• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機能的影響*

    2016-10-18 07:41:50張亞晨溫海深李蘭敏馮啟超
    關(guān)鍵詞:許氏芳香化性腺

    張亞晨, 溫海深, 李蘭敏, 馮啟超

    (中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東 青島 266003)

    ?

    急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機能的影響*

    張亞晨, 溫海深??, 李蘭敏, 馮啟超

    (中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東 青島 266003)

    為探究溫度對妊娠期許氏平鲉(Sebastesschlegelii)生殖內(nèi)分泌機能的影響,采用內(nèi)分泌學(xué)和分子生物學(xué)方法,對急性溫度脅迫后許氏平鲉的血清性類固醇激素的變化及腦和卵巢生殖相關(guān)基因表達的變化進行了系統(tǒng)的探究和分析。研究表明:妊娠期許氏平鲉的性腺型芳香化酶(P450aromA)具有溫度敏感性。血清中17β-雌二醇(E2)和卵巢雌激素受體α(ERα)表達水平在急性高溫脅迫后發(fā)生了顯著下降,在急性低溫脅迫后明顯升高。在溫度脅迫下,卵巢中雌激素受體β1(ERβ1)和雌激素受體β2(ERβ2)呈現(xiàn)出顯著不同的表達方式;急性高溫脅迫后,與性腺型芳香化酶基因(CYP19a1a)相比,腦型芳香化酶基因(CYP19a1b)的轉(zhuǎn)錄水平上升顯著,表明二者在不同組織中承擔著不同的生理功能;在妊娠期許氏平鲉腦中,CYP19a1b、E2、ERα間形成了自動反饋調(diào)節(jié),促進CYP19a1b的轉(zhuǎn)錄;此外,F(xiàn)oxl2能夠促進腦中芳香化酶的表達。研究結(jié)果表明,妊娠期許氏平鲉對高溫脅迫更敏感,所需恢復(fù)期更長。在實際生產(chǎn)中,對于進入生殖期的雌魚,應(yīng)密切關(guān)注養(yǎng)殖水溫的變化,減少溫度應(yīng)激。維持水溫的相對恒定,以保證親魚胚胎發(fā)育和產(chǎn)仔進程的順利進行。

    許氏平鲉;溫度;生殖內(nèi)分泌機能;芳香化酶;雌激素受體

    引用格式: 張亞晨,溫海深,李蘭敏,等. 急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機能的影響[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,46(9): 29-37.

    ZHANG Ya-Chen, WEN Hai-Shen, LI Lan-Min, et al. Effects of acute temperature stress on the reproductive endocrine function of gestational ovoviviparous black rockfish (Sebastesschlegelii) [J].Periodical of Ocean University of China, 2016,46(9): 29-37.

    硬骨魚類作為一種低等的脊椎動物,其生長、發(fā)育與生殖進程很容易受到外界環(huán)境的影響。其中,溫度對于魚類的生殖過程起著至關(guān)重要的作用,包括配子發(fā)育、成熟、排卵或排精、產(chǎn)卵、胚胎發(fā)育與孵化等[1-3]。許多研究表明,水溫會改變下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸中各因素水平從而對魚類的生殖進程產(chǎn)生影響。在室溫范圍內(nèi),溫度升高導(dǎo)致金錢魚(Scatophagusargus)性腺成熟指數(shù)(GSI)和血清E2水平的顯著升高[2];高溫抑制性腺內(nèi)基因表達,阻礙性類固醇激素合成酶的合成,使性腺功能受到干擾[3];高溫還導(dǎo)致大西洋鮭(Salmosalar)在配子形成期性類固醇合成和肝糖原生成受阻,使肝臟中ERs表達水平發(fā)生變化,進而影響親魚的能量分配和配子的產(chǎn)生與成熟[4];此外,低溫對魚類生殖進程的影響亦有報道,對文昌魚(Branchiostomalanceolatum)的研究發(fā)現(xiàn),低溫條件下,文昌魚性腺趨于向雌性分化,這可能與溫度變化導(dǎo)致的芳香化酶合成和活性改變有關(guān)[5]。

    魚類的生殖過程主要受到HPG軸的調(diào)控,下丘腦、垂體和性腺形成一個閉合的自動反饋體系,共同維持魚類生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的相對穩(wěn)定,在性腺分化、發(fā)育、成熟及排卵過程中都發(fā)揮著十分重要的作用[6]。芳香化酶是細胞色素P450酶系的一種,主要分布在腦和性腺中,是一種催化C19雄激素(睪酮(T)和雄烯二酮不可逆地轉(zhuǎn)化為C18雌激素(E2和雌酮)過程中的關(guān)鍵限速酶[7],并通過其產(chǎn)物調(diào)控魚類的生理和生殖過程。Foxl2能夠激活芳香化酶基因的轉(zhuǎn)錄[8],參與性類固醇的生物合成途徑。ERs是類固醇激素核受體家族的一員,能夠間接調(diào)控雌激素生理功能的發(fā)揮[9]。此外,孕激素在魚類生殖過程中也發(fā)揮著極重要的作用,例如17α,20β-雙羥孕酮(DHP)在鲉科魚的妊娠期中發(fā)揮了積極作用[10]。近年來針對孕酮(P4)的研究發(fā)現(xiàn),它能夠調(diào)控雌魚卵巢的最終成熟和產(chǎn)卵[11]。

    許氏平鲉(Sebastesschlegelii)又名黑鲪、黑石鱸、黑頭等,屬于鲉形目(Scorpaeniformes)鲉科(Scorpaenidae)平鲉屬(Sebastes),主要分布在太平洋西部水域。該魚具有營養(yǎng)豐富、生長快速、抗病力強等優(yōu)點,目前已逐步成為人工魚礁區(qū)增殖、網(wǎng)箱和工廠化養(yǎng)殖的魚類之一,具有重要經(jīng)濟價值。此外,由于許氏平鲉卵胎生生殖方式的特殊性,也使其成為魚類進化研究的模式動物之一。在自然條件下,許氏平鲉妊娠期處于4~5月,水溫為10.0~16.8 ℃,產(chǎn)仔盛期適宜水溫為13~16 ℃。對于卵胎生和胎生魚類,水體溫度與妊娠期親魚的生理狀況和胚胎發(fā)育情況均密切相關(guān)。因此親魚在此時期對溫度變化較敏感,水溫如發(fā)生急劇變化,會導(dǎo)致親魚的健康狀況、胚胎的發(fā)育情況發(fā)生改變,進而影響產(chǎn)出仔魚的優(yōu)劣程度和種群補充。但目前關(guān)于溫度對妊娠期許氏平鲉的生理和生殖情況影響的研究鮮有報道。

    為進一步探索溫度對妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機能的影響,本文研究了妊娠期許氏平鲉的血清性類固醇水平、腦和卵巢中生殖相關(guān)基因表達水平在急性溫度脅迫后的變化情況,為評估親魚在溫度突變水體中適應(yīng)性和恢復(fù)性提供理論依據(jù),為優(yōu)化許氏平鲉全人工繁殖提供技術(shù)參考。

    1 材料與方法

    1.1 實驗魚類

    實驗魚于2013年5月采自山東省蓬萊市沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖群體。挑選72尾健康無病的妊娠期許氏平鲉(體重(879.03±22.61)g),實驗前于20個玻璃水槽(長×寬×高:80 cm×60 cm×40cm)中馴化3d,每缸4尾。馴化期間控制水溫在16℃左右,模擬自然光周期14L∶10D,連續(xù)充氣保持溶氧濃度在7mg/L左右,pH 7.5~7.8。每日上午10:00換水,換水量為1/2水槽水量。

    1.2 實驗設(shè)計

    實驗設(shè)置7、16(室溫對照)和25℃,共3個溫度水平。急性溫度脅迫實驗在2個體積為0.785m3的圓柱形塑料桶(直徑1m,深度0.8m)中進行。分別使用控溫加熱棒和海水冰塊將桶中海水溫度調(diào)至25和7℃。從馴化水槽中分別隨機選取24尾規(guī)格相近、活力較好的許氏平鲉放入7和25℃海水中,另保留剩余24尾于16℃水中作為常溫對照組。在高溫和低溫脅迫2h后,將其轉(zhuǎn)移至16℃海水中恢復(fù)。由于許氏平鲉親魚在產(chǎn)仔期停止攝食,因此實驗過程中不進行投飼。實驗期間連續(xù)充氣,每隔4h校準一次溫度;采用HQd便攜式多參數(shù)數(shù)字化分析儀(Hach,美國)監(jiān)控海水溫度和溶解氧含量。

    1.3 樣品采集與處理

    在恢復(fù)期第0、6、12、24、48及72h對3組實驗魚進行采樣,每組每次隨機取魚4尾。將魚投入含濃度為200mg/L的MS222的海水中麻醉,尾靜脈取血,血樣制備血清后移入-20℃保存待測;取血后采集卵巢組織和全部腦組織,于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 血清中17β-雌二醇(E2)和P4水平的測定

    使用碘[125]I雌二醇放射免疫分析試劑盒(九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司,天津)和碘[125]I孕酮放射免疫分析試劑盒,采用RIA液相平衡競爭放射性免疫分析法進行實驗魚血清中E2和P4水平的測定。具體測定方案參考Shi等[12]的方法。

    1.5 卵巢和腦中CYP19a1a、Foxl2、ERα、ERβ1和ERβ2表達水平的分析方法

    卵巢和腦組織中的總RNA按照trizol法提取。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TAKARA,日本)進行總RNA的純化和cDNA的反轉(zhuǎn)錄。實驗所需的CYP19a1b的特異性引物由Primer Premier5.0軟件設(shè)計(見表1)。由前人研究結(jié)果得到CYP19a1a[13]、ERα[12]、ERβ1[14]、ERβ2[14]、Foxl2[13]和內(nèi)參基因βactin[15]的特異性引物。

    表1 基因表達分析的特異性引物

    采用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TAKARA,日本)檢測CYP19a1a、CYP19a1b、Foxl2、ERα、ERβ1和ERβ2的表達水平;檢測過程在StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,美國)上進行。

    每個樣品設(shè)置3個重復(fù),特異性引物的退火溫度和循環(huán)數(shù)經(jīng)優(yōu)化后如下:95℃變性30s;95℃變性5s,60℃ 退火30s,此步驟循環(huán)40次。在PCR運行結(jié)束后制作引物溶解曲線,分析其擴增效率以確保引物特異性和產(chǎn)物的單一性。根據(jù)實驗結(jié)果,以βactin為內(nèi)參基因,根據(jù)2-△△CT方法計算得到各基因的相對表達量。

    1.6 數(shù)據(jù)處理

    使用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA),探究溫度和時間對血清性類固醇水平和卵巢中生殖相關(guān)基因表達水平的影響。若滿足方差齊性,作Student-Neuman-Keuls多重比較,分析不同溫度組間或不同恢復(fù)時間之間各指標數(shù)據(jù)的差異顯著性;若不滿足方差齊性,則采用Games-Howell法進行分析。以p<0.05表示差異顯著,結(jié)果以均值±標準誤(Mean±SE)表示。

    2 結(jié)果

    2.1 血清E2和P4水平

    如圖1所示,急性溫度脅迫后,血清E2水平在恢復(fù)期發(fā)生顯著變化。6h時25℃脅迫組顯著低于其他2組(p<0.05),并在12h時降至最低值((4.66±0.88)pg/mL),隨后逐漸上升,72h時恢復(fù)至對照組水平;7℃脅迫組實驗魚的血清E2水平呈現(xiàn)相反的變化趨勢,12h時顯著升高(p<0.05),增至(16.11±1.22)pg/mL,顯著高于25 ℃脅迫組和對照組(p<0.05),24h時顯著降低,恢復(fù)至對照組水平(p<0.05)。血清P4水平在25 ℃急性脅迫后第6 h時顯著升高(p<0.05),并在12 h升至最高值(6.32±0.74 ng/mL),為對照組的3.05倍,48 h時顯著下降(p<0.05),恢復(fù)至正常水平;7 ℃急性脅迫后血清P4水平無顯著變化(p>0.05),始終維持在正常水平。

    2.2 卵巢和腦中CYP19a和Foxl2基因表達水平

    如圖2所示,25℃急性脅迫后,卵巢中CYP19a1a表達水平在恢復(fù)期第6h顯著下降(p<0.05),并顯著低于其他2組(p<0.05)。12~24h其表達維持在較低水平,隨后逐漸上升,至72h時恢復(fù)至對照組水平(p<0.05)。7 ℃急性脅迫后,CYP19a1a轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生顯著變化(p>0.05)。實驗觀察到,2種溫度處理后,卵巢中Foxl2的表達水平有一定波動,但無顯著差異(p>0.05)。

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05)。Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖1急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉血清E2和P4水平的影響

    Fig.1Effect of acute temperature stress on serum 17β-estradiol and progesterone of gestationalSebastesschlegelii

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05)。Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖2急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉卵巢中CYP19a1a和Foxl2表達水平的影響

    Fig.2Effect of acute temperature stress on expression levels of CYP19a1a and Foxl2 mRNAs in ovary of gestationalSebastesschlegelii

    如圖3所示,25℃急性脅迫后,腦中CYP19a1b和Foxl2表達水平均在6h時顯著升高(p<0.05),與對照組差異顯著(p<0.05),分別為正常水平的1.66倍和2.11倍。隨后二者轉(zhuǎn)錄水平逐漸恢復(fù)至對照組水平。7℃急性脅迫后的72h恢復(fù)期內(nèi),CYP19a1b的表達水平呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢,但此變化與對照組水平差異并不顯著(p>0.05)。

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖3急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉腦中CYP19a1b和Foxl2表達水平的影響

    Fig. 3Effect of acute temperature stress on expression levels of CYP19a1b and Foxl2 mRNAs in brain of gestationalSebastesschlegelii

    2.3 卵巢和腦中ERα表達水平

    實驗發(fā)現(xiàn),7 ℃脅迫組的實驗魚卵巢中ERα轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(p<0.05),12h時增至對照組的1.67倍,恢復(fù)期第24h時恢復(fù)至正常水平;25℃脅迫組中,ERα表達水平在脅迫后恢復(fù)期第6h顯著下降(p<0.05),并在12h降至最低,與其他溫度組水平差異顯著(p<0.05)。隨后緩慢升高恢復(fù)。腦中ERα的表達水平在25℃急性脅迫后恢復(fù)第6h時顯著升高(p<0.05),顯著高于其他2組,為對照組水平的1.97倍,并在12h時恢復(fù)正常;與此不同的是,在7℃急性脅迫后,腦中ERα轉(zhuǎn)錄水平無顯著變化(p>0.05),與對照組持平(見圖4)。

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖4急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉卵巢和腦中ERα表達水平的影響

    Fig.4Effect of acute temperature stress on expression levels of ERα mRNAs in ovary and brain of gestationalSebastesschlegelii

    2.4 卵巢和腦中ERβ1、ERβ2表達水平

    如圖5所示,急性溫度脅迫后,許氏平鲉卵巢中ERβ2表達水平無顯著變化(p>0.05)。而ERβ1的表達水平在25℃急性脅迫后恢復(fù)期第6h顯著升高(p<0.05),并與對照組差異顯著,增至對照組的1.72倍,隨后逐漸下降,在第72h時恢復(fù)至對照組水平。

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖5急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉卵巢中ERβ1、ERβ2表達水平的影響

    Fig.5Effect of acute temperature stress on expression levels of ERβ1 and ERβ2 mRNAs in ovary of gestationalSebastesschlegelii

    此外,實驗發(fā)現(xiàn),許氏平鲉腦中ERβ1、ERβ2的表達水平在7℃和25℃急性脅迫后均無顯著變化(p<0.05)(見圖6)。

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖6急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉腦中ERβ1、ERβ2表達水平的影響

    Fig.6Effect of acute temperature stress on expression levels of ERβ1 and ERβ2 mRNAs in brain of gestational Sebastes schlegelii

    3 討論

    魚類代謝水平和酶活力會受到水環(huán)境溫度的影響,因此,溫度對于魚類的生殖過程起著至關(guān)重要的作用,包括配子發(fā)育和成熟、排卵和排精、胚胎發(fā)育和孵化、仔稚魚存活和生長發(fā)育等[1-2,10]。研究發(fā)現(xiàn),高溫能夠抑制性腺內(nèi)基因表達,阻礙性類固醇激素合成酶的合成,使性腺功能受到干擾,這也導(dǎo)致性類固醇激素(如E2、睪酮(T))含量顯著升高[3];當水環(huán)境溫度超過魚類的生殖適宜溫度時,HPG軸上的一些因子會發(fā)生變化來影響性腺發(fā)育,進而阻礙產(chǎn)卵進程[15]。

    針對真鯛(Pagrosomusmajor)[16]、大西洋鮭[17]等開展的溫度調(diào)控實驗發(fā)現(xiàn),高溫會抑制芳香化酶基因的表達,阻礙卵母細胞的發(fā)育和成熟。本研究發(fā)現(xiàn),25℃急性脅迫后,許氏平鲉卵巢中CYP19a1a的表達水平發(fā)生了顯著降低,芳香化酶具有溫度敏感性。真鯛在20℃以上的水環(huán)境中養(yǎng)殖4~8周后其CYP19a1a的表達水平受到抑制[17]。此外,這種溫度敏感性在許多物種的性分化和性別決定方面都有較詳盡的闡述[18]。芳香化酶作為一種不可逆催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵限速酶,其產(chǎn)物—E2的水平與其溫度敏感性也有密切關(guān)系。Watts等[18]認為,溫度對性類固醇合成和卵母細胞發(fā)育的顯著影響,一定程度上是由于P450芳香化酶的溫度調(diào)控作用。高溫會抑制芳香化酶基因表達,從而可能導(dǎo)致E2合成受阻,阻礙了雌魚的生殖進程[3]。本實驗中,25℃急性脅迫后,實驗魚血清E2顯著降低,是性腺中芳香化酶表達水平變化的結(jié)果[11]。有研究發(fā)現(xiàn),一些卵胎生魚的血清E2水平在妊娠后期發(fā)生波動,推測除了卵黃積累時期,其在妊娠期也承擔一定的生理功能[19]。本實驗檢測到實驗魚的血清E2水平會隨溫度產(chǎn)生顯著變化,證實了前人的研究結(jié)果,E2在妊娠期與其他因子共同發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)親魚的生理代謝和生殖內(nèi)分泌機能。

    25 ℃急性脅迫后,妊娠期許氏平鲉血清中的P4水平也發(fā)生了顯著變化,分析認為P4在妊娠期也參與調(diào)控生殖內(nèi)分泌水平。Nagahama等[20]對鲉科魚類的研究發(fā)現(xiàn),血清P4水平在妊娠后期出現(xiàn)了短暫的高峰,而此時DHP也處于峰值水平,由于P4是DHP的前體類固醇[6],它可能會隨后者的水平變化產(chǎn)生一定波動,但也不能排除這種波動可能與P4在妊娠期活動中直接發(fā)揮其生理功能有關(guān)。

    本研究發(fā)現(xiàn),急性高溫脅迫后,卵巢中ERα表達水平的變化趨勢與血清E2相一致,都發(fā)生了顯著降低。Shi等[12]研究認為ERα和E2的變化趨勢具有相關(guān)性,ERs的表達水平可能受到E2的誘導(dǎo)。7℃急性脅迫后,許氏平鲉卵巢中ERα表達水平和血清E2水平均在脅迫后12h顯著高于其他2組。有學(xué)者研究了大西洋鮭肝臟中ERs與E2的結(jié)合特性,結(jié)果表明,高溫會導(dǎo)致二者的結(jié)合率下降[21],使ERα表達水平降低。盡管如此,目前仍不能確定ERα的變化是受到溫度脅迫的直接影響,還是由于血清E2水平變化所導(dǎo)致的間接影響。溫度對性腺ERα的表達和血清E2的作用機制還需要深入探討。

    在魚類性腺中,與ERα典型依賴E2的調(diào)控方式相比,ERβ的調(diào)控方式受到很多因素的影響,包括生殖周期的不同階段、配體、物種差異性等[22]。本研究發(fā)現(xiàn),在急性高溫脅迫后,與ERα的變化趨勢相反,許氏平鲉卵巢中ERβ1表達水平顯著升高。一些針對哺乳動物的研究發(fā)現(xiàn),ERβ常以一種抗ERα的方式發(fā)揮其生物學(xué)作用[23],推測本研究結(jié)果可能與上述的假設(shè)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),某些魚類肝臟中ERβ2的表達量很高,卻未檢測到ERβ1的表達,有學(xué)者認為ERβ2的高轉(zhuǎn)錄水平可能與雌激素在肝臟中的誘導(dǎo)卵黃生成作用有關(guān),在卵黃積累過程中發(fā)揮了主要作用[24]。本實驗發(fā)現(xiàn)性腺中ERβ2表達水平無顯著變化,推測對于許氏平鲉該亞型可能也在卵黃生成期發(fā)揮其生理功能,而在妊娠期的作用相對較弱。

    P450aromB在卵生魚類產(chǎn)卵期和卵胎生魚類妊娠期的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控中發(fā)揮重要作用,可能涉及神經(jīng)和突觸發(fā)生、細胞增殖、凋亡和遷徙以及細胞分化等關(guān)鍵過程,組織和調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌循環(huán),從而對脊椎動物的生殖機能起到調(diào)控作用[25]。急性高溫脅迫后,卵巢處于Ⅴ期的黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)CYP19a1b轉(zhuǎn)錄水平顯著增高[26];尼羅羅非魚(Tilapianilotica)在32℃脅迫后,CYP19a1b表達水平也發(fā)生了明顯的升高[27]。對于許氏平鲉的研究發(fā)現(xiàn),CYP19a1b表達水平在妊娠期達到頂峰[28]。在本實驗中,妊娠期許氏平鲉腦中CYP19a1b的轉(zhuǎn)錄水平在25℃急性脅迫后顯著升高。分析認為,許氏平鲉腦中P450aromB受溫度調(diào)控的方式與性腺中P450aromA相比有很大差別,這可能是由于承擔的生理功能存在差異。妊娠期親魚在受到急性溫度脅迫后,需要較高的雌激素水平來維持腦中相對穩(wěn)定的環(huán)境,從而保證對下游內(nèi)分泌過程調(diào)控作用的正常進行。

    有學(xué)者發(fā)現(xiàn),魚類腦中E2水平和芳香化酶表達量最豐富的區(qū)域,也是ERs表達水平最高的區(qū)域[29]。本研究發(fā)現(xiàn),在25℃急性脅迫后,妊娠期許氏平鲉腦中ERα表達水平在6h顯著升高,與CYP19a1b表達的變化情況相一致。分析認為,ERα、E2及CYP19a1b在腦中形成的自動反饋調(diào)節(jié)通路[30],對于維持腦中的神經(jīng)內(nèi)分泌代謝穩(wěn)定具有重要意義,從而對處于生殖期魚類的生殖內(nèi)分泌水平起到調(diào)節(jié)作用。本研究還發(fā)現(xiàn),妊娠期許氏平鲉腦中ERβ的轉(zhuǎn)錄水平在25℃脅迫后無顯著變化。對牙漢魚(Odontesthesbonariensis)[31]的研究發(fā)現(xiàn),相較于ERβ1和ERβ1,ERα與CYP19a1b具有更緊密的神經(jīng)和功能聯(lián)系。

    Mu等[13]針對許氏平鲉研究發(fā)現(xiàn),在性腺發(fā)育階段,性腺中Foxl2表達量最高的階段早于CYP19a1a,且二者表達水平顯著相關(guān)。此外,雌激素還能夠促進Foxl2的表達。然而,在本研究中,急性溫度脅迫并未引起妊娠期許氏平鲉卵巢中Foxl2表達水平的變化。對于尼羅羅非魚的研究發(fā)現(xiàn),一種調(diào)節(jié)因子Sf1能夠與Foxl2共同作用來調(diào)節(jié)CYP19a1a的表達[8]。本研究中Foxl2的表達情況是否是由于受到sf1的影響而未發(fā)生變化,有待進一步研究。在許氏平鲉腦中,F(xiàn)oxl2的表達與CYP19a1b顯著相關(guān)[13],關(guān)于虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[32]的研究也有類似的報道。本研究中,急性高溫脅迫后,妊娠期許氏平鲉腦中Foxl2和CYP19a1b的表達水平均顯著升高,表明腦中foxl2對CYP19a1b轉(zhuǎn)錄的促進作用。

    實驗發(fā)現(xiàn),在7℃急性脅迫后,許氏平鲉腦和卵巢中多個基因的轉(zhuǎn)錄水平均未檢測到顯著變化。分析可能是親魚對低溫脅迫較不敏感,也有可能是脅迫時間較短或脅迫溫度仍在閾值范圍內(nèi)。低溫對妊娠期許氏平鲉腦中繁殖相關(guān)基因的具體作用機制還需進一步探索。

    綜合分析發(fā)現(xiàn),腦和卵巢中的生殖內(nèi)分泌活動可能存在緊密聯(lián)系。Cheshenko等[33]發(fā)現(xiàn),腦中CYP19a1b可能參與卵巢生殖周期的調(diào)控;對鮈杜父魚(Cottusgobio)的研究發(fā)現(xiàn),溫度升高4℃導(dǎo)致其產(chǎn)卵期提前,這對配子發(fā)育產(chǎn)生了一定影響[34];還有一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),高溫條件下產(chǎn)出的胚胎,其孵化出的仔魚成活率會顯著降低[35]??傊h(huán)境溫度的劇烈變化可能會引起HPG軸自上而下發(fā)生一系列生殖內(nèi)分泌變化,最終對親魚及仔魚產(chǎn)生極大影響。

    4 結(jié)論

    本研究首次報道了溫度對妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機能的影響,對卵胎生魚類的養(yǎng)殖具有重要的理論意義。研究結(jié)果表明,急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉的血清性類固醇水平、性腺和腦中生殖相關(guān)基因表達水平均有顯著影響,且親魚對高溫脅迫的敏感性遠大于低溫脅迫,所需恢復(fù)期也更長。此外,研究還發(fā)現(xiàn),魚類在受到外界環(huán)境脅迫時,機體各層次的代謝水平和生理狀況都發(fā)生了相應(yīng)變化,不同因子間是相互貫通、相互依存、不可分割的,共同維護機體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。綜上所述,在許氏平鲉的養(yǎng)殖和親魚培育過程中,注意防范水溫的驟變顯得尤為重要。維持水溫的相對恒定,以保證親魚胚胎發(fā)育和產(chǎn)仔進程的順利進行。

    [1]溫海深, 林浩然. 環(huán)境因子對硬骨魚類性腺發(fā)育成熟及其排卵和產(chǎn)卵的調(diào)控[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2001, 12(1): 151-155.

    Wen H S, Lin H R. Effect of environmental factors on gonadal maturation as well as its ovulation and spawning in teleost[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2001, 12(1): 151-155.

    [2]張敏智, 鄧思平, 朱春華, 等. 溫度對金錢魚卵巢發(fā)育的影響[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2013, 20(3): 599-606.

    Zhang Z M, Deng S P, Zhu C H, et al. Effects of temperature on ovarian development inScatophagusargus[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2013, 20(3): 599-606.

    [3]Miranda L A, Chalde T, Elisio M, et al. Effects of global warming on fish reproductive endocrine axis, with special emphasis in pejerreyOdontesthesbonariensis[J]. General and Comparative Endocrinology, 2013, 192: 45-54.

    [4]Pankhurst N W, King H R. Temperature and salmonid reproduction: implications for aquaculture[J]. Journal of Fish Biology, 2010, 76(1): 69-85.

    [5]翁幼竹, 劉志剛, 方永強, 等. 水溫對文昌魚生殖活動的影響及其內(nèi)分泌機制[J]. 海洋學(xué)報, 2012, 34(4): 163-171.

    Wen Y Z, Liu Z G, Fang Y Q, et al. Effects of seawater temperature on the reproductive activity of the amphioxus,Branchiostomabelcheriand its endocrine mechanism[J]. Acta Oceanologica Sinica, 2012,34(4):163-171.

    [6]林浩然. 魚類生理學(xué)[M]. 廣州: 廣州高等教育出版社, 1999: 146-199.

    .Lin H R. Physiology of Fishes[M]. Guangzhou:Guangdong Higher Education Press, 1999:146-199.

    [7]Kagawa N, Waterman M R. Regulation of steroidogenic and related P450s[M]//Cytochrome P450. New York: Springer Publishing Company, 1995: 419-442.

    [8]Wang D S, Kobayashi T, Zhou L Y, et al. Foxl2 up-regulates aromatase gene transcription in a female-specific manner by binding to the promoter as well as interacting with ad4 binding protein/steroidogenic factor 1[J]. Molecular Endocrinology, 2007, 21(3): 712-725.

    [9]Woods M, Kumar A, Barton M, et al. Localisation of estrogen responsive genes in the liver and testis of Murray rainbowfishMelanotaeniafluviatilisexposed to 17β-estradiol[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2009, 303(1): 57-66.

    [10]Koya Y. Reproductive Physiology in Viviparous Teleost[M]//Fish Reproduction. Florida: The Chemical Rubber Company Press, 2008: 245-275.

    [11]Scott A P, Sumpter J P, Stacey N. The role of the maturation-inducing steroid, 17,20b-dihydroxypregn-4-en-3-one, in male fishes: a review[J]. Journal of Fish Biology, 2010, 76: 183-224.

    [12]Shi D, Wen H S, He F, et al. The physiology functions of estrogen receptor α (ERα) in reproduction cycle of ovoviviparous black rockfish,SebastesschlegeliHilgendorf[J]. Steroids, 2011, 76(14): 1597-1608.

    [13]Mu W J, Wen H S, Li J F, et al. Cloning and expression analysis of Foxl2 during the reproductive cycle in Korean rockfish,Sebastesschlegeli[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2013, 39(6): 1419-1430.

    [14]Mu W J, Wen H S, Shi D, et al. Molecular cloning and expression analysis of estrogen receptor betas (ERβ1 and ERβ2) during gonad development in the Korean rockfish,Sebastesschlegeli[J]. Gene, 2013, 523(1): 39-49.

    [15]An K W, Lee K Y, Yun S G, et al. Molecular characterization of gonadotropin subunits and gonadotropin receptors in black porgy,Acanthopagrusschlegeli: Effects of estradiol-17β on mRNA expression profiles[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2009, 152(2): 177-188.

    [16]Pankhurst N W, Munday P L. Effects of climate change on fish reproduction and early life history stages[J]. Marine and Freshwater Research, 2011, 62(9): 1015-1026.

    [17]Lim B S, Kagawa H, Gen K, et al. Effects of water temperature on the gonadal development and expression of steroidogenic enzymes in the gonad of juvenile red seabream,Pagrusmajor[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2003, 28(1-4): 161-162.

    [18]Watts M, Pankhurst N W, King H R. Maintenance of Atlantic salmon (Salmosalar) at elevated temperature inhibits cytochrome P450 aromatase activity in isolated ovarian follicles[J]. General and Comparative Endocrinology, 2004, 135(3): 381-390.

    [19]Venkatesh B, Tan C H, Lam T J. Steroid hormone profile during gestation and parturition of the guppy (Poeciliareticulata)[J]. General and Comparative Endocrinology, 1990, 77(3): 476-483.

    [20]Nagahama Y, Takemura A, Takano K, et al. Serum steroid hormone levels in relation to the reproductive cycle ofSebastestaczanowskiiandS.schlegeli[J]. Environmental Biology of Fishes, 1991, 30(1-2): 31-38.

    [21]Watts M, Pankhurst N W, King H R, et al. Differential effects of temperature and maturity stage on hepatic estrogen receptor characteristics of Atlantic salmon[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2005, 140(3): 377-383.

    [22]Nelson E R, Habibi H R. Estrogen receptor function and regulation in fish and other vertebrates[J]. General and Comparative Endocrinology, 2013, 192: 15-24.

    [23]Matthews J, Wihlen B, Tujague M, et al. Estrogen receptor (ER) beta modulates ER alpha-mediated transcriptional activation by altering the recruitment of c-Fos and c-Jun to estrogen-responsive promoters [J]. Molecular Endocrinology, 2006, 20: 534-543.

    [24]Sumpter J P, Jobling S. Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment[J]. Environmental Health Perspectives, 1995, 103(Suppl): 173-178.

    [25]Toran-Allerand C D. Estrogen and the brain: beyond ER-a, ER-b, and 17b-estradiol[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2005, 1052: 136-144.

    [26]Liu M, Wen H, He F, et al. Expression patterns of cytochrome P450 aromatase genes during ovary development and their responses to temperature stress in female yellow catfish (Pelteobagrusfulvidraco)[J]. Journal of Ocean University of China, 2011, 10(4): 409-416.

    [27]Tsai C L, Chang S L, Wang L H, et al. Temperature influences the ontogenetic expression of aromatase and oestrogen receptor mRNA in the developing tilapia (Oreochromismossambicus) brain[J]. Journal of Neuroendocrinology, 2003, 15(1): 97-102.

    [28]楊艷平, 溫海深, 史丹, 等. 許氏平鲉(Sebastesschlegeli)CYP19B 基因 cDNA 克隆及在生殖周期中的表達分析[J]. 海洋與湖沼, 2012, 43(2): 370-375.

    Yang Y P, Wen H S, Shi D, et al. Clonging and the expression analysis ofcyp19agene cDNA during the reproductive cycle ofsebastesschlegeli[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2012,43(2):370-375.

    [29]Menuet A, Pellegrini E, Anglade I, et al. Molecular characterization of three estrogen receptor forms in zebrafish: binding characteristics, transactivation properties, and tissue distributions[J]. Biology of Reproduction, 2002, 66(6): 1881-1892.

    [30]Tchoudakova A, Kishida M, Wood E, et al. Promoter characteristics of two cyp19 genes differentially expressed in the brain and ovary of teleost fish[J]. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 78(5): 427-439.

    [31]Strobl-Mazzulla P H, Lethimonier C, Gueguen M M, et al. Brain aromatase (Cyp19A2) and estrogen receptors, in larvae and adult pejerrey fishOdontesthesbonariensis: neuroanatomical and functional relations[J]. General and Comparative Endocrinology, 2008, 158(2): 191-201.

    [32]Baron D, Houlgatte R, Fostier A, et al. Large-scale temporal gene expression profiling during gonadal differentiation and early gametogenesis in rainbow trout[J]. Biology of Reproduction, 2005, 73(5): 959-966.

    [33]Cheshenko K, Pakdel F, Segner H, et al. Interference of endocrine disrupting chemicals with aromatase CYP19 expression or activity, and consequences for reproduction of teleost fish[J]. General and Comparative Endocrinology, 2008, 155(1): 31-62.

    [34]Dorts J, Grenouillet G, Douxfils J, et al. Evidence that elevated water temperature affects the reproductive physiology of the European bullheadCottusgobio[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2012, 38(2): 389-399.

    [35]King H R, Pankhurst N W, Watts M. Reproductive sensitivity to elevated water temperatures in female Atlantic salmon is heightened at certain stages of vitellogenesis [J]. Journal of Fish Biology, 2007, 70(1): 190-205.

    責(zé)任編輯朱寶象

    Effects of Acute Temperature Stress on the Reproductive Endocrine Function of Gestational Ovoviviparous Black Rockfish (Sebastesschlegelii)

    ZHANG Ya-Chen, WEN Hai-Shen, LI Lan-Min, FENG Qi-Chao

    (The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003,China)

    This study mainly examinedthe effects of temperature on the reproductive endocrine function of gestational ovoviviparous black rockfish,Sebastesschlegelii. Serum sexual steroids hormones and gene expression related to the reproduction in ovary and brain were detected using endocrinological and molecular biological methods after acute temperature stress (thermal stress, 25℃; chilling stress, 7℃; control, 16℃). Results showed that P450 aromatase A (P450aromA) is sensitive to temperature in gestational black rockfish. The results indicated that the concentration of serum 17β-estradiol (E2) and the expression level of estrogen receptors α (ERα) gene decreased significantlyafteracute heat shock, which were found to be up-regulated after acute chilling stress. On the other hand, expression levels of estrogen receptors β 1(ERβ1) and estrogen receptors β 2(ERβ2) genes varied with different factors. As a precursor of 17α-hydroxy-20β- dihydroprogesterone (DHP), serum progesterone (P4) was thought to have some unknown functions during gestation of black rockfish. No significant change was found in expression level of transcription factor Foxl2 gene in acute heat or cold shock, which might indicate the participation of some other regulators. The expression level of cytochrome P450 19a1b (CYP19a1b) gene in brain elevated significantly in acute thermal stress, which was different from cytochrome P450 19a1a (CYP19a1a) gene in ovary, indicating distinct physiological functions of CYP19s among tissues. It was tentatively suggested that there was an auto-feedback loop involved in regulating expression levels of CYP19a1b, E2and ERα gene in order to promote transcription of CYP19a1b gene. In addition, the results indicated that the expression of aromatase can be up-regulated by Foxl2 in brain. The results indicated the heat-sensitivity of gestational black rockfish require longer recovery time after thermal challenge. When female fish enter the reproductive phase, itwas of great importance to monitor water temperature closely, toavoid damage induced by temperature stress during pregnancy. It was suggested that maintaining the water temperature constant or less changed could benefit the embryonic development and delivery process of gestataional black rockfish.

    Sebastesschlegelii; temperature; reproductive endocrine function; aromatase; estrogen receptor

    國家自然科學(xué)基金項目(41176122);教育部博士點專項基金項目(20120132110008)資助

    2015-07-13;

    2016-03-30

    張亞晨(1990-), 女, 碩士生,研究方向: 魚類生理學(xué)。.E-mail: 494870744@qq.com

    ??通訊作者:E-mail: wenhaishen@ouc.edu.cn

    S945.4; S955.486

    A

    1672-5174(2016)09-029-09

    10.16441/j.cnki.hdxb. 20150254

    Supported by the National Science Foundation of China (41176122);Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(20120132110008)

    猜你喜歡
    許氏芳香化性腺
    男性腰太粗 性腺功能差
    水溫變化對近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖中許氏平鲉攝食及生長的影響
    暗紋東方鲀芳香化酶基因的結(jié)構(gòu)及表達分析
    名醫(yī)妙用單方治好胃下垂
    芳香化酶抑制劑治療子宮內(nèi)膜增生癥的研究進展
    雌激素受體及芳香化酶在牙齦癌組織中的表達和意義
    基于MonoTrap捕集法檢測中華絨螯蟹性腺和肝胰腺中的香氣成分
    經(jīng)尿道等離子電切術(shù)治療女性腺性膀胱炎(附97例報告)
    許氏平鲉早期異速生長模式的研究
    青春期乳房肥大癥和小乳癥乳腺組織中芳香化酶的表達
    免费播放大片免费观看视频在线观看| 午夜免费观看性视频| 久久免费观看电影| 精品一品国产午夜福利视频| 久热久热在线精品观看| 麻豆乱淫一区二区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 在线 av 中文字幕| 一区二区三区乱码不卡18| 大片免费播放器 马上看| 国产免费视频播放在线视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久久久人妻精品一区果冻| 青春草亚洲视频在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 综合色丁香网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品亚洲成a人片在线观看| 熟女av电影| 天堂中文最新版在线下载| 欧美bdsm另类| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产精品99久久99久久久不卡 | 丝袜脚勾引网站| 亚洲精品一区蜜桃| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 2022亚洲国产成人精品| 夫妻午夜视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 两个人免费观看高清视频 | 美女cb高潮喷水在线观看| 丝袜在线中文字幕| 久久久久国产网址| 69精品国产乱码久久久| 久久综合国产亚洲精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久久欧美国产精品| 欧美xxⅹ黑人| xxx大片免费视频| 美女福利国产在线| 午夜精品国产一区二区电影| 久久久久久久久久久免费av| 最新中文字幕久久久久| 国产免费视频播放在线视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲在久久综合| 久久免费观看电影| 国产亚洲欧美精品永久| av女优亚洲男人天堂| 十八禁高潮呻吟视频 | 性色avwww在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 国产欧美亚洲国产| 少妇丰满av| 18禁在线播放成人免费| 99热全是精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 嫩草影院入口| 欧美成人午夜免费资源| av福利片在线观看| 亚洲欧美精品专区久久| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲人成网站在线观看播放| 免费人成在线观看视频色| 亚洲国产精品999| 国产av精品麻豆| 熟女电影av网| 女人久久www免费人成看片| 亚洲久久久国产精品| 国产精品.久久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美日韩视频精品一区| 一级毛片 在线播放| 国产 一区精品| 久久精品国产自在天天线| 国产 一区精品| 又大又黄又爽视频免费| 少妇人妻 视频| 亚洲欧洲日产国产| 97在线视频观看| 欧美精品国产亚洲| 欧美另类一区| 国产在视频线精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜免费鲁丝| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久久久久国产电影| 成年女人在线观看亚洲视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 99国产精品免费福利视频| h日本视频在线播放| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲第一av免费看| a级片在线免费高清观看视频| 少妇高潮的动态图| 欧美区成人在线视频| 久久99一区二区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美日韩视频精品一区| 99热网站在线观看| 精品午夜福利在线看| av一本久久久久| 国产视频首页在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品伦人一区二区| 久久久国产欧美日韩av| 成年女人在线观看亚洲视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产精品.久久久| 乱系列少妇在线播放| 久久精品国产a三级三级三级| 在线精品无人区一区二区三| 日韩欧美 国产精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 一级毛片久久久久久久久女| 下体分泌物呈黄色| av黄色大香蕉| 亚洲,欧美,日韩| 中文天堂在线官网| 日本色播在线视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 成人国产av品久久久| 亚洲性久久影院| 伊人亚洲综合成人网| 99久久中文字幕三级久久日本| 中文字幕av电影在线播放| 极品教师在线视频| 蜜桃在线观看..| 亚洲精品aⅴ在线观看| 99热国产这里只有精品6| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩一区二区三区影片| 少妇的逼水好多| av网站免费在线观看视频| 精品久久久久久电影网| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲成色77777| 国产精品一区二区性色av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 亚洲,欧美,日韩| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品成人在线| 亚洲精品乱久久久久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产视频内射| 日日啪夜夜爽| 99re6热这里在线精品视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 日韩中字成人| 激情五月婷婷亚洲| 一区二区三区乱码不卡18| 女的被弄到高潮叫床怎么办| kizo精华| a级毛片在线看网站| 少妇的逼好多水| 丰满少妇做爰视频| 国产精品久久久久久久久免| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国模一区二区三区四区视频| 99久国产av精品国产电影| 如何舔出高潮| 亚洲三级黄色毛片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日日啪夜夜撸| 午夜久久久在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 日韩免费高清中文字幕av| 国产一级毛片在线| 欧美变态另类bdsm刘玥| 熟女电影av网| 亚洲美女黄色视频免费看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 日本91视频免费播放| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲国产精品999| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲国产精品999| 久久女婷五月综合色啪小说| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产男人的电影天堂91| 久久97久久精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 边亲边吃奶的免费视频| 少妇精品久久久久久久| 国产成人freesex在线| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲伊人久久精品综合| 久久久久久久精品精品| 少妇 在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 日韩一区二区视频免费看| 免费观看av网站的网址| 日韩大片免费观看网站| 一本色道久久久久久精品综合| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久影院123| 国产老妇伦熟女老妇高清| 中文字幕久久专区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 我要看日韩黄色一级片| 美女内射精品一级片tv| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲精品国产av蜜桃| 不卡视频在线观看欧美| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 久久99精品国语久久久| 视频区图区小说| 欧美精品国产亚洲| 一本久久精品| 99热6这里只有精品| 大码成人一级视频| 中文字幕av电影在线播放| 免费看av在线观看网站| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日本黄大片高清| 性高湖久久久久久久久免费观看| av专区在线播放| kizo精华| 国产精品.久久久| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲综合精品二区| 免费观看的影片在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 精品人妻一区二区三区麻豆| 91精品一卡2卡3卡4卡| 色94色欧美一区二区| 精品久久久久久电影网| 天美传媒精品一区二区| 插阴视频在线观看视频| 成人无遮挡网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 晚上一个人看的免费电影| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲国产欧美在线一区| 美女福利国产在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 我要看黄色一级片免费的| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产淫语在线视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黄色配什么色好看| 人妻一区二区av| 久久国产精品大桥未久av | 综合色丁香网| 日韩一区二区三区影片| av在线老鸭窝| 伦理电影大哥的女人| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品久久久久久av不卡| 高清毛片免费看| 一个人看视频在线观看www免费| 国产高清不卡午夜福利| 深夜a级毛片| 国产av国产精品国产| 晚上一个人看的免费电影| 久久久精品免费免费高清| 在线看a的网站| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲国产精品一区三区| 一区二区三区免费毛片| 丝袜在线中文字幕| 岛国毛片在线播放| 成人黄色视频免费在线看| av一本久久久久| 女性被躁到高潮视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 黄色毛片三级朝国网站 | 亚洲欧洲国产日韩| 成人漫画全彩无遮挡| 51国产日韩欧美| 国产亚洲一区二区精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲av成人精品一区久久| 国产高清不卡午夜福利| 国产成人免费观看mmmm| 爱豆传媒免费全集在线观看| 午夜免费鲁丝| 韩国高清视频一区二区三区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲欧美精品自产自拍| 深夜a级毛片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产 精品1| 精品亚洲成a人片在线观看| 大陆偷拍与自拍| 国产精品一区二区性色av| 日韩制服骚丝袜av| 日韩免费高清中文字幕av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 99久久精品一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 一本色道久久久久久精品综合| 性色avwww在线观看| 欧美97在线视频| 三级国产精品欧美在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品伦人一区二区| 少妇高潮的动态图| 搡女人真爽免费视频火全软件| 男男h啪啪无遮挡| 日本欧美视频一区| 交换朋友夫妻互换小说| 久久久久久伊人网av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久久精品免费免费高清| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产视频首页在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 中文字幕av电影在线播放| 免费少妇av软件| 亚洲电影在线观看av| 精品久久久久久久久av| 超碰97精品在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 伦理电影大哥的女人| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 能在线免费看毛片的网站| 在线观看一区二区三区激情| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产精品久久久久久精品古装| h日本视频在线播放| xxx大片免费视频| 欧美精品亚洲一区二区| 免费少妇av软件| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日韩视频在线欧美| 亚洲精品视频女| 一二三四中文在线观看免费高清| 97在线人人人人妻| freevideosex欧美| 好男人视频免费观看在线| 国产淫语在线视频| 在线观看av片永久免费下载| 日日撸夜夜添| 国产乱来视频区| 在线看a的网站| 精品久久国产蜜桃| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 成年人免费黄色播放视频 | 国产 精品1| 中文字幕久久专区| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品女同一区二区软件| 国产日韩欧美视频二区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产成人91sexporn| 91精品国产国语对白视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一本一本综合久久| 国产精品99久久久久久久久| 大码成人一级视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久99一区二区三区| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 男女边摸边吃奶| 久久韩国三级中文字幕| 中文字幕久久专区| 最黄视频免费看| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线精品无人区一区二区三| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 国产成人精品久久久久久| 人人澡人人妻人| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产亚洲5aaaaa淫片| 人妻人人澡人人爽人人| 国产成人一区二区在线| 亚洲自偷自拍三级| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲av日韩在线播放| 久久 成人 亚洲| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲综合色惰| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 最后的刺客免费高清国语| 久久女婷五月综合色啪小说| 一本大道久久a久久精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品国产av成人精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲精品亚洲一区二区| 免费看av在线观看网站| 69精品国产乱码久久久| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品人妻久久久影院| 黄色欧美视频在线观看| 精品一区在线观看国产| 欧美激情国产日韩精品一区| 黄色毛片三级朝国网站 | 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产美女午夜福利| 久久99精品国语久久久| 亚洲av不卡在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产乱人偷精品视频| 中国三级夫妇交换| 精品视频人人做人人爽| 青春草亚洲视频在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 国产av国产精品国产| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 人体艺术视频欧美日本| 男人和女人高潮做爰伦理| 成人毛片a级毛片在线播放| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品成人在线| 九九爱精品视频在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品.久久久| 黄色怎么调成土黄色| 久久精品国产亚洲av天美| 丝袜在线中文字幕| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 免费看不卡的av| 午夜精品国产一区二区电影| 成人毛片60女人毛片免费| √禁漫天堂资源中文www| 久热久热在线精品观看| 亚洲av国产av综合av卡| 久久久久网色| 国产有黄有色有爽视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线观看免费视频网站a站| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 乱码一卡2卡4卡精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 成人午夜精彩视频在线观看| 嫩草影院新地址| 波野结衣二区三区在线| av不卡在线播放| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 超碰97精品在线观看| 少妇人妻 视频| 亚洲av成人精品一区久久| 97在线视频观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 91精品一卡2卡3卡4卡| av国产精品久久久久影院| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产淫片久久久久久久久| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲人成网站在线播| 日日撸夜夜添| av视频免费观看在线观看| 9色porny在线观看| 国产在线免费精品| 婷婷色综合www| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 涩涩av久久男人的天堂| a级毛片免费高清观看在线播放| 十八禁网站网址无遮挡 | 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精品456在线播放app| 日本vs欧美在线观看视频 | 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产av精品麻豆| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 丁香六月天网| 免费av中文字幕在线| 在线精品无人区一区二区三| 人妻人人澡人人爽人人| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 成人国产av品久久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产黄频视频在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 97在线视频观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久久欧美国产精品| 91精品国产国语对白视频| 在线看a的网站| 欧美3d第一页| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产又色又爽无遮挡免| 久久国产亚洲av麻豆专区| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 欧美日韩亚洲高清精品| 国产男人的电影天堂91| a级片在线免费高清观看视频| 嫩草影院入口| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 久久久国产一区二区| 国产成人一区二区在线| 最近手机中文字幕大全| 在线观看免费日韩欧美大片 | 欧美最新免费一区二区三区| 午夜91福利影院| 色网站视频免费| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲第一区二区三区不卡| 在现免费观看毛片| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久精品国产亚洲网站| av播播在线观看一区| 天堂俺去俺来也www色官网| 91aial.com中文字幕在线观看| 一级av片app| 哪个播放器可以免费观看大片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩伦理黄色片| 老熟女久久久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产色婷婷99| 多毛熟女@视频| 日韩成人伦理影院| 嫩草影院新地址| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 午夜老司机福利剧场| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美日韩av久久| 国产黄色免费在线视频| 妹子高潮喷水视频| 99热国产这里只有精品6| 国产乱人偷精品视频| 亚洲国产欧美在线一区| 国产在线男女| 日本av手机在线免费观看| 亚洲中文av在线| 一本久久精品| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲不卡免费看| 久久久精品94久久精品| 欧美区成人在线视频| 日韩一区二区三区影片| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 伦精品一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 久久久精品免费免费高清| 99九九在线精品视频 | 自线自在国产av| 国产视频首页在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 男人狂女人下面高潮的视频| 少妇的逼好多水| 波野结衣二区三区在线| 国产精品一二三区在线看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲在久久综合| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 少妇人妻 视频| 国产精品不卡视频一区二区| 大香蕉97超碰在线| 一区在线观看完整版| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲人与动物交配视频| av免费在线看不卡| 国产在线视频一区二区| 日韩 亚洲 欧美在线| 成人国产av品久久久| 久久人妻熟女aⅴ| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产亚洲最大av| 在线天堂最新版资源| 成人二区视频| 夫妻午夜视频| 伦理电影大哥的女人| 人妻系列 视频| 国产亚洲91精品色在线| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久99热6这里只有精品| 久久人人爽人人爽人人片va| av福利片在线观看| 国产精品久久久久久精品古装|