電針“曲池”“足三里”穴對(duì)缺血再灌注損傷大鼠紋狀體DARPP-32磷酸化的影響*

林云嬌王露露吳　潔黃　佳宋長(zhǎng)明

林冰冰1，2，3柳維林1，2，3陶　靜1，2，3陳立典1，2，3，4△

·研究報(bào)告·

電針“曲池”“足三里”穴對(duì)缺血再灌注損傷大鼠紋狀體DARPP-32磷酸化的影響*

林云嬌1，2，3王露露1，2，3吳潔1，2，3黃佳1，2，3宋長(zhǎng)明1，2，3

林冰冰1，2，3柳維林1，2，3陶靜1，2，3陳立典1，2，3，4△

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州350122；2.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122；3福建康復(fù)產(chǎn)業(yè)研究院，福建福州350122；4.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復(fù)研究中心，福建福州350122）

目的觀察電針“曲池”“足三里”穴對(duì)腦缺血再灌注損傷局灶性大腦中動(dòng)脈閉塞模型（MCAO）大鼠神經(jīng)行為學(xué)的變化及多巴胺和環(huán)磷酸腺苷調(diào)節(jié)的蛋白（DARPP-32）磷酸化的影響。方法將25只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（6只）、手術(shù)組（19只）。手術(shù)組采用Longa線拴法制備左側(cè)左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）大鼠模型，將造模后符合納入標(biāo)準(zhǔn)的12只大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組，各6只。電針組取“曲池”和“足三里”穴，電針干預(yù)14 d，假手術(shù)組和模型組在同等條件下抓取及固定，不予任何干預(yù)。通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分判斷大鼠的神經(jīng)功能缺損情況；小動(dòng)物磁共振儀（MRI）掃描觀察腦梗死體積，Western blot檢測(cè)紋狀體DARPP-32、p-Thr75-DARPP-32的表達(dá)情況。結(jié)果與模型組相比，電針組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分降低（P＜0.05），腦梗死體積減少（P＜0.05），紋狀體p-DARPP-32-Thr75/DARPP-32比值增高（P＜0.05）。結(jié)論電針“曲池”和“足三里”穴可改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，其機(jī)制可能與促進(jìn)缺血紋狀體的DARPP-32在Thr75位點(diǎn)的磷酸化有關(guān)。

腦缺血電針DARPP-32 p-DARPP-32-Thr75

【Abstract】Objective：To observe the effect of electro-acupuncture at Quchi（LI11）and Zusanli（ST36）on the change of neurological deficit，and the phosphorylation of dopamine and cyclic adenosin 3′，5′-monophosphate regulated phosphoprotein（DARPP-32）in rat after cerebral ischemia reperfusion injury.M ethods：25 male SD ratswere randomly divided into the sham operation group（n=6）and the operation group（n=19）.The operation group were under the operation of the leftmiddle cerebral artery occlusion（MCAO）by themodified Longa′methods，and 12 qualified ratswere randomly divided into themodel group（n=6）and the electro-acupuncture group（n=6）.The electro-acupuncture group received electro-acupuncture at Quchi（LI11）and Zusanli（ST36）for 14 days.The neurological deficit was assessed；the cerebral infarct volume was scanned with animalmagnetic resonance imaging（MRI）machine.The protein expression of DARPP-32 and p-Thr75-DARPP-32 were detected by Western blotting technique.Results：Compared with themodel group，the neurological deficit score in the electro-acupuncture group was improved（P＜0.05）.The size of infarct volume was significantly reduced（P＜0.05）. The radio of p-DARPP-32-Thr75/DARPP-32 in corpus striatum in electro-acupuncture group was higher than that in themodel group（P＜0.05）.Conclusion：The electro-acupuncture at Quchi（LI11）and Zusanli（ST36）can promote the recovery of neurologic deficit symptom，which may be associated with promoting the phosphorylation of DARPP-32 on Thr75.

【Key words】Cerebral ischemia；Electro-acupuncture；DARPP-32；p-DARPP-32-Thr75在我國(guó)，腦卒中后幸存患者中70%～80%遺留不同程度的功能障礙［1］，嚴(yán)重響患者的生存質(zhì)量，同時(shí)也帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。腦缺血時(shí)紋狀體神經(jīng)細(xì)胞外興奮性氨基酸（EAA）和多巴胺（DA）含量明顯升高并參與紋狀體神經(jīng)元局部缺血損傷的進(jìn)展［3-4］，而多巴胺和環(huán)磷酸腺苷調(diào)節(jié)的蛋白（DARPP-32）與這兩類的神經(jīng)元遞質(zhì)功能調(diào)節(jié)有關(guān)。有研究證明大鼠腦缺血后紋狀體區(qū)DARPP-32在Thr34（蘇氨酸殘基）位點(diǎn)上的磷酸化水平與缺血后神經(jīng)功能缺損程度相一致［5-6］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)周期性依賴蛋白激酶（Cdk5）磷酸化的DARPP-32（Thr75）是環(huán)磷酸腺苷依賴性蛋白激酶（PKA）的抑制劑［7］，可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。前期臨床和基礎(chǔ)研究表明電針“曲池”和“足三里”穴可以有效改善缺血性腦卒中后運(yùn)動(dòng)功能障礙［8-9］。因此本課題組通過(guò)觀察電針曲池、足三里穴是否通過(guò)影響DARPP-32在Thr75（蘇氨酸殘基）位點(diǎn)的磷酸化水平來(lái)治療腦缺血再灌注損傷，改善大鼠腦缺血后的神經(jīng)功能缺損癥狀及運(yùn)動(dòng)功能障礙。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量200～250 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-002］，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)（動(dòng)物使用許可證號(hào)：2014-001）。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，維持室溫20～22℃，模擬標(biāo)準(zhǔn)日夜系統(tǒng)，所有試驗(yàn)均遵照國(guó)際動(dòng)物保護(hù)和使用指南的規(guī)定實(shí)施。

1.2試劑與儀器DARPP-32（Abacam，England）、Phospho-DARPP-32（Thr75）（Cell Signaling Technology，USA）、β-actin一抗及辣根過(guò)氧化物酶二抗（Cell Signaling，Beverly，MA，USA）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（賽默飛世爾，美國(guó)）、異氟烷（瑞沃德，中國(guó)），動(dòng)物步態(tài)分析系統(tǒng)（CatWalk XT 10.0，Noldus，Holland）、疲勞轉(zhuǎn)棒測(cè)試儀（Rat Rota-Rod，UGO BASILE，ITALY）、7.0T小動(dòng)物磁共振儀（Pharmascan，microMRI，Bruker，Germany）、10%水合氯醛。

1.3分組與造模將25只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=6）和手術(shù)組（n=19），所有大鼠術(shù)前禁食12 h，稱體質(zhì)量后，用10%水合氯醛3 mL/kg經(jīng)腹腔注射麻醉。麻醉后，手術(shù)組采用Longa［10］法制備左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型，仰臥固定大鼠，頸部皮膚消毒備皮后，沿前正中線切開(kāi)頸部皮膚，以此分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈；用結(jié)扎線依次結(jié)扎頸動(dòng)脈近心端，用顯微血管夾夾住頸內(nèi)動(dòng)脈，在距頸總動(dòng)脈分叉處約1.0 cm處用顯微剪刀剪一切口，將直徑為0.2mm的魚(yú)線從切口處緩慢進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，松開(kāi)血管夾，當(dāng)魚(yú)線頭端到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始端處（從頸

外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處起計(jì)算插入約18～22 mm）即可。固定線栓，縫合切口。手術(shù)結(jié)束后，動(dòng)物置于室溫環(huán)境下蘇醒。2 h后緩慢退出魚(yú)線至分叉處，從而形成缺血再灌注模型。假手術(shù)只分離左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，不予插線栓。實(shí)驗(yàn)全過(guò)程和動(dòng)物蘇醒期間注意保暖，保持室溫在25℃左右，直至大鼠重新恢復(fù)活動(dòng)。手術(shù)后，大鼠予正常進(jìn)食及飲水。大鼠蘇醒后，根據(jù)Longa［10］評(píng)分法對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，用以判斷模型是否成功：無(wú)神經(jīng)功能缺損，0分；提尾時(shí)右前肢內(nèi)收，不能完全伸展，1分；自發(fā)行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，2分；行走時(shí)身體向右側(cè)傾倒，3分；不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失，4分。0分及4分者給予剔除。最終18只大鼠納入研究，假手術(shù)組、模型組、電針組各6只。

1.4干預(yù)措施電針組大鼠在造模后第1天即進(jìn)行電針干預(yù)。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［11］的大鼠取穴方法，取大鼠右側(cè)曲池、足三里穴。用0.5寸毫針（華佗牌30號(hào)），直刺2～3mm，接電針儀（G6805型），電壓峰值為6 V，疏密波，頻率1～20 Hz，以大鼠肢體輕微抖動(dòng)為度，治療時(shí)間為每次30min，每日1次，療程為14 d。假手術(shù)組及模型組于同一時(shí)間用同樣方法固定30 min，每日1次，固定時(shí)程為14 d，但不予電針干預(yù)。

1.5觀察項(xiàng)目1）Longa評(píng)分：缺血再灌注后2 h及造模14 d后，對(duì)模型組和電針組大鼠分別進(jìn)行兩次Longa神經(jīng)功能缺損評(píng)分。該個(gè)評(píng)估由一名對(duì)本研究不知情的觀察者完成。2）小動(dòng)物磁共振儀掃描：造模后14 d后，將大鼠用3%的異氟烷在1∶4的氧氣和空氣混合氣體中誘導(dǎo)麻醉5 min后。掃描時(shí)將大鼠仰臥于小動(dòng)物磁共振掃描床上。掃描過(guò)程中用混在氧氣和空氣的0.2%異氟烷經(jīng)鼻導(dǎo)管來(lái)維持麻醉，并維持掃描環(huán)境穩(wěn)定，同時(shí)使用動(dòng)物生理檢測(cè)儀檢測(cè)大鼠體溫、血氧飽和度及呼吸、心率，并通過(guò)溫控及通風(fēng)系統(tǒng)維持整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中生理狀態(tài)的穩(wěn)定。解剖結(jié)構(gòu)像掃描應(yīng)用RARE技術(shù)顯示T2WI圖像，掃描參數(shù)如下：TE/TR=60 ms/ 1200 ms，F(xiàn)OV 32 mm×32 mm，層間距0，層厚=1 mm，層數(shù)=21，矩陣256×256，翻轉(zhuǎn)角90°。T2WI所獲得的原始數(shù)據(jù)通過(guò)Image J軟件進(jìn)行腦梗死體積的計(jì)算。方法為：計(jì)算每層腦梗死的體積（每層腦梗死的面積× 1mm），每個(gè)腦組織的腦梗死總體積即所有層面腦梗死體積之和，腦梗死百分比為腦梗死體積與全腦體積之比。

1.6標(biāo)本采集與檢測(cè)造模14 d后，在行Longa評(píng)分及采集T2WI圖像后，立即將各組大鼠用10%的水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉后，快速斷頭取腦，于冰上剝離出左側(cè)（正常組大鼠）或缺血側(cè)（模型組及電針組大鼠）紋狀體，置于EP管中，-80℃冰箱保存準(zhǔn)備進(jìn)行Western blot檢測(cè)。嚴(yán)格按照組織總蛋白的提取和濃度測(cè)定說(shuō)明書(shū)操作，取紋狀體樣本各約100mg放入勻漿器，加入RIPA裂解液1mL，于冰上充分研磨后，4℃，14000 r/min離心10min，緩慢吸取上清液。采用BCA法測(cè)定各樣本蛋白濃度。100℃加熱5min，使蛋白充分變性后，取50μg樣品蛋白經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到聚偏二乙烯膜后，用5%脫脂奶封閉2 h，分別加入抗β-actin（1∶8000）、抗DARPP-32（1∶5000）、P-DARPP-32（1∶1000）一抗，4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST洗膜后，用辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗（1∶5000）孵育60min。將PVDF膜放在圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜，反應(yīng)1min，成像；應(yīng)用Image lab軟件設(shè)計(jì)計(jì)算蛋白條帶光密度進(jìn)行分析處理。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0處理，計(jì)量資料均以（表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)用LSD方法，不齊時(shí)用Games-Howell方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1電針對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響見(jiàn)表1。腦缺血再灌注后2 h，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組及電針組大鼠Longa評(píng)分升高（P＜0.05），但模型組與電針組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。電針治療14 d后，電針組Longa評(píng)分低于模型組（P＜0.05），說(shuō)明電針“曲池”和“足三里”穴可改善缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)缺損癥狀。

表1　各組大鼠Longa評(píng)分、梗死體積百分比、DARPP-32（/β-acting）、p-DARPP-32-Thr75蛋白表達(dá)比較（

表1　各組大鼠Longa評(píng)分、梗死體積百分比、DARPP-32（/β-acting）、p-DARPP-32-Thr75蛋白表達(dá)比較（

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別n DARPP-32 /β-acting Longa評(píng)分　造模14 d梗死體積百分比（%）p-DARPP-32-Thr75/DARPP-32假手術(shù)組6模型組6造模2 h造模14 d 0 0 0 2.50±0.22*2.16±0.17 15.51±0.018 0.934±0.019 0.934±0.022 0.932±0.012 0.361±0.038**電針組6 2.33±0.21*1.50±0.22△9.56±0.008△0.948±0.016 0.702±0.016**△△

2.2電針對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響見(jiàn)圖1，表1。腦缺血再灌注后2 h，模型組與電針組之間Longa評(píng)分無(wú)顯著差異（P＞0.05），因此可推測(cè)模型組與電針組大鼠之間的梗死體積也無(wú)顯著差異。電針治療14 d后，如圖1所示，磁共振T2加權(quán)成像，模型組、電針組均可看到高信號(hào)，即為梗死區(qū)域。電針組大鼠比模型組大鼠腦梗死體積明顯降低（P＜0.05），說(shuō)明電針“曲池”和“足三里”穴可減少缺血性腦卒中大鼠的腦梗死體積。

2.3電針對(duì)MCAO大鼠紋狀體DARPP-32、p-DARPP-32-Thr75表達(dá)的影響見(jiàn)圖2，表1。假手術(shù)組、模型組、電針組DARPP-32蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯差異（P＞0.05）；模型組大鼠紋狀體區(qū)的p-DARPP-32-Thr75蛋白的表達(dá)低于假手術(shù)組（P＜0.05），而電針組大鼠紋狀體區(qū)的p-DARPP-32-Thr75蛋白的表達(dá)高于模型組（P＜0.05），說(shuō)明電針“曲池”和“足三里”穴可促進(jìn)大鼠腦缺血后紋狀體區(qū)p-DARPP-32-Thr75的表達(dá)。

圖1　各組大鼠造模14 d后磁共振T2加權(quán)成像

圖2　各組大鼠缺血紋狀體DARPP-32、p-DARPP-32-Thr75蛋白表達(dá)情況

3　討　論

腦卒中在中醫(yī)學(xué)中屬于“中風(fēng)”范疇，腦卒中發(fā)生后會(huì)導(dǎo)致氣血陰陽(yáng)失調(diào)，經(jīng)脈閉阻，偏身經(jīng)氣，尤其是陽(yáng)經(jīng)經(jīng)氣受阻，經(jīng)脈失養(yǎng)，而發(fā)偏雍。因此治療腦卒中當(dāng)以調(diào)整氣血、平衡陰陽(yáng)、疏通經(jīng)脈為主要治療原則。歷代文獻(xiàn)已有對(duì)中風(fēng)療法治療的記載，《素問(wèn)·痿論篇》提出了“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”的基本治則。曲池穴是手陽(yáng)明大腸經(jīng)的合土穴，足三里穴是足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴和胃經(jīng)的下穴，因此針刺曲池和足三里穴可通調(diào)腹氣，使氣機(jī)條暢，氣血調(diào)和，進(jìn)而能達(dá)到活血化瘀的功效。兩個(gè)穴位的臨床及基礎(chǔ)研究均顯示療效顯著［7-9，12-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，電針“曲池”和“足三里”穴能有效改善腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺損癥狀。

目前研究表明，紋狀體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)缺血比較敏感的部位［15］。且紋狀體的中型多棘神經(jīng)元是反饋和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)以及多巴胺神經(jīng)支配的重要部分，這些神經(jīng)元表達(dá)高水平的特異性信號(hào)蛋白，其中包括DARPP-32以及蛋白磷酸酶-1調(diào)節(jié)的亞基-1B（PPP1R1B），是多種細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的多種信號(hào)通路的樞紐［16-17］。其中DARPP-32是在紋狀體中型多極神經(jīng)元高度密集的胞質(zhì)蛋白，并且是紋狀體處多巴胺激活腺苷環(huán)化酶（cAMP）的主要鉬靶［18-19］。多巴胺轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)或抑制PKA通路的功能，取決于它磷酸化的狀態(tài)。研究表明，紋狀體在靜息狀態(tài)下，Cdk5磷酸化DARPP-32上的Thr75位點(diǎn)來(lái)抑制多巴胺信號(hào)通路的效應(yīng)，而多巴胺通過(guò)其D1受體誘導(dǎo)cAMP依賴蛋白（PKA）的激活，以此來(lái)減小紋狀體DARPP-32在Thr75位點(diǎn)上的磷酸化程度來(lái)消除這個(gè)抑制作用［20］。而腦缺血時(shí)，紋狀體神經(jīng)細(xì)胞外過(guò)量釋放的EAA和DA是造成其缺血性損傷的重要因素［21］；EAA主要是指谷氨酸（Glu），它的興奮毒作用可引起細(xì)胞損傷，而DARPP-32是Glu和DA發(fā)生直接作用的唯一結(jié)點(diǎn)。DA作用于D1受體使PKA活性增加，從而磷酸化DARPP-32（Thr34），轉(zhuǎn)化為蛋白磷酸酶1（PP-1）的強(qiáng)效抑制劑，使PP-1的活性受到抑制，造成胞內(nèi)一些蛋白質(zhì)磷酸化程度增加［22］，從而對(duì)細(xì)胞造成損傷。有研究表明，腦缺血后DARPP-32在紋狀體中的蛋白表達(dá)沒(méi)有差異性［23］。缺血時(shí)，釋放大量多巴胺，激活PKA，促進(jìn)紋狀體DARPP-32在Thr34的磷酸化水平升高［24-25］，且該磷酸化水平與紋狀體損傷程度相平行，相反地，DARPP-32在Thr75的磷酸化水平下降。

綜上所述，本研究證實(shí)電針“曲池”“足三里”穴可改善缺血再灌注損傷鼠行為缺損癥狀，減小梗死體積，其機(jī)制可能與促進(jìn)DARPP-32在Thr75位點(diǎn)上的磷酸化程度，抑制PKA減弱多巴胺通路效應(yīng)，減小對(duì)細(xì)胞的損傷，從而緩解腦缺血再灌注損傷及產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不能完全闡釋電針改善MCAO大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的具體機(jī)制，其效應(yīng)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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Effects of Electroacupuncture at Quchi（LI11）and Zusanli（ST36）on DARPP-32 Phosphorylation in Rat Striatum after Cerebral Ischmeia-reperfusion

LIN Yunjiao，WANG Lulu，WU Jie，et al.College of Rehabilitation Medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)ujian，F(xiàn)uzhou 350122，China.

R245.9+7

A

1004-745X（2016）09-1645-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.001

2016-05-27）

·綜述·

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273835；81373778）；福建省衛(wèi)生廳青年科研課題（2014-1-70）

（電子郵箱：cld@fjtcm.edu.cn）