatments than those in Jtreatment，but there was no significant difference between J+D+O and J+D.The removal rates of BkF presented the highest increase extent in the two treatments and increased 68.09%，63.78%respectively.In addition，the treatments were in the following order in terms of catalase enzyme activities：CK＞J＞J+D＞J+D+O（P＜0.05）.We found that there were significant（P＜0.05）linear negative correlation between the removal rates of the 10 individual HMW-PAHs and catalase activity in soil.However，the degradation rate of Chry，BkF，InP，DbA，BghiP had significant（P＜0.05）linear positive correlation with lignin peroxidase activity.In conclusion，the individual PAH was removed by different treatments selectively，and the degradation rate were significantly improved by adding starch.

a coal mining area；HMW-PAHs；immobilized Fusarium.sp；starch；aeration；soil enzyme activity

X53

A

1672-2043（2016）09-1709-08doi：10.11654/jaes.2016-0596

2016-04-28

河北省教育廳項(xiàng)目（Z2013058）；863專項(xiàng)（2012AA101403-3）

張雪娜（1990—），女，河北廊坊人，碩士生，主要從事環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)與監(jiān)控研究。E-mail：815798846@qq.com

楊志新E-mail：yangzhixin@126.com； 馮圣東E-mail：fengshengdong@126.com