rhEPO對(duì)缺糖缺氧大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1和GLAST表達(dá)的影響

龐一強(qiáng),楊　靜,吳　剛,汪　靜,姜樹原,3

(1.包頭市第四醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 014030；2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060；3.包頭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古包頭 014060)

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rhEPO對(duì)缺糖缺氧大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1和GLAST表達(dá)的影響

龐一強(qiáng)1△,楊靜2△*,吳剛2,汪靜1,姜樹原2,3

(1.包頭市第四醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 014030；2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060；3.包頭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古包頭 014060)

為了研究重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對(duì)缺糖缺氧(OGD)培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1和GLAST表達(dá)的影響，將缺糖缺氧培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞分成不同濃度rhEPO處理組：0、20、100 U/mL，不同濃度rhEPO與星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺氧缺糖條件下培養(yǎng)6 h，用RT-PCR 測(cè)定GLT-1和GLAST 的mRNA 表達(dá)變化，免疫印跡技術(shù)測(cè)定GLT-1和GLAST蛋白的表達(dá)變化。20、100 U/mL rhEPO星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的mRNA和蛋白質(zhì)水平較OGD對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，GLAST的mRNA和蛋白質(zhì)水平變化不明顯(P>0.05)。GLT-1水平可能與rhEPO對(duì)缺糖缺氧培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)。

重組人促紅細(xì)胞生成素；星形膠質(zhì)細(xì)胞；GLT-1；GLAST；缺糖缺氧

臨床上各種原因?qū)е碌募毙阅X損傷日趨增多，盡管外源性損傷的原因很多，但這些因素均可以導(dǎo)致直接或間接的缺血性腦損傷，其中谷氨酸的神經(jīng)毒在缺血性腦損傷的病理生理發(fā)展過程中起著十分重要的作用[1]。因此，對(duì)缺血期間谷氨酸水平的調(diào)控一直是腦缺血防治藥物研究的重點(diǎn)。有研究表明，可以通過上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞上谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST(EAAT1)和GLT-1(EAAT2)的表達(dá)或活性，增加缺血時(shí)谷氨酸的攝取，維持突觸間隙內(nèi)谷氨酸的正常濃度，從而降低興奮性毒性，減輕缺血性腦損傷[2]。近年來(lái)，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用日益受到人們的關(guān)注，其機(jī)制之一就是具有抗谷氨酸神經(jīng)毒的作用[3]。本研究利用不同濃度的rhEPO與大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺糖缺氧條件下共培養(yǎng)，研究重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)在星形膠質(zhì)細(xì)胞缺糖缺氧過程中對(duì)GLT-1和GLAST表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1材料

大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，CRL-2006 ATCC公司產(chǎn)品；DMEM(高糖)培養(yǎng)液，Hyclone公司產(chǎn)品；DMEM(無(wú)糖)培養(yǎng)液，鈕因華信公司產(chǎn)品；連二亞硫酸鈉，阿拉丁公司產(chǎn)品；rhEPO，上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒，Biosharp公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；SYBR Premix EXTaq，寶生物工程 (大連)有限公司產(chǎn)品；兔源GLAST、GLT-1多克隆抗體、GADPH單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗，Abcam 公司產(chǎn)品；BCA試劑，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑，由包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的缺糖缺氧培養(yǎng)常規(guī)復(fù)蘇大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，用DMEM(高糖)培養(yǎng)液培養(yǎng)至基本融合并鋪滿瓶底80%～90%后，將原培養(yǎng)液倒出，用PBS溶液清洗細(xì)胞3次，參照文獻(xiàn)[4-5]在細(xì)胞中加入含10 mmol/L連二亞硫酸鈉的DMEM無(wú)糖培養(yǎng)液一同轉(zhuǎn)移置厭氧培養(yǎng)箱中(培養(yǎng)箱中充入體積分?jǐn)?shù)為95%的氮?dú)夂?%的二氧化碳的混合氣體)，進(jìn)行 OGD 培養(yǎng)6 h。

1.2.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)rhEPO對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD培養(yǎng)后細(xì)胞中GLT-1和GLAST mRNA水平的影響將星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中按照上述方法進(jìn)行缺糖缺氧培養(yǎng)，并分為3個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)孔，分別為OGD對(duì)照組(OGD處理6 h)，rhEPO兩個(gè)劑量組(終濃度分別為20、100 U/mL)。取出不同組3個(gè)孔的細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行胰酶消化細(xì)胞，用PBS溶液洗脫，1 700 r/min離心5 min，去上清，收集細(xì)胞。使用Trizol Reagent試劑盒抽提細(xì)胞總mRNA，并用DEPC水定量至5 μg/μL。用Prime Script One Step RT-PCR Kit將總mRNA擬轉(zhuǎn)錄成cDNA，并定量。以表1中引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參，用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒和伯樂的IQ5 PCR系統(tǒng)擴(kuò)增cDNA中的組織因子基因片段和GAPDH基因片段，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s,共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min，停止反應(yīng)。計(jì)算每個(gè)樣品TF和GAPDH的△Ct，并采用△△Ct法，計(jì)算每個(gè)樣品中TF的mRNA轉(zhuǎn)錄倍數(shù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)值。

表1　試驗(yàn)用引物Table 1　Primers used in this study

1.2.3免疫印跡法檢測(cè)rhEPO對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD培養(yǎng)后細(xì)胞中GLT-1和GLAST 蛋白表達(dá)水平的影響取出不同組3個(gè)孔的細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，用PBS洗脫，1 700 r/min離心5 min，棄上清，用緩沖溶液重懸細(xì)胞至5×1010個(gè)。破碎后12 000 r/min離心20 min后取上清進(jìn)行電泳。參照文獻(xiàn)[7]用50 g/L濃縮膠和150 g/L分離膠進(jìn)行電泳分離，并用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。100 mL/L牛奶封閉PVDF膜1 h，37 ℃ 孵育一抗1 h， PBST清洗5 min×3，然后用37 ℃孵育二抗稀釋液，PBST清洗5 min×3，每次5 min。最后用Amersham公司的 ECL試劑盒進(jìn)行熒光顯色反應(yīng)，然后用3490 photo gel imaging systems (Epson,Japan)拍照并記錄，用Image Pro PLUS軟件分析目的蛋白/GAPDH的相對(duì)量，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)值。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS17. 0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件應(yīng)用方差分析對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1GLAST、GLT-1 mRNA 的檢測(cè)

由表2可以看出，GLAST mRNA表達(dá)在各組間未見有差異；GLT-1 mRNA表達(dá) 20、100 U/mL rhEPO組明顯高于OGD對(duì)照組，且100 U/mL rhEPO組高于20 U/mL rhEPO組(P<0.05)，表明當(dāng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行OGD培養(yǎng)時(shí)，加入rhEPO可明顯增強(qiáng)GLT-1 mRNA的表達(dá)量，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系；但對(duì)GLAST mRNA表達(dá)的影響不明顯。

表2　不同濃度rhEPO作用于OGD大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞 GLAST、GLT-1 mRNA表達(dá)的變化Table 2　The changes of mRNA of GLT-1 and GLAST in rat astrocytes cultured with different concentrations of rhEPO by oxygen-glucose deprivation(△△Ct, GAPDH as control，n = 3)

注：與OGD對(duì)照比較，*P<0.05;與20 U/mL rhEPO比較，#P<0.05。

Note:Compared with OGD control group,*P<0.05;compared with 20 U/mL rhEPO group,#P<0.05.

2.2GLAST、GLT-1蛋白的檢測(cè)

圖1A為免疫印跡法檢測(cè)GLAST、GLT-1蛋白的電泳結(jié)果，圖1B和圖1C為GLAST、GLT-1蛋白表達(dá)的相對(duì)量。由圖1C 可知，GLAST 蛋白質(zhì)表達(dá)在各不同濃度rhEPO組間未見有差異；而GLT-1蛋白質(zhì)表達(dá)20、100 U/mL rhEPO 組顯著高于OGD對(duì)照組，且100 U/mL rhEPO組高于20 U/mL rhEPO組(P<0.05)(圖1 B)，說(shuō)明當(dāng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行OGD培養(yǎng)時(shí)，加入rhEPO 可明顯增強(qiáng)GLT-1蛋白的表達(dá)量，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系；但對(duì)GLAST蛋白表達(dá)的影響不明顯。

3　討論

EPO是骨髓中血紅細(xì)胞前驅(qū)的細(xì)胞因子，是由166個(gè)氨基酸組成的酸性糖蛋白，分子質(zhì)量為34 ku，是一種刺激機(jī)體造血器官、促進(jìn)紅細(xì)胞生成的糖蛋白類激素。EPO與其受體廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的組織和器官中，并且在神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。近年來(lái)，EPO 由于具有促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育及神經(jīng)保護(hù)作用，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的影響備受關(guān)注[8]。其中，唐兆華[9]通過試驗(yàn)，證實(shí)了C-EPO預(yù)處理能明顯減輕體外氧糖剝奪/復(fù)氧損傷引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫；侯麗淳等[10]研究發(fā)現(xiàn)，EPO能夠降低大鼠腦出血模型中大鼠腦內(nèi)谷氨酸的含量，減輕腦水腫，減少大鼠周邊組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡；Yu D等[11]研究發(fā)現(xiàn)，EPO通過上調(diào)GLT-1和GLAST的表達(dá)而發(fā)揮對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。說(shuō)明EPO可以通過上調(diào)GLT-1和GLAST的表達(dá)、減輕興奮性神經(jīng)遞質(zhì)毒性作用、減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫等機(jī)制從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

與OGD對(duì)照比較，*P<0.05;與20 U/mL rhEPO比較，#P<0.05

Compared with OGD control group,*P<0.05;compared with 20 U/mL rhEPO group,#P<0.05

A.Western blot;B.GLT-1;C.GLAST

1.OGD;2.20 U/mL rhEPO;3.100 U/mL rhEPO

圖1免疫印跡分析GLAST、GLT-1在大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

Fig.1Western blot analysis of GLAST and GLT-1 expressions in astrocytes of rats

谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[12]。在腦缺血時(shí)谷氨酸的興奮性毒性作用會(huì)對(duì)腦組織造成嚴(yán)重的病理性損害。突觸間隙谷氨酸的清除主要依靠神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(excitatory amino acid transporters，EAATs)又稱高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體快速去除[13]。真核生物興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體分為GLAST(EAAT1)、GLT-1(EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4和EAAT5等5個(gè)亞型。GLAST和 GLT-1主要表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上，其中GLAST在小腦分子層的 Bergmann神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞含量最為豐富，在脊髓、前腦以及內(nèi)耳、視網(wǎng)膜等處也有少量表達(dá) 。GLT-1在中樞神經(jīng)分布廣泛，主要位于前腦、大腦皮質(zhì)、海馬等部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上，同時(shí)也表達(dá)在發(fā)育階段的神經(jīng)元上，GLT-1負(fù)責(zé)清除大約90%的谷氨酸[14]。GLT-1是眾多藥物發(fā)揮星形膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)作用的靶點(diǎn)，如余鵬[15]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以提高星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)，降低細(xì)胞外液谷氨酸濃度，減輕細(xì)胞損傷，從而對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞起到保護(hù)作用；王潔[16]則發(fā)現(xiàn)腺苷預(yù)處理可降低OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷程度，并使OGD后GLT-1的表達(dá)水平升高，從而增強(qiáng)了大腦對(duì)缺血再灌注損傷的耐受。在本研究中，在加入rhEPO后可明顯上調(diào)缺糖缺氧大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)，可能是通過GLT-1清除細(xì)胞外液谷氨酸而減輕缺血缺氧引起的谷氨酸的興奮性毒性作用，從而對(duì)缺糖缺氧培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。而要明確rhEPO通過何種途徑改變GLT-1的表達(dá)還需進(jìn)一步的研究。

[1]崔鑫.舒巴坦通過上調(diào)GLT-1的表達(dá)發(fā)揮抗大鼠缺血性腦損傷作用[D].河北石家莊：河北醫(yī)科大學(xué),2013.

[2]黃龍飛,錢貽崧,關(guān)騰,等.谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體靶點(diǎn)藥物的抗腦缺血作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志,2012(4):390-395.

[3]龔葳,吉訓(xùn)明,何士大,等.EPO在腦缺血神經(jīng)保護(hù)作用中的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2008,37(8):11-12.

[4]黃鶴鳴.大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞糖氧剝奪后AQP4表達(dá)變化及1,5-DCQA干預(yù)作用[D].廣東廣州：暨南大學(xué),2013.

[5]石瑞麗,胡金鳳,孔令雷,等.瓜子金皂苷對(duì)連二亞硫酸鈉致氧糖剝奪/復(fù)供誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的抑制作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013,29(3):333-336.

[6]鄺曉嬌,張世棟,董書偉,等.丹參水提物對(duì)山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥模型中基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(3):54-59.

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[13]弓淑娟.GLT-1在間歇低壓缺氧預(yù)處理及腦缺血預(yù)處理中的作用[D].河北石家莊：河北醫(yī)科大學(xué),2012.

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[16]王潔.腺苷預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧糖后CX3CL1、GLT-1表達(dá)的研究[D].河南新鄉(xiāng)：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,2015.

Effects of rhEPO on Expressions of GLT-1 and GLAST in Rat Astrocyte of Cultured by Oxygen-glucose Deprivation

PANG Yi-qiang1,YANG Jing2,WU Gang2,WANG Jing1,JIANG Shu-yuan2,3

(1.TheFourthHospitalofBaotou,Baotou,InnerMongolia,014030,China;2.DepartmentofBasicMedicineandForensicMedicine,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China;3.CentralLaboratory,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China)

In order to study effects of rhEPO on the expressions of GLT-1 and GLAST in rat astrocytes cultured by oxygen-glucose deprivation,the astrocytes of rats cultured by oxygen-glucose deprivation were divided into three groups with different concentrations of rhEPO 0, 20, 100 U/mL and cultured for 6 hours by hypoxia-glucose deprivation.The real-time PCR and Western blot were used to detect the changes of mRNA and protein expressions of GLT-1 and GLAST,respectively.In comparison with OGD control,mRNA and protein levels of GLT-1 were found to be increased in the groups of 20 and 100 U/mL rhEPO (P<0.05),but the changes of GLAST were not obvious(P>0.05).The changes of GLT-1 may be related to protective effects of rhEPO on astrocytes of rats cultured by oxygen-glucose deprivation.

rhEPO; astrocyte; GLT-1; GLAST; oxygen-glucose deprivation

2016-02-24

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013MS1111);包頭市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(Wsjj2015016)

龐一強(qiáng)(1978-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事神經(jīng)外科學(xué)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者。*通訊作者

S852.23

A

1007-5038(2016)10-0081-04