• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機能的影響*

    2016-10-18 07:41:50張亞晨溫海深李蘭敏馮啟超
    關(guān)鍵詞:許氏芳香化性腺

    張亞晨, 溫海深, 李蘭敏, 馮啟超

    (中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東 青島 266003)

    ?

    急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機能的影響*

    張亞晨, 溫海深??, 李蘭敏, 馮啟超

    (中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東 青島 266003)

    為探究溫度對妊娠期許氏平鲉(Sebastesschlegelii)生殖內(nèi)分泌機能的影響,采用內(nèi)分泌學(xué)和分子生物學(xué)方法,對急性溫度脅迫后許氏平鲉的血清性類固醇激素的變化及腦和卵巢生殖相關(guān)基因表達的變化進行了系統(tǒng)的探究和分析。研究表明:妊娠期許氏平鲉的性腺型芳香化酶(P450aromA)具有溫度敏感性。血清中17β-雌二醇(E2)和卵巢雌激素受體α(ERα)表達水平在急性高溫脅迫后發(fā)生了顯著下降,在急性低溫脅迫后明顯升高。在溫度脅迫下,卵巢中雌激素受體β1(ERβ1)和雌激素受體β2(ERβ2)呈現(xiàn)出顯著不同的表達方式;急性高溫脅迫后,與性腺型芳香化酶基因(CYP19a1a)相比,腦型芳香化酶基因(CYP19a1b)的轉(zhuǎn)錄水平上升顯著,表明二者在不同組織中承擔著不同的生理功能;在妊娠期許氏平鲉腦中,CYP19a1b、E2、ERα間形成了自動反饋調(diào)節(jié),促進CYP19a1b的轉(zhuǎn)錄;此外,F(xiàn)oxl2能夠促進腦中芳香化酶的表達。研究結(jié)果表明,妊娠期許氏平鲉對高溫脅迫更敏感,所需恢復(fù)期更長。在實際生產(chǎn)中,對于進入生殖期的雌魚,應(yīng)密切關(guān)注養(yǎng)殖水溫的變化,減少溫度應(yīng)激。維持水溫的相對恒定,以保證親魚胚胎發(fā)育和產(chǎn)仔進程的順利進行。

    許氏平鲉;溫度;生殖內(nèi)分泌機能;芳香化酶;雌激素受體

    引用格式: 張亞晨,溫海深,李蘭敏,等. 急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機能的影響[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,46(9): 29-37.

    ZHANG Ya-Chen, WEN Hai-Shen, LI Lan-Min, et al. Effects of acute temperature stress on the reproductive endocrine function of gestational ovoviviparous black rockfish (Sebastesschlegelii) [J].Periodical of Ocean University of China, 2016,46(9): 29-37.

    硬骨魚類作為一種低等的脊椎動物,其生長、發(fā)育與生殖進程很容易受到外界環(huán)境的影響。其中,溫度對于魚類的生殖過程起著至關(guān)重要的作用,包括配子發(fā)育、成熟、排卵或排精、產(chǎn)卵、胚胎發(fā)育與孵化等[1-3]。許多研究表明,水溫會改變下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸中各因素水平從而對魚類的生殖進程產(chǎn)生影響。在室溫范圍內(nèi),溫度升高導(dǎo)致金錢魚(Scatophagusargus)性腺成熟指數(shù)(GSI)和血清E2水平的顯著升高[2];高溫抑制性腺內(nèi)基因表達,阻礙性類固醇激素合成酶的合成,使性腺功能受到干擾[3];高溫還導(dǎo)致大西洋鮭(Salmosalar)在配子形成期性類固醇合成和肝糖原生成受阻,使肝臟中ERs表達水平發(fā)生變化,進而影響親魚的能量分配和配子的產(chǎn)生與成熟[4];此外,低溫對魚類生殖進程的影響亦有報道,對文昌魚(Branchiostomalanceolatum)的研究發(fā)現(xiàn),低溫條件下,文昌魚性腺趨于向雌性分化,這可能與溫度變化導(dǎo)致的芳香化酶合成和活性改變有關(guān)[5]。

    魚類的生殖過程主要受到HPG軸的調(diào)控,下丘腦、垂體和性腺形成一個閉合的自動反饋體系,共同維持魚類生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的相對穩(wěn)定,在性腺分化、發(fā)育、成熟及排卵過程中都發(fā)揮著十分重要的作用[6]。芳香化酶是細胞色素P450酶系的一種,主要分布在腦和性腺中,是一種催化C19雄激素(睪酮(T)和雄烯二酮不可逆地轉(zhuǎn)化為C18雌激素(E2和雌酮)過程中的關(guān)鍵限速酶[7],并通過其產(chǎn)物調(diào)控魚類的生理和生殖過程。Foxl2能夠激活芳香化酶基因的轉(zhuǎn)錄[8],參與性類固醇的生物合成途徑。ERs是類固醇激素核受體家族的一員,能夠間接調(diào)控雌激素生理功能的發(fā)揮[9]。此外,孕激素在魚類生殖過程中也發(fā)揮著極重要的作用,例如17α,20β-雙羥孕酮(DHP)在鲉科魚的妊娠期中發(fā)揮了積極作用[10]。近年來針對孕酮(P4)的研究發(fā)現(xiàn),它能夠調(diào)控雌魚卵巢的最終成熟和產(chǎn)卵[11]。

    許氏平鲉(Sebastesschlegelii)又名黑鲪、黑石鱸、黑頭等,屬于鲉形目(Scorpaeniformes)鲉科(Scorpaenidae)平鲉屬(Sebastes),主要分布在太平洋西部水域。該魚具有營養(yǎng)豐富、生長快速、抗病力強等優(yōu)點,目前已逐步成為人工魚礁區(qū)增殖、網(wǎng)箱和工廠化養(yǎng)殖的魚類之一,具有重要經(jīng)濟價值。此外,由于許氏平鲉卵胎生生殖方式的特殊性,也使其成為魚類進化研究的模式動物之一。在自然條件下,許氏平鲉妊娠期處于4~5月,水溫為10.0~16.8 ℃,產(chǎn)仔盛期適宜水溫為13~16 ℃。對于卵胎生和胎生魚類,水體溫度與妊娠期親魚的生理狀況和胚胎發(fā)育情況均密切相關(guān)。因此親魚在此時期對溫度變化較敏感,水溫如發(fā)生急劇變化,會導(dǎo)致親魚的健康狀況、胚胎的發(fā)育情況發(fā)生改變,進而影響產(chǎn)出仔魚的優(yōu)劣程度和種群補充。但目前關(guān)于溫度對妊娠期許氏平鲉的生理和生殖情況影響的研究鮮有報道。

    為進一步探索溫度對妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機能的影響,本文研究了妊娠期許氏平鲉的血清性類固醇水平、腦和卵巢中生殖相關(guān)基因表達水平在急性溫度脅迫后的變化情況,為評估親魚在溫度突變水體中適應(yīng)性和恢復(fù)性提供理論依據(jù),為優(yōu)化許氏平鲉全人工繁殖提供技術(shù)參考。

    1 材料與方法

    1.1 實驗魚類

    實驗魚于2013年5月采自山東省蓬萊市沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖群體。挑選72尾健康無病的妊娠期許氏平鲉(體重(879.03±22.61)g),實驗前于20個玻璃水槽(長×寬×高:80 cm×60 cm×40cm)中馴化3d,每缸4尾。馴化期間控制水溫在16℃左右,模擬自然光周期14L∶10D,連續(xù)充氣保持溶氧濃度在7mg/L左右,pH 7.5~7.8。每日上午10:00換水,換水量為1/2水槽水量。

    1.2 實驗設(shè)計

    實驗設(shè)置7、16(室溫對照)和25℃,共3個溫度水平。急性溫度脅迫實驗在2個體積為0.785m3的圓柱形塑料桶(直徑1m,深度0.8m)中進行。分別使用控溫加熱棒和海水冰塊將桶中海水溫度調(diào)至25和7℃。從馴化水槽中分別隨機選取24尾規(guī)格相近、活力較好的許氏平鲉放入7和25℃海水中,另保留剩余24尾于16℃水中作為常溫對照組。在高溫和低溫脅迫2h后,將其轉(zhuǎn)移至16℃海水中恢復(fù)。由于許氏平鲉親魚在產(chǎn)仔期停止攝食,因此實驗過程中不進行投飼。實驗期間連續(xù)充氣,每隔4h校準一次溫度;采用HQd便攜式多參數(shù)數(shù)字化分析儀(Hach,美國)監(jiān)控海水溫度和溶解氧含量。

    1.3 樣品采集與處理

    在恢復(fù)期第0、6、12、24、48及72h對3組實驗魚進行采樣,每組每次隨機取魚4尾。將魚投入含濃度為200mg/L的MS222的海水中麻醉,尾靜脈取血,血樣制備血清后移入-20℃保存待測;取血后采集卵巢組織和全部腦組織,于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 血清中17β-雌二醇(E2)和P4水平的測定

    使用碘[125]I雌二醇放射免疫分析試劑盒(九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司,天津)和碘[125]I孕酮放射免疫分析試劑盒,采用RIA液相平衡競爭放射性免疫分析法進行實驗魚血清中E2和P4水平的測定。具體測定方案參考Shi等[12]的方法。

    1.5 卵巢和腦中CYP19a1a、Foxl2、ERα、ERβ1和ERβ2表達水平的分析方法

    卵巢和腦組織中的總RNA按照trizol法提取。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TAKARA,日本)進行總RNA的純化和cDNA的反轉(zhuǎn)錄。實驗所需的CYP19a1b的特異性引物由Primer Premier5.0軟件設(shè)計(見表1)。由前人研究結(jié)果得到CYP19a1a[13]、ERα[12]、ERβ1[14]、ERβ2[14]、Foxl2[13]和內(nèi)參基因βactin[15]的特異性引物。

    表1 基因表達分析的特異性引物

    采用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TAKARA,日本)檢測CYP19a1a、CYP19a1b、Foxl2、ERα、ERβ1和ERβ2的表達水平;檢測過程在StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,美國)上進行。

    每個樣品設(shè)置3個重復(fù),特異性引物的退火溫度和循環(huán)數(shù)經(jīng)優(yōu)化后如下:95℃變性30s;95℃變性5s,60℃ 退火30s,此步驟循環(huán)40次。在PCR運行結(jié)束后制作引物溶解曲線,分析其擴增效率以確保引物特異性和產(chǎn)物的單一性。根據(jù)實驗結(jié)果,以βactin為內(nèi)參基因,根據(jù)2-△△CT方法計算得到各基因的相對表達量。

    1.6 數(shù)據(jù)處理

    使用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA),探究溫度和時間對血清性類固醇水平和卵巢中生殖相關(guān)基因表達水平的影響。若滿足方差齊性,作Student-Neuman-Keuls多重比較,分析不同溫度組間或不同恢復(fù)時間之間各指標數(shù)據(jù)的差異顯著性;若不滿足方差齊性,則采用Games-Howell法進行分析。以p<0.05表示差異顯著,結(jié)果以均值±標準誤(Mean±SE)表示。

    2 結(jié)果

    2.1 血清E2和P4水平

    如圖1所示,急性溫度脅迫后,血清E2水平在恢復(fù)期發(fā)生顯著變化。6h時25℃脅迫組顯著低于其他2組(p<0.05),并在12h時降至最低值((4.66±0.88)pg/mL),隨后逐漸上升,72h時恢復(fù)至對照組水平;7℃脅迫組實驗魚的血清E2水平呈現(xiàn)相反的變化趨勢,12h時顯著升高(p<0.05),增至(16.11±1.22)pg/mL,顯著高于25 ℃脅迫組和對照組(p<0.05),24h時顯著降低,恢復(fù)至對照組水平(p<0.05)。血清P4水平在25 ℃急性脅迫后第6 h時顯著升高(p<0.05),并在12 h升至最高值(6.32±0.74 ng/mL),為對照組的3.05倍,48 h時顯著下降(p<0.05),恢復(fù)至正常水平;7 ℃急性脅迫后血清P4水平無顯著變化(p>0.05),始終維持在正常水平。

    2.2 卵巢和腦中CYP19a和Foxl2基因表達水平

    如圖2所示,25℃急性脅迫后,卵巢中CYP19a1a表達水平在恢復(fù)期第6h顯著下降(p<0.05),并顯著低于其他2組(p<0.05)。12~24h其表達維持在較低水平,隨后逐漸上升,至72h時恢復(fù)至對照組水平(p<0.05)。7 ℃急性脅迫后,CYP19a1a轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生顯著變化(p>0.05)。實驗觀察到,2種溫度處理后,卵巢中Foxl2的表達水平有一定波動,但無顯著差異(p>0.05)。

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05)。Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖1急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉血清E2和P4水平的影響

    Fig.1Effect of acute temperature stress on serum 17β-estradiol and progesterone of gestationalSebastesschlegelii

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05)。Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖2急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉卵巢中CYP19a1a和Foxl2表達水平的影響

    Fig.2Effect of acute temperature stress on expression levels of CYP19a1a and Foxl2 mRNAs in ovary of gestationalSebastesschlegelii

    如圖3所示,25℃急性脅迫后,腦中CYP19a1b和Foxl2表達水平均在6h時顯著升高(p<0.05),與對照組差異顯著(p<0.05),分別為正常水平的1.66倍和2.11倍。隨后二者轉(zhuǎn)錄水平逐漸恢復(fù)至對照組水平。7℃急性脅迫后的72h恢復(fù)期內(nèi),CYP19a1b的表達水平呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢,但此變化與對照組水平差異并不顯著(p>0.05)。

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖3急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉腦中CYP19a1b和Foxl2表達水平的影響

    Fig. 3Effect of acute temperature stress on expression levels of CYP19a1b and Foxl2 mRNAs in brain of gestationalSebastesschlegelii

    2.3 卵巢和腦中ERα表達水平

    實驗發(fā)現(xiàn),7 ℃脅迫組的實驗魚卵巢中ERα轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(p<0.05),12h時增至對照組的1.67倍,恢復(fù)期第24h時恢復(fù)至正常水平;25℃脅迫組中,ERα表達水平在脅迫后恢復(fù)期第6h顯著下降(p<0.05),并在12h降至最低,與其他溫度組水平差異顯著(p<0.05)。隨后緩慢升高恢復(fù)。腦中ERα的表達水平在25℃急性脅迫后恢復(fù)第6h時顯著升高(p<0.05),顯著高于其他2組,為對照組水平的1.97倍,并在12h時恢復(fù)正常;與此不同的是,在7℃急性脅迫后,腦中ERα轉(zhuǎn)錄水平無顯著變化(p>0.05),與對照組持平(見圖4)。

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖4急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉卵巢和腦中ERα表達水平的影響

    Fig.4Effect of acute temperature stress on expression levels of ERα mRNAs in ovary and brain of gestationalSebastesschlegelii

    2.4 卵巢和腦中ERβ1、ERβ2表達水平

    如圖5所示,急性溫度脅迫后,許氏平鲉卵巢中ERβ2表達水平無顯著變化(p>0.05)。而ERβ1的表達水平在25℃急性脅迫后恢復(fù)期第6h顯著升高(p<0.05),并與對照組差異顯著,增至對照組的1.72倍,隨后逐漸下降,在第72h時恢復(fù)至對照組水平。

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖5急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉卵巢中ERβ1、ERβ2表達水平的影響

    Fig.5Effect of acute temperature stress on expression levels of ERβ1 and ERβ2 mRNAs in ovary of gestationalSebastesschlegelii

    此外,實驗發(fā)現(xiàn),許氏平鲉腦中ERβ1、ERβ2的表達水平在7℃和25℃急性脅迫后均無顯著變化(p<0.05)(見圖6)。

    (圖中標注的不同大寫字母表示同一時間點不同溫度間存在顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母表示同一溫度不同時間點間存在顯著性差異(p<0.05).Different capital letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters above the bars indicate significant differences (p<0.05) in different time points of the same temperature in Student -Neuman-Keulsmultiple range test.)

    圖6急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉腦中ERβ1、ERβ2表達水平的影響

    Fig.6Effect of acute temperature stress on expression levels of ERβ1 and ERβ2 mRNAs in brain of gestational Sebastes schlegelii

    3 討論

    魚類代謝水平和酶活力會受到水環(huán)境溫度的影響,因此,溫度對于魚類的生殖過程起著至關(guān)重要的作用,包括配子發(fā)育和成熟、排卵和排精、胚胎發(fā)育和孵化、仔稚魚存活和生長發(fā)育等[1-2,10]。研究發(fā)現(xiàn),高溫能夠抑制性腺內(nèi)基因表達,阻礙性類固醇激素合成酶的合成,使性腺功能受到干擾,這也導(dǎo)致性類固醇激素(如E2、睪酮(T))含量顯著升高[3];當水環(huán)境溫度超過魚類的生殖適宜溫度時,HPG軸上的一些因子會發(fā)生變化來影響性腺發(fā)育,進而阻礙產(chǎn)卵進程[15]。

    針對真鯛(Pagrosomusmajor)[16]、大西洋鮭[17]等開展的溫度調(diào)控實驗發(fā)現(xiàn),高溫會抑制芳香化酶基因的表達,阻礙卵母細胞的發(fā)育和成熟。本研究發(fā)現(xiàn),25℃急性脅迫后,許氏平鲉卵巢中CYP19a1a的表達水平發(fā)生了顯著降低,芳香化酶具有溫度敏感性。真鯛在20℃以上的水環(huán)境中養(yǎng)殖4~8周后其CYP19a1a的表達水平受到抑制[17]。此外,這種溫度敏感性在許多物種的性分化和性別決定方面都有較詳盡的闡述[18]。芳香化酶作為一種不可逆催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵限速酶,其產(chǎn)物—E2的水平與其溫度敏感性也有密切關(guān)系。Watts等[18]認為,溫度對性類固醇合成和卵母細胞發(fā)育的顯著影響,一定程度上是由于P450芳香化酶的溫度調(diào)控作用。高溫會抑制芳香化酶基因表達,從而可能導(dǎo)致E2合成受阻,阻礙了雌魚的生殖進程[3]。本實驗中,25℃急性脅迫后,實驗魚血清E2顯著降低,是性腺中芳香化酶表達水平變化的結(jié)果[11]。有研究發(fā)現(xiàn),一些卵胎生魚的血清E2水平在妊娠后期發(fā)生波動,推測除了卵黃積累時期,其在妊娠期也承擔一定的生理功能[19]。本實驗檢測到實驗魚的血清E2水平會隨溫度產(chǎn)生顯著變化,證實了前人的研究結(jié)果,E2在妊娠期與其他因子共同發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)親魚的生理代謝和生殖內(nèi)分泌機能。

    25 ℃急性脅迫后,妊娠期許氏平鲉血清中的P4水平也發(fā)生了顯著變化,分析認為P4在妊娠期也參與調(diào)控生殖內(nèi)分泌水平。Nagahama等[20]對鲉科魚類的研究發(fā)現(xiàn),血清P4水平在妊娠后期出現(xiàn)了短暫的高峰,而此時DHP也處于峰值水平,由于P4是DHP的前體類固醇[6],它可能會隨后者的水平變化產(chǎn)生一定波動,但也不能排除這種波動可能與P4在妊娠期活動中直接發(fā)揮其生理功能有關(guān)。

    本研究發(fā)現(xiàn),急性高溫脅迫后,卵巢中ERα表達水平的變化趨勢與血清E2相一致,都發(fā)生了顯著降低。Shi等[12]研究認為ERα和E2的變化趨勢具有相關(guān)性,ERs的表達水平可能受到E2的誘導(dǎo)。7℃急性脅迫后,許氏平鲉卵巢中ERα表達水平和血清E2水平均在脅迫后12h顯著高于其他2組。有學(xué)者研究了大西洋鮭肝臟中ERs與E2的結(jié)合特性,結(jié)果表明,高溫會導(dǎo)致二者的結(jié)合率下降[21],使ERα表達水平降低。盡管如此,目前仍不能確定ERα的變化是受到溫度脅迫的直接影響,還是由于血清E2水平變化所導(dǎo)致的間接影響。溫度對性腺ERα的表達和血清E2的作用機制還需要深入探討。

    在魚類性腺中,與ERα典型依賴E2的調(diào)控方式相比,ERβ的調(diào)控方式受到很多因素的影響,包括生殖周期的不同階段、配體、物種差異性等[22]。本研究發(fā)現(xiàn),在急性高溫脅迫后,與ERα的變化趨勢相反,許氏平鲉卵巢中ERβ1表達水平顯著升高。一些針對哺乳動物的研究發(fā)現(xiàn),ERβ常以一種抗ERα的方式發(fā)揮其生物學(xué)作用[23],推測本研究結(jié)果可能與上述的假設(shè)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),某些魚類肝臟中ERβ2的表達量很高,卻未檢測到ERβ1的表達,有學(xué)者認為ERβ2的高轉(zhuǎn)錄水平可能與雌激素在肝臟中的誘導(dǎo)卵黃生成作用有關(guān),在卵黃積累過程中發(fā)揮了主要作用[24]。本實驗發(fā)現(xiàn)性腺中ERβ2表達水平無顯著變化,推測對于許氏平鲉該亞型可能也在卵黃生成期發(fā)揮其生理功能,而在妊娠期的作用相對較弱。

    P450aromB在卵生魚類產(chǎn)卵期和卵胎生魚類妊娠期的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控中發(fā)揮重要作用,可能涉及神經(jīng)和突觸發(fā)生、細胞增殖、凋亡和遷徙以及細胞分化等關(guān)鍵過程,組織和調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌循環(huán),從而對脊椎動物的生殖機能起到調(diào)控作用[25]。急性高溫脅迫后,卵巢處于Ⅴ期的黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)CYP19a1b轉(zhuǎn)錄水平顯著增高[26];尼羅羅非魚(Tilapianilotica)在32℃脅迫后,CYP19a1b表達水平也發(fā)生了明顯的升高[27]。對于許氏平鲉的研究發(fā)現(xiàn),CYP19a1b表達水平在妊娠期達到頂峰[28]。在本實驗中,妊娠期許氏平鲉腦中CYP19a1b的轉(zhuǎn)錄水平在25℃急性脅迫后顯著升高。分析認為,許氏平鲉腦中P450aromB受溫度調(diào)控的方式與性腺中P450aromA相比有很大差別,這可能是由于承擔的生理功能存在差異。妊娠期親魚在受到急性溫度脅迫后,需要較高的雌激素水平來維持腦中相對穩(wěn)定的環(huán)境,從而保證對下游內(nèi)分泌過程調(diào)控作用的正常進行。

    有學(xué)者發(fā)現(xiàn),魚類腦中E2水平和芳香化酶表達量最豐富的區(qū)域,也是ERs表達水平最高的區(qū)域[29]。本研究發(fā)現(xiàn),在25℃急性脅迫后,妊娠期許氏平鲉腦中ERα表達水平在6h顯著升高,與CYP19a1b表達的變化情況相一致。分析認為,ERα、E2及CYP19a1b在腦中形成的自動反饋調(diào)節(jié)通路[30],對于維持腦中的神經(jīng)內(nèi)分泌代謝穩(wěn)定具有重要意義,從而對處于生殖期魚類的生殖內(nèi)分泌水平起到調(diào)節(jié)作用。本研究還發(fā)現(xiàn),妊娠期許氏平鲉腦中ERβ的轉(zhuǎn)錄水平在25℃脅迫后無顯著變化。對牙漢魚(Odontesthesbonariensis)[31]的研究發(fā)現(xiàn),相較于ERβ1和ERβ1,ERα與CYP19a1b具有更緊密的神經(jīng)和功能聯(lián)系。

    Mu等[13]針對許氏平鲉研究發(fā)現(xiàn),在性腺發(fā)育階段,性腺中Foxl2表達量最高的階段早于CYP19a1a,且二者表達水平顯著相關(guān)。此外,雌激素還能夠促進Foxl2的表達。然而,在本研究中,急性溫度脅迫并未引起妊娠期許氏平鲉卵巢中Foxl2表達水平的變化。對于尼羅羅非魚的研究發(fā)現(xiàn),一種調(diào)節(jié)因子Sf1能夠與Foxl2共同作用來調(diào)節(jié)CYP19a1a的表達[8]。本研究中Foxl2的表達情況是否是由于受到sf1的影響而未發(fā)生變化,有待進一步研究。在許氏平鲉腦中,F(xiàn)oxl2的表達與CYP19a1b顯著相關(guān)[13],關(guān)于虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[32]的研究也有類似的報道。本研究中,急性高溫脅迫后,妊娠期許氏平鲉腦中Foxl2和CYP19a1b的表達水平均顯著升高,表明腦中foxl2對CYP19a1b轉(zhuǎn)錄的促進作用。

    實驗發(fā)現(xiàn),在7℃急性脅迫后,許氏平鲉腦和卵巢中多個基因的轉(zhuǎn)錄水平均未檢測到顯著變化。分析可能是親魚對低溫脅迫較不敏感,也有可能是脅迫時間較短或脅迫溫度仍在閾值范圍內(nèi)。低溫對妊娠期許氏平鲉腦中繁殖相關(guān)基因的具體作用機制還需進一步探索。

    綜合分析發(fā)現(xiàn),腦和卵巢中的生殖內(nèi)分泌活動可能存在緊密聯(lián)系。Cheshenko等[33]發(fā)現(xiàn),腦中CYP19a1b可能參與卵巢生殖周期的調(diào)控;對鮈杜父魚(Cottusgobio)的研究發(fā)現(xiàn),溫度升高4℃導(dǎo)致其產(chǎn)卵期提前,這對配子發(fā)育產(chǎn)生了一定影響[34];還有一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),高溫條件下產(chǎn)出的胚胎,其孵化出的仔魚成活率會顯著降低[35]??傊h(huán)境溫度的劇烈變化可能會引起HPG軸自上而下發(fā)生一系列生殖內(nèi)分泌變化,最終對親魚及仔魚產(chǎn)生極大影響。

    4 結(jié)論

    本研究首次報道了溫度對妊娠期許氏平鲉生殖內(nèi)分泌機能的影響,對卵胎生魚類的養(yǎng)殖具有重要的理論意義。研究結(jié)果表明,急性溫度脅迫對妊娠期許氏平鲉的血清性類固醇水平、性腺和腦中生殖相關(guān)基因表達水平均有顯著影響,且親魚對高溫脅迫的敏感性遠大于低溫脅迫,所需恢復(fù)期也更長。此外,研究還發(fā)現(xiàn),魚類在受到外界環(huán)境脅迫時,機體各層次的代謝水平和生理狀況都發(fā)生了相應(yīng)變化,不同因子間是相互貫通、相互依存、不可分割的,共同維護機體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。綜上所述,在許氏平鲉的養(yǎng)殖和親魚培育過程中,注意防范水溫的驟變顯得尤為重要。維持水溫的相對恒定,以保證親魚胚胎發(fā)育和產(chǎn)仔進程的順利進行。

    [1]溫海深, 林浩然. 環(huán)境因子對硬骨魚類性腺發(fā)育成熟及其排卵和產(chǎn)卵的調(diào)控[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2001, 12(1): 151-155.

    Wen H S, Lin H R. Effect of environmental factors on gonadal maturation as well as its ovulation and spawning in teleost[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2001, 12(1): 151-155.

    [2]張敏智, 鄧思平, 朱春華, 等. 溫度對金錢魚卵巢發(fā)育的影響[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2013, 20(3): 599-606.

    Zhang Z M, Deng S P, Zhu C H, et al. Effects of temperature on ovarian development inScatophagusargus[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2013, 20(3): 599-606.

    [3]Miranda L A, Chalde T, Elisio M, et al. Effects of global warming on fish reproductive endocrine axis, with special emphasis in pejerreyOdontesthesbonariensis[J]. General and Comparative Endocrinology, 2013, 192: 45-54.

    [4]Pankhurst N W, King H R. Temperature and salmonid reproduction: implications for aquaculture[J]. Journal of Fish Biology, 2010, 76(1): 69-85.

    [5]翁幼竹, 劉志剛, 方永強, 等. 水溫對文昌魚生殖活動的影響及其內(nèi)分泌機制[J]. 海洋學(xué)報, 2012, 34(4): 163-171.

    Wen Y Z, Liu Z G, Fang Y Q, et al. Effects of seawater temperature on the reproductive activity of the amphioxus,Branchiostomabelcheriand its endocrine mechanism[J]. Acta Oceanologica Sinica, 2012,34(4):163-171.

    [6]林浩然. 魚類生理學(xué)[M]. 廣州: 廣州高等教育出版社, 1999: 146-199.

    .Lin H R. Physiology of Fishes[M]. Guangzhou:Guangdong Higher Education Press, 1999:146-199.

    [7]Kagawa N, Waterman M R. Regulation of steroidogenic and related P450s[M]//Cytochrome P450. New York: Springer Publishing Company, 1995: 419-442.

    [8]Wang D S, Kobayashi T, Zhou L Y, et al. Foxl2 up-regulates aromatase gene transcription in a female-specific manner by binding to the promoter as well as interacting with ad4 binding protein/steroidogenic factor 1[J]. Molecular Endocrinology, 2007, 21(3): 712-725.

    [9]Woods M, Kumar A, Barton M, et al. Localisation of estrogen responsive genes in the liver and testis of Murray rainbowfishMelanotaeniafluviatilisexposed to 17β-estradiol[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2009, 303(1): 57-66.

    [10]Koya Y. Reproductive Physiology in Viviparous Teleost[M]//Fish Reproduction. Florida: The Chemical Rubber Company Press, 2008: 245-275.

    [11]Scott A P, Sumpter J P, Stacey N. The role of the maturation-inducing steroid, 17,20b-dihydroxypregn-4-en-3-one, in male fishes: a review[J]. Journal of Fish Biology, 2010, 76: 183-224.

    [12]Shi D, Wen H S, He F, et al. The physiology functions of estrogen receptor α (ERα) in reproduction cycle of ovoviviparous black rockfish,SebastesschlegeliHilgendorf[J]. Steroids, 2011, 76(14): 1597-1608.

    [13]Mu W J, Wen H S, Li J F, et al. Cloning and expression analysis of Foxl2 during the reproductive cycle in Korean rockfish,Sebastesschlegeli[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2013, 39(6): 1419-1430.

    [14]Mu W J, Wen H S, Shi D, et al. Molecular cloning and expression analysis of estrogen receptor betas (ERβ1 and ERβ2) during gonad development in the Korean rockfish,Sebastesschlegeli[J]. Gene, 2013, 523(1): 39-49.

    [15]An K W, Lee K Y, Yun S G, et al. Molecular characterization of gonadotropin subunits and gonadotropin receptors in black porgy,Acanthopagrusschlegeli: Effects of estradiol-17β on mRNA expression profiles[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2009, 152(2): 177-188.

    [16]Pankhurst N W, Munday P L. Effects of climate change on fish reproduction and early life history stages[J]. Marine and Freshwater Research, 2011, 62(9): 1015-1026.

    [17]Lim B S, Kagawa H, Gen K, et al. Effects of water temperature on the gonadal development and expression of steroidogenic enzymes in the gonad of juvenile red seabream,Pagrusmajor[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2003, 28(1-4): 161-162.

    [18]Watts M, Pankhurst N W, King H R. Maintenance of Atlantic salmon (Salmosalar) at elevated temperature inhibits cytochrome P450 aromatase activity in isolated ovarian follicles[J]. General and Comparative Endocrinology, 2004, 135(3): 381-390.

    [19]Venkatesh B, Tan C H, Lam T J. Steroid hormone profile during gestation and parturition of the guppy (Poeciliareticulata)[J]. General and Comparative Endocrinology, 1990, 77(3): 476-483.

    [20]Nagahama Y, Takemura A, Takano K, et al. Serum steroid hormone levels in relation to the reproductive cycle ofSebastestaczanowskiiandS.schlegeli[J]. Environmental Biology of Fishes, 1991, 30(1-2): 31-38.

    [21]Watts M, Pankhurst N W, King H R, et al. Differential effects of temperature and maturity stage on hepatic estrogen receptor characteristics of Atlantic salmon[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2005, 140(3): 377-383.

    [22]Nelson E R, Habibi H R. Estrogen receptor function and regulation in fish and other vertebrates[J]. General and Comparative Endocrinology, 2013, 192: 15-24.

    [23]Matthews J, Wihlen B, Tujague M, et al. Estrogen receptor (ER) beta modulates ER alpha-mediated transcriptional activation by altering the recruitment of c-Fos and c-Jun to estrogen-responsive promoters [J]. Molecular Endocrinology, 2006, 20: 534-543.

    [24]Sumpter J P, Jobling S. Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment[J]. Environmental Health Perspectives, 1995, 103(Suppl): 173-178.

    [25]Toran-Allerand C D. Estrogen and the brain: beyond ER-a, ER-b, and 17b-estradiol[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2005, 1052: 136-144.

    [26]Liu M, Wen H, He F, et al. Expression patterns of cytochrome P450 aromatase genes during ovary development and their responses to temperature stress in female yellow catfish (Pelteobagrusfulvidraco)[J]. Journal of Ocean University of China, 2011, 10(4): 409-416.

    [27]Tsai C L, Chang S L, Wang L H, et al. Temperature influences the ontogenetic expression of aromatase and oestrogen receptor mRNA in the developing tilapia (Oreochromismossambicus) brain[J]. Journal of Neuroendocrinology, 2003, 15(1): 97-102.

    [28]楊艷平, 溫海深, 史丹, 等. 許氏平鲉(Sebastesschlegeli)CYP19B 基因 cDNA 克隆及在生殖周期中的表達分析[J]. 海洋與湖沼, 2012, 43(2): 370-375.

    Yang Y P, Wen H S, Shi D, et al. Clonging and the expression analysis ofcyp19agene cDNA during the reproductive cycle ofsebastesschlegeli[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2012,43(2):370-375.

    [29]Menuet A, Pellegrini E, Anglade I, et al. Molecular characterization of three estrogen receptor forms in zebrafish: binding characteristics, transactivation properties, and tissue distributions[J]. Biology of Reproduction, 2002, 66(6): 1881-1892.

    [30]Tchoudakova A, Kishida M, Wood E, et al. Promoter characteristics of two cyp19 genes differentially expressed in the brain and ovary of teleost fish[J]. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 78(5): 427-439.

    [31]Strobl-Mazzulla P H, Lethimonier C, Gueguen M M, et al. Brain aromatase (Cyp19A2) and estrogen receptors, in larvae and adult pejerrey fishOdontesthesbonariensis: neuroanatomical and functional relations[J]. General and Comparative Endocrinology, 2008, 158(2): 191-201.

    [32]Baron D, Houlgatte R, Fostier A, et al. Large-scale temporal gene expression profiling during gonadal differentiation and early gametogenesis in rainbow trout[J]. Biology of Reproduction, 2005, 73(5): 959-966.

    [33]Cheshenko K, Pakdel F, Segner H, et al. Interference of endocrine disrupting chemicals with aromatase CYP19 expression or activity, and consequences for reproduction of teleost fish[J]. General and Comparative Endocrinology, 2008, 155(1): 31-62.

    [34]Dorts J, Grenouillet G, Douxfils J, et al. Evidence that elevated water temperature affects the reproductive physiology of the European bullheadCottusgobio[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2012, 38(2): 389-399.

    [35]King H R, Pankhurst N W, Watts M. Reproductive sensitivity to elevated water temperatures in female Atlantic salmon is heightened at certain stages of vitellogenesis [J]. Journal of Fish Biology, 2007, 70(1): 190-205.

    責(zé)任編輯朱寶象

    Effects of Acute Temperature Stress on the Reproductive Endocrine Function of Gestational Ovoviviparous Black Rockfish (Sebastesschlegelii)

    ZHANG Ya-Chen, WEN Hai-Shen, LI Lan-Min, FENG Qi-Chao

    (The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003,China)

    This study mainly examinedthe effects of temperature on the reproductive endocrine function of gestational ovoviviparous black rockfish,Sebastesschlegelii. Serum sexual steroids hormones and gene expression related to the reproduction in ovary and brain were detected using endocrinological and molecular biological methods after acute temperature stress (thermal stress, 25℃; chilling stress, 7℃; control, 16℃). Results showed that P450 aromatase A (P450aromA) is sensitive to temperature in gestational black rockfish. The results indicated that the concentration of serum 17β-estradiol (E2) and the expression level of estrogen receptors α (ERα) gene decreased significantlyafteracute heat shock, which were found to be up-regulated after acute chilling stress. On the other hand, expression levels of estrogen receptors β 1(ERβ1) and estrogen receptors β 2(ERβ2) genes varied with different factors. As a precursor of 17α-hydroxy-20β- dihydroprogesterone (DHP), serum progesterone (P4) was thought to have some unknown functions during gestation of black rockfish. No significant change was found in expression level of transcription factor Foxl2 gene in acute heat or cold shock, which might indicate the participation of some other regulators. The expression level of cytochrome P450 19a1b (CYP19a1b) gene in brain elevated significantly in acute thermal stress, which was different from cytochrome P450 19a1a (CYP19a1a) gene in ovary, indicating distinct physiological functions of CYP19s among tissues. It was tentatively suggested that there was an auto-feedback loop involved in regulating expression levels of CYP19a1b, E2and ERα gene in order to promote transcription of CYP19a1b gene. In addition, the results indicated that the expression of aromatase can be up-regulated by Foxl2 in brain. The results indicated the heat-sensitivity of gestational black rockfish require longer recovery time after thermal challenge. When female fish enter the reproductive phase, itwas of great importance to monitor water temperature closely, toavoid damage induced by temperature stress during pregnancy. It was suggested that maintaining the water temperature constant or less changed could benefit the embryonic development and delivery process of gestataional black rockfish.

    Sebastesschlegelii; temperature; reproductive endocrine function; aromatase; estrogen receptor

    國家自然科學(xué)基金項目(41176122);教育部博士點專項基金項目(20120132110008)資助

    2015-07-13;

    2016-03-30

    張亞晨(1990-), 女, 碩士生,研究方向: 魚類生理學(xué)。.E-mail: 494870744@qq.com

    ??通訊作者:E-mail: wenhaishen@ouc.edu.cn

    S945.4; S955.486

    A

    1672-5174(2016)09-029-09

    10.16441/j.cnki.hdxb. 20150254

    Supported by the National Science Foundation of China (41176122);Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(20120132110008)

    猜你喜歡
    許氏芳香化性腺
    男性腰太粗 性腺功能差
    水溫變化對近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖中許氏平鲉攝食及生長的影響
    暗紋東方鲀芳香化酶基因的結(jié)構(gòu)及表達分析
    名醫(yī)妙用單方治好胃下垂
    芳香化酶抑制劑治療子宮內(nèi)膜增生癥的研究進展
    雌激素受體及芳香化酶在牙齦癌組織中的表達和意義
    基于MonoTrap捕集法檢測中華絨螯蟹性腺和肝胰腺中的香氣成分
    經(jīng)尿道等離子電切術(shù)治療女性腺性膀胱炎(附97例報告)
    許氏平鲉早期異速生長模式的研究
    青春期乳房肥大癥和小乳癥乳腺組織中芳香化酶的表達
    校园春色视频在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 两个人看的免费小视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久精品成人免费网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 黄色a级毛片大全视频| 国产亚洲精品av在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 91字幕亚洲| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久精品欧美日韩精品| 久久精品成人免费网站| www.精华液| 色播在线永久视频| 不卡一级毛片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 久久久久九九精品影院| 日本在线视频免费播放| 欧美乱色亚洲激情| 男女午夜视频在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 免费看十八禁软件| 日本在线视频免费播放| 激情在线观看视频在线高清| 日本五十路高清| 久久久久久久久久黄片| 亚洲av熟女| 女警被强在线播放| 99精品在免费线老司机午夜| 丝袜在线中文字幕| 在线永久观看黄色视频| 日本a在线网址| 午夜精品久久久久久毛片777| 色综合欧美亚洲国产小说| 可以在线观看毛片的网站| 欧美精品亚洲一区二区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 免费在线观看亚洲国产| 久久人妻av系列| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 男人舔女人的私密视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 禁无遮挡网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲真实伦在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 成人手机av| 中出人妻视频一区二区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 成人国产一区最新在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美黑人巨大hd| 亚洲免费av在线视频| 久久青草综合色| 久热爱精品视频在线9| 国产精品综合久久久久久久免费| 无遮挡黄片免费观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日韩大码丰满熟妇| 成人国语在线视频| 女人被狂操c到高潮| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精华国产精华精| 桃红色精品国产亚洲av| 国产人伦9x9x在线观看| 午夜两性在线视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 露出奶头的视频| 最近在线观看免费完整版| 亚洲国产中文字幕在线视频| 手机成人av网站| 亚洲第一av免费看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 91麻豆av在线| 婷婷亚洲欧美| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 男女视频在线观看网站免费 | 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲第一电影网av| 国内精品久久久久精免费| 日本一本二区三区精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产av一区在线观看免费| 亚洲国产精品合色在线| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 亚洲国产精品久久男人天堂| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲国产精品成人综合色| 在线av久久热| 欧美乱码精品一区二区三区| 村上凉子中文字幕在线| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美黑人巨大hd| 91麻豆av在线| 人人澡人人妻人| 日本 欧美在线| 成在线人永久免费视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品久久视频播放| 免费在线观看黄色视频的| 日韩欧美在线二视频| 男女那种视频在线观看| 脱女人内裤的视频| 中文资源天堂在线| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲三区欧美一区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美黑人精品巨大| a级毛片a级免费在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 校园春色视频在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 高清在线国产一区| 久久伊人香网站| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 免费看a级黄色片| 免费高清在线观看日韩| 亚洲成国产人片在线观看| 一本综合久久免费| 国产不卡一卡二| 国产成人精品久久二区二区91| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 中文字幕高清在线视频| 国产精品影院久久| 91av网站免费观看| 校园春色视频在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 丁香欧美五月| 一级片免费观看大全| 特大巨黑吊av在线直播 | 亚洲激情在线av| 亚洲国产精品成人综合色| 成人亚洲精品av一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| а√天堂www在线а√下载| 精品久久蜜臀av无| 国产亚洲av高清不卡| 久久精品国产清高在天天线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 看片在线看免费视频| 日韩欧美 国产精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日本一本二区三区精品| 自线自在国产av| 国产一区二区激情短视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 少妇的丰满在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 丝袜人妻中文字幕| 麻豆一二三区av精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费看美女性在线毛片视频| 久久这里只有精品19| svipshipincom国产片| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产精品久久久久久精品电影 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 此物有八面人人有两片| 午夜亚洲福利在线播放| 国产av一区在线观看免费| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产片内射在线| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美成人一区二区免费高清观看 | av超薄肉色丝袜交足视频| 99热这里只有精品一区 | 久9热在线精品视频| 亚洲人成网站高清观看| 悠悠久久av| 国产一区二区激情短视频| 午夜老司机福利片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 男女之事视频高清在线观看| 少妇的丰满在线观看| 成人国产综合亚洲| 国产一卡二卡三卡精品| 一级片免费观看大全| 精品久久久久久久久久久久久 | 啦啦啦 在线观看视频| 久99久视频精品免费| 中文字幕高清在线视频| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品久久视频播放| 两个人看的免费小视频| 国产精品影院久久| a级毛片在线看网站| 在线播放国产精品三级| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲第一青青草原| 国产色视频综合| 国产精品电影一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 波多野结衣高清作品| 国产麻豆成人av免费视频| 香蕉久久夜色| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲专区中文字幕在线| 久久久久久久精品吃奶| 久久热在线av| 此物有八面人人有两片| 欧美日韩乱码在线| 免费看日本二区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产av一区二区精品久久| 最近最新免费中文字幕在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 午夜视频精品福利| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品永久免费网站| 丝袜在线中文字幕| 国产三级黄色录像| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲无线在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲色图av天堂| 十八禁网站免费在线| 热99re8久久精品国产| 欧美乱色亚洲激情| 香蕉av资源在线| 精品欧美国产一区二区三| 高潮久久久久久久久久久不卡| 12—13女人毛片做爰片一| 哪里可以看免费的av片| 欧美成人免费av一区二区三区| 少妇 在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久99久视频精品免费| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 99re在线观看精品视频| 一本一本综合久久| 成人永久免费在线观看视频| 国产精品,欧美在线| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 88av欧美| 国产成人欧美在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美黑人欧美精品刺激| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 国产一区二区激情短视频| 后天国语完整版免费观看| 在线观看舔阴道视频| 日本 av在线| 欧美成狂野欧美在线观看| 在线国产一区二区在线| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜福利在线观看吧| 在线播放国产精品三级| 韩国av一区二区三区四区| 日韩免费av在线播放| 久久精品影院6| 黄片大片在线免费观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久这里只有精品19| 手机成人av网站| 天堂√8在线中文| 国产v大片淫在线免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 叶爱在线成人免费视频播放| 成人亚洲精品av一区二区| 国产一区二区三区视频了| 日韩视频一区二区在线观看| www.精华液| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久久久久久精品吃奶| 国产成人精品久久二区二区免费| 久热这里只有精品99| 1024手机看黄色片| 成人国产综合亚洲| 久久久久久国产a免费观看| 久久草成人影院| 久久精品91蜜桃| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日本一本二区三区精品| 国产爱豆传媒在线观看 | 99精品久久久久人妻精品| 国产亚洲精品av在线| 国产亚洲精品第一综合不卡| 后天国语完整版免费观看| 一本大道久久a久久精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲国产精品成人综合色| 天堂影院成人在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 美女大奶头视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产日本99.免费观看| 久久国产精品影院| 成人亚洲精品一区在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲成人国产一区在线观看| 久久性视频一级片| 一区二区三区国产精品乱码| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 妹子高潮喷水视频| 一夜夜www| 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品国产亚洲在线| 亚洲黑人精品在线| 香蕉久久夜色| 久久久国产精品麻豆| 久久久久国产一级毛片高清牌| 午夜两性在线视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 午夜免费鲁丝| 一进一出好大好爽视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日本成人三级电影网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲激情在线av| a在线观看视频网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 身体一侧抽搐| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲av片天天在线观看| 免费在线观看完整版高清| 成人手机av| 亚洲最大成人中文| 久久久国产精品麻豆| 日韩欧美国产在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 国产97色在线日韩免费| 黄色 视频免费看| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久 成人 亚洲| 午夜福利一区二区在线看| 免费在线观看亚洲国产| 婷婷亚洲欧美| 免费在线观看完整版高清| 少妇的丰满在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久亚洲真实| 欧美性长视频在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产精品,欧美在线| 国产区一区二久久| 亚洲全国av大片| 免费搜索国产男女视频| 成人永久免费在线观看视频| 美女高潮到喷水免费观看| 日本三级黄在线观看| 免费看a级黄色片| 国产黄a三级三级三级人| 老司机午夜十八禁免费视频| netflix在线观看网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 午夜福利一区二区在线看| 一本一本综合久久| 亚洲一区中文字幕在线| 久久99热这里只有精品18| av福利片在线| 中文在线观看免费www的网站 | 婷婷亚洲欧美| АⅤ资源中文在线天堂| e午夜精品久久久久久久| 久久精品国产综合久久久| 久久久国产欧美日韩av| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 一进一出抽搐动态| 国产成人精品久久二区二区免费| 精品人妻1区二区| 久久久久久久午夜电影| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 成人欧美大片| 亚洲第一av免费看| 欧美丝袜亚洲另类 | or卡值多少钱| 日本一本二区三区精品| 草草在线视频免费看| 老司机午夜十八禁免费视频| 成人av一区二区三区在线看| 91国产中文字幕| 国产精品一区二区精品视频观看| 精品免费久久久久久久清纯| 91九色精品人成在线观看| www.999成人在线观看| 午夜老司机福利片| 大型黄色视频在线免费观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产一区二区三区视频了| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲中文av在线| 黄色a级毛片大全视频| 午夜福利一区二区在线看| 成年女人毛片免费观看观看9| 一进一出抽搐gif免费好疼| 一区二区三区精品91| 国产精品一区二区精品视频观看| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品野战在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久 | 久久国产精品男人的天堂亚洲| 最近在线观看免费完整版| 国产亚洲av高清不卡| 夜夜爽天天搞| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 91老司机精品| 国产免费av片在线观看野外av| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 成年免费大片在线观看| 999久久久国产精品视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 美女国产高潮福利片在线看| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品,欧美在线| 国产99久久九九免费精品| 美女高潮到喷水免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 天天添夜夜摸| 99国产精品99久久久久| 黄色视频不卡| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲第一青青草原| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 91大片在线观看| 亚洲全国av大片| 香蕉丝袜av| 伦理电影免费视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲中文日韩欧美视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲av成人一区二区三| 久久久久久国产a免费观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 韩国精品一区二区三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 一级毛片女人18水好多| 精品久久久久久,| 精品无人区乱码1区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| av超薄肉色丝袜交足视频| 99国产精品99久久久久| 精品国产一区二区三区四区第35| 色播亚洲综合网| 日韩欧美国产在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 高清在线国产一区| 国产精品久久久av美女十八| 麻豆成人午夜福利视频| 成人国产综合亚洲| 狠狠狠狠99中文字幕| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 丝袜美腿诱惑在线| 麻豆一二三区av精品| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 99精品欧美一区二区三区四区| 中文在线观看免费www的网站 | 黄片小视频在线播放| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 两个人免费观看高清视频| 久久伊人香网站| 欧美午夜高清在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久久久久久久久黄片| 观看免费一级毛片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产成人av激情在线播放| 亚洲av电影在线进入| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美色视频一区免费| 国产野战对白在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 我的亚洲天堂| 国产精品av久久久久免费| 欧美精品亚洲一区二区| 免费在线观看黄色视频的| 国产一区在线观看成人免费| 脱女人内裤的视频| 满18在线观看网站| 999精品在线视频| 在线av久久热| 深夜精品福利| 亚洲专区字幕在线| 午夜福利视频1000在线观看| 最好的美女福利视频网| 91大片在线观看| 成在线人永久免费视频| 国产精品亚洲一级av第二区| xxxwww97欧美| 宅男免费午夜| 欧美日本视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产av在哪里看| 午夜成年电影在线免费观看| 国产午夜精品久久久久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美色视频一区免费| 国产真人三级小视频在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 性色av乱码一区二区三区2| 999久久久精品免费观看国产| xxxwww97欧美| 久久久久久久久久黄片| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 怎么达到女性高潮| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲专区国产一区二区| 国产视频内射| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产极品粉嫩免费观看在线| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲国产欧美网| 麻豆av在线久日| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 中文字幕最新亚洲高清| 久久中文字幕人妻熟女| 久久精品91蜜桃| 91麻豆av在线| 国产一区二区激情短视频| av免费在线观看网站| 精品无人区乱码1区二区| 国产91精品成人一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美乱妇无乱码| 国产又爽黄色视频| 国产1区2区3区精品| 1024视频免费在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品第一国产精品| 18禁美女被吸乳视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 天堂动漫精品| 精品福利观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 免费在线观看完整版高清| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 99re在线观看精品视频| 中文字幕高清在线视频| 大香蕉久久成人网| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产激情偷乱视频一区二区| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲第一av免费看| 一区二区三区国产精品乱码| 嫁个100分男人电影在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 脱女人内裤的视频| 午夜福利在线观看吧| 无遮挡黄片免费观看| 窝窝影院91人妻| 久久久久国内视频| 一级a爱片免费观看的视频| 国产1区2区3区精品| 午夜免费激情av| 亚洲国产看品久久| 精品国产国语对白av| 精品欧美国产一区二区三| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 91九色精品人成在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 无限看片的www在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 婷婷六月久久综合丁香| 成人永久免费在线观看视频| 在线观看免费午夜福利视频| 免费电影在线观看免费观看| 美女国产高潮福利片在线看| e午夜精品久久久久久久|