海南鮮椰子水對酒精性肝損傷大鼠的保護(hù)作用研究*

周慧友，鄭萬玲，江成，許善虹，文婷，高凌峰

海南鮮椰子水對酒精性肝損傷大鼠的保護(hù)作用研究*

周慧友，鄭萬玲，江成，許善虹，文婷，高凌峰

目的探究海南鮮椰子水對酒精性肝損傷大鼠的保護(hù)作用。方法采用56°白酒灌胃，建立大鼠酒精性肝損傷模型。取大鼠26只，隨機(jī)分為椰子水處理組9只，模型組9只和正常組8只。給予椰子組和模型組動物白酒灌胃，同時(shí)給予椰子組椰子水自由飲用，給予正常組動物0.9%生理鹽水灌胃，給予模型組和正常組蒸餾水自由飲用，均連續(xù)29 d。采用硫代巴比妥酸法檢測肝組織勻漿丙二醛（MDA）含量，采用羥胺法檢測肝組織勻漿超氧化物歧化酶（SOD）含量。結(jié)果在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組動物血清AST水平為（123.0±36.2）U/L，顯著高于正常組和椰子組【（86.5±21.0）U/L和（96.9±26.0）U/L，P＜0.05】，但不同組間血清ALT和TG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0. 05）；模型組肝組織勻漿MDA含量為（0.479±0.069）nmol/mg，顯著高于椰子組【（0.258±0.078）nmol/mg，P＜0.01】和正常組【（0.311±0.139）nmol/mg，P＜0.01】；椰子組和模型組SOD含量分別為（0.068±0.008）U/mg和（0.071± 0.010）U/mg，顯著高于正常組【（0.044±0.022）U/mg，P＜0.05】，但椰子組與模型組SOD含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性較輕，肝小葉中心帶肝細(xì)胞中出現(xiàn)大小不等的脂肪滴，個(gè)別有肝淤血；椰子組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰。結(jié)論椰子水對酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，機(jī)理可能與其抗氧化作用有關(guān)。

酒精性肝病；椰子水；氧化應(yīng)激；大鼠

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是由于長期大量飲酒所導(dǎo)致的肝臟疾病，主要包括輕癥酒精性肝損傷（mild alcoholic injury，MAI）、酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）、酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH）、酒精性肝纖維化（alcoholic hepatic fibrosis，AHF）和酒精性肝硬化（alcoholic cirrhosis，AC）［1］。據(jù)2014年WHO統(tǒng)計(jì)，全球范圍有害使用酒精人群每年有約330萬人死亡，占死亡人數(shù)的5.9%。在中國，隨著國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式、飲食習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國人群中嗜酒者的比例呈上升趨勢，同時(shí)ALD患病率也不斷增加［2］。最新研究發(fā)現(xiàn)，ALD發(fā)病機(jī)制主要與酒精及其代謝產(chǎn)物對肝臟的直接毒性作用、氧化應(yīng)激反應(yīng)、腸源性內(nèi)毒素血癥、Kupffer細(xì)胞活化、促炎因子釋放、鐵沉積等多種因素有關(guān)［3］。現(xiàn)今，一般只在戒酒基礎(chǔ)上干預(yù)ALD患者，仍缺乏特殊有效的治療方案［4］。椰子水是一種營養(yǎng)和保健價(jià)值很高的天然飲料，富含還原糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物，同時(shí)椰子水中游離的氨基酸具有舒張血管功能［5-8］。此外，天然椰子水對超氧陰離子自由基（O2-·）、羥基自由基（·OH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）有較強(qiáng)的清除能力和還原能力，表明天然椰子水的抗氧化活性較強(qiáng)，具有保健作用［9，10］。針對酒精性肝病自由基發(fā)病機(jī)理，應(yīng)用天然椰子水干預(yù)酒精對肝臟損傷的研究目前未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探究了椰子水對酒精性肝損傷的保護(hù)作用，以為其臨床藥物的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物、試劑與儀器SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g（由湖南長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物質(zhì)量合格證編號：43006700005602）。椰子（海南高種綠椰［11］），56°紅星二鍋頭酒（北京紅星股份有限公司，批號：6906785230165）。檢測天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、甘油三脂（TG）試劑盒、過氧化物歧化酶（SOD）試劑盒和丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；722型可見分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器一廠）；離心機(jī)（5810型，德國Eppendorf公司）；獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具IVC（GA56型，蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司）。

1.2酒精性肝損傷模型的制備取大鼠26只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為椰子水處理組9只，模型組9只和正常組8只。按文獻(xiàn)報(bào)道的方法［12，13］，每日下午6點(diǎn)測定體質(zhì)量，模型組和椰子組給予白酒10 mL· kg-1·d-1灌胃，正常組給予0.9%生理鹽水等劑量灌胃。在灌胃飼養(yǎng)期間，給予椰子組動物40 mL·d-1鮮椰子水自由飲用（大鼠生理需水量大約為40 mL· d-1［14］），給予正常組和模型組蒸餾水40 mL·d-1自由飲用，各組自由攝食，實(shí)驗(yàn)周期為29 d。于末次灌胃，禁食不禁水12 h后，給予3%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）腹腔注射，腹主動脈取血，制備血清，取肝右葉制備10%肝組織勻漿。

1.3指標(biāo)測定使用日立公司生產(chǎn)的7020型全自動生化分析儀檢測血生化指標(biāo)（南京建成生物工程研究所）；采用硫代巴比妥酸（TBA）法檢測肝組織勻漿MDA含量（南京建成生物工程研究所）；采用羥胺法檢測肝組織勻漿SOD含量（南京建成生物工程研究所）。

1.4肝組織病理學(xué)檢查處死大鼠后，迅速取肝左葉，置于10%福爾馬林溶液中固定，送海南省藥物安全性評價(jià)研究中心，行常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血生化指標(biāo)變化的比較椰子組血清AST水平顯著低于模型組（P＞0.05，表1）。

表1　各組大鼠血清生化指標(biāo)（±s）比較

表1　各組大鼠血清生化指標(biāo)（±s）比較

與模型組比，①P＜0.05

只ALT（U/L）AST（U/L）TG（mmol/L）椰子組944.7±10.096.9±26.0①1.2±0.6模型組642.8±7.9123.0±36.11.1±0.4正常組840.4±9.886.5±21.00.9±0.3

2.2各組大鼠肝組織SOD和MDA水平比較椰子組肝組織MDA含量較模型組顯著降低（P＞0.05，表2）。

表2　各組大鼠肝組織SOD和MDA水平（±s）比較

表2　各組大鼠肝組織SOD和MDA水平（±s）比較

與模型組比，①P＜0.01

只SOD（U/mgprot）MDA（nmol/mgprot）椰子組90.068±0.0080.258±0.078①模型組60.071±0.0100.479±0.069正常組80.044±0.0220.311±0.139

2.3各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，形成肝細(xì)胞索，肝臟細(xì)胞形態(tài)規(guī)則（圖1A）；椰子組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較正常，肝血竇間隙豐富，肝臟細(xì)胞形態(tài)規(guī)則（圖1B）；模型組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性較輕，肝小葉中心帶肝細(xì)胞出現(xiàn)大小不等的脂肪滴，一些肝細(xì)胞核則被脂肪滴擠出偏位，肝淤血（圖1C、D）。

圖1　大鼠肝組織病理學(xué)變化（HE，400×）

3　討論

酒精性肝損傷是多因素參與的一個(gè)復(fù)雜的病理過程，在病變過程中多種酶、自由基以及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)均參與其發(fā)生發(fā)展。經(jīng)口攝入的乙醇經(jīng)上消化道吸收入血，90%以上經(jīng)肝臟代謝。在肝細(xì)胞內(nèi)，可經(jīng)乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、乙醇氧化系統(tǒng)（microsomal ethanol oxidizing system，MEOS）中的細(xì)胞色素P4502E1（CYP2E1）和過氧化氫酶系統(tǒng)進(jìn)行氧化代謝，乙醇經(jīng)過ADH代謝為乙醛，乙醛進(jìn)一步經(jīng)過線粒體中的乙醛脫氫酶2（ALDH2）和胞質(zhì)中的乙醛脫氫酶（ALDH）代謝為乙酸［15，16］。其中，乙醇通過激活P4502E1（CYP2E1）可以產(chǎn)生乙醛和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)（oxidative stress，OS）［17］，在這個(gè)過程中產(chǎn)生羥自由基（OH-）、超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）等ROS，導(dǎo)致體內(nèi)谷胱甘肽（GSH）和SOD等抗氧化成分減少［18］。該過程生成的自由基可引起生物膜脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白和酶變性、DNA氧化修飾等一系列毒性作用，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死或凋亡［19］。

模型組血清AST含量升高，模型組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性較輕，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的脂肪滴，其中個(gè)別也可觀察到肝淤血，提示酒精性肝損傷模型基本被成功復(fù)制。

肝細(xì)胞受損時(shí)，ALT和AST從細(xì)胞內(nèi)逸出，釋放入血。血清ALT和AST活性升高，在一定程度上反映了肝細(xì)胞受損程度［20］。椰子處理組動物血AST水平比模型組顯著下降，提示椰子水具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用，減少了酒精性肝細(xì)胞的損傷。本研究模型動物血清ALT和TG水平升高不顯著，我們認(rèn)為可能與造模實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短有關(guān)，未能證實(shí)椰子水對大鼠肝損傷后是否能降低血清ALT和TG含量。

椰子處理組動物肝組織SOD含量明顯升高，提示椰子水具有提高機(jī)體抗氧化功能；模型組動物肝組織SOD含量也高于對照組，我們認(rèn)為可能與代償性增加有關(guān)。與椰子組和正常組相比較，模型組大鼠肝臟MDA含量顯著增加（P＜0.05）。MDA作為膜脂質(zhì)過氧化物最重要的終產(chǎn)物，其含量變化代表機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，間接反映肝細(xì)胞膜受損輕重［21］，其對線粒體呼吸功能、丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶等具有顯著的抑制作用，可能進(jìn)一步造成細(xì)胞能量代謝障礙，細(xì)胞功能受損和加重病理損傷發(fā)展［22］。鮮椰子水有減輕活性自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高抗氧化系統(tǒng)能力，進(jìn)而起到保護(hù)肝臟的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鮮椰子水處理酒精性肝損傷大鼠，結(jié)果血清AST和肝組織MDA水平較模型組明顯下降，證實(shí)了鮮椰子水對肝臟有保護(hù)作用，其機(jī)制與增強(qiáng)肝臟抗氧化功能有關(guān)。由于本實(shí)驗(yàn)指標(biāo)有限，要證實(shí)海南鮮椰子水中具體成分對大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制還需進(jìn)行后續(xù)研究。

志謝：本項(xiàng)目在實(shí)施過程中得到海南醫(yī)學(xué)院教務(wù)部、機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室、海南省藥物安全性評價(jià)中心老師的大力支持。在組織病理學(xué)檢查方面，得到謝富生老師的無私幫助，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方面，得到吳玲老師的無私幫助。在此，一并表示衷心感謝。

［1］中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.酒精性肝病診療指南.中華肝臟病雜志，2010，18（3）：167-169.

［2］厲有名.酒精性肝病的流行病學(xué)特點(diǎn).實(shí)用肝臟病雜志，2012，15（3）：180-182.

［3］王洪巖，李鑫，徐有青.酒精性肝病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展，實(shí)用肝臟病雜志，2014，17（1）：5-8.

［4］向榮，李志.酒精性肝病的治療進(jìn).瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，38（1）：98-100.

［5］Aalbersberg B.Nutrient analysis of coconut today.Trop Sci，1997，37（2）：160-163.

［6］劉敏.椰子水營養(yǎng)成分的分析.云南熱作科技，2001，24（4）：38-40.

［7］Chidambaram S，Singaraja C，Prasanna MV，et al.Chemistry of tendercoconutwaterfrom theCuddalorecoastalregionin Tamil Nadu.Nat Resour Res，2013，22（2）：91-101.

［8］Awua AK，Doe DE，Agyare R，et al.Exploring the influence of sterilisation and storage on some physicochemical properties of coconut（Cocosnucifera L）water.BMC Res Not，2011，4（1）：1-9.

［9］鄭亞軍，陳衛(wèi)軍.天然椰子水的抗氧化活性.熱帶作物學(xué)報(bào)，2009，30（2）：230-233.

［10］Santos JLA，Bispo VS，F(xiàn)ilho ABC，et al.Evaluation of chemical constituentsandantioxidantactivityofcoconutwater（Cocusnucifera L）and caffeic acid in cell culture.Anais da Academia Brasileira de Ciências，2013，84（4）：1235-1246.

［11］李杰，黃麗云，唐龍祥，等.我國椰子主栽品種與主要育種方法的探討.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（18）：5408-5409.

［12］孟巍，余良主，王利.大鼠酒精性肝模型的建立.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，18（10）：1364-1367.

［13］劉敏，鄭婷，駱彥霏，等.紅牛飲料對慢性酒精性肝損傷大鼠肝功能的保護(hù)作用.世界華人消化雜志，2014，22（22）：3259-3263.

［14］王朝暉，于望遠(yuǎn)，趙延紅.雄性大鼠飲水量及大便量生理值測定.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2004，14（4）：228-228.

［15］邱萍，李相，孔德松，等.酒精性肝病發(fā)病機(jī)制研究的新進(jìn)展.中國藥理學(xué)通報(bào)，2014，30（2）：160-163.

［16］王洪巖，李鑫，徐有青.酒精性肝病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展.實(shí)用肝臟病雜志，2014，17（1）：5-8.

［17］Das KS，Balakrishnan V，Mukherjee S，et al.Evaluation of blood oxidative stress-related parameters in alcoholic liver disease and non-alcoholic fatty liver disease.Scan J Clin Lab Invest，2008，68（4）：323-334.

［18］贠建蔚，萇新明.酒精性肝病研究進(jìn)展.國際消化病雜志，2012，32（1）：44-47.

［19］張海燕，溫韜，丁淑芹，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及氧化應(yīng)激在大鼠慢性肝損傷中的變化.肝臟，2009，14（1）：23-25.

［20］Radosavljevi T，Mladenovi D，VuceviD.Therole of oxidative stressinalcoholicliverinjury.MedicinskiPregled，2009，62（11-12）：547-553.

［21］周曉娟，王超.槲皮素對大鼠慢性酒精性肝損傷的保護(hù)作用.長江大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2013，10（33）：8-10.

［22］龍建綱，王學(xué)敏，高宏翔，等.丙二醛對大鼠肝線粒體呼吸功能及相關(guān)脫氫酶活性影響.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26（10）：1131-1135.

（收稿：2016-03-20）

（本文編輯：陳從新）

Protective effect of Hainan fresh coconut water on alcoholic liver injury in rats

Zhou Huiyou，Zheng Wanling，Jiang Cheng，et al.
Clinical Medical College，Hainan Medical University，Haikou 571101，Hainan Province，China

ObjectiveTo investigate the protective effect of Hainan fresh coconut water on alcoholic liver injury in rats.MethodsHepatic injury in rats was induced by daily administration of white spirit with alcohol concentraion of 56%by gavage for 29 days.Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into model group（n=9），control group（n=8）and coconut water group（n=9）.The animals in control was given 0.9%saline and in experimental group was given alcohol plus Hainan fresh coconut water.At the end of the experiment，the rats were sacrificed and blood and livers were collected.The histopathological change in liver was revealed by HE staining and the levels of alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），triglyceride（TG）in blood and the content of superoxidedismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）in hepatic homogenates were detected.ResultsSerum AST levels in model group was（123.0±36.2）U/L，significantly higher than that in control group［（86.5±21.0）U/L，P<0.05］or incoconut water group［（96.9±26.0）U/L，P<0.05］；there was no significant differences in serum ALT and TGlevels among the three groups（P>0.05）；the MDA level in model group was higher than that in control group or incoconut water group［（0.479±0.069）nmol/mg vs.（0.258± 0.078）nmol/mg and（0.311±0.139）nmol/mg，P<0.01 for both］；the SOD levels in coconut watergroup and model group were higher than in control group［（0.068± 0.008）U/mg and（0.071±0.010）U/mg vs.（0.044± 0.022）U/mg，P<0.05forboth］，buttherewasno difference in SOD level between coconut watergroup andmodelgroup；Mildfattydegenerationof hepatocyteswasobserved inmodelgroupandfat droplet were found from hepatocytes in centrilobular regionswithsomehepaticcongestion，however，the histologyincoconutwatergrouprevealedregular hepatic lobules withintactanddistincthepatocytestructure.ConclusionHainan fresh coconut water has certain protective effect against alcoholic liver injury in rats，and its antioxygenation might be involved in this process.

Alcoholic liver disease；Coconut water；Oxidative stress；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.05.015

2014年校級大學(xué)生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（編號：HYCX2014051）；2015年海南省大學(xué)生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（編號：20150081）

571101?？谑泻Ｄ厢t(yī)學(xué)院臨床學(xué)院2012級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科1班

周慧友，男，22歲，臨床醫(yī)學(xué)本科專業(yè)四年級學(xué)生。E-mail：1099471639@qq.com

高凌峰，E-mail：630122650@qq.com