氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器適合醋酸菌的厭氧環(huán)境

張　杰

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院， 河南 周口466001)

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氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器適合醋酸菌的厭氧環(huán)境

(周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院， 河南 周口466001)

新設(shè)計(jì)的氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器，具有精確的循環(huán)通路，可以培養(yǎng)測驗(yàn)厭氧微生物. 該生物反應(yīng)器促使細(xì)胞暴露在厭氧環(huán)境中，通過CO2循環(huán)實(shí)現(xiàn)厭氧環(huán)境. 在新的氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器中培養(yǎng)醋酸菌時，醋酸菌的生物產(chǎn)量是對照生物反應(yīng)器的1.3倍. 培養(yǎng)200 h時，總酸的產(chǎn)量是對照生物反應(yīng)器的1.2倍. 該反應(yīng)器用于厭氧醋酸菌培養(yǎng)時優(yōu)于普通生物反應(yīng)器.

醋酸菌；氣升式厭氧反應(yīng)器；滯留效應(yīng)；氣體分散擋板

厭氧微生物可以生產(chǎn)多種有用的復(fù)合物，可以降低空氣中二氧化碳. 由于厭氧生物反應(yīng)器發(fā)展滯后只有少數(shù)厭氧微生物被商業(yè)化培養(yǎng)[1]. 厭氧微生物在可持續(xù)的生產(chǎn)技術(shù)中具有重要角色[2]. 厭氧微生物及其產(chǎn)物的濃度和產(chǎn)量在普通生物反應(yīng)器中的獲得量較低, 其中一個主要原因就是不能有效地提供厭氧環(huán)境[3]. 限制其生產(chǎn)量的其他因素包括：傳統(tǒng)的氣升式生物反應(yīng)器不能有效抑制氧的聚集；通過呼吸作用消耗的培養(yǎng)基不能有效轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物；CO2和培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)不能充分混合；反應(yīng)器部分區(qū)域形成攪拌死角.

在合適的厭氧環(huán)境中，如果醋酸菌細(xì)胞能夠在氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器的內(nèi)部和外部氣體分散孔處反復(fù)循環(huán)就能加強(qiáng)培養(yǎng)基的有效轉(zhuǎn)化. 這種增強(qiáng)效應(yīng)就是CO2的循環(huán)滯留效應(yīng)[4- 5]. 隨意的循環(huán)滯留不能增強(qiáng)轉(zhuǎn)化效率. 雖然很多氣升式厭氧生物反應(yīng)器利用循環(huán)滯留增強(qiáng)發(fā)酵物種的轉(zhuǎn)換效率[6]，但是都沒有能開發(fā)出一種有效的CO2循環(huán)模式. 筆者報(bào)道了一種新的氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器，利用CO2的循環(huán)效應(yīng)可以增強(qiáng)醋酸菌細(xì)胞生物量和發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率. 該氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器遵循氣升原理，用氣體分散孔的作用增加了CO2的路徑，調(diào)整了醋酸菌的厭氧環(huán)境.

1　材料與方法

1.1微生物和測試指標(biāo)

醋酸菌(宋河酒業(yè)窖池中分離)來自周口師范學(xué)院白酒聯(lián)合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室. DS培養(yǎng)基(后補(bǔ)磷和氮)培養(yǎng)醋酸菌. 后期磷和氮的補(bǔ)充量為5 g/L KNO3，0.75 g/L K2HPO4，初始 pH值為7.0.

醋酸菌濃度由α-1900S系列雙光束掃描型紫外可見分光光度計(jì)測得625 nm OD值確定.

乙酸的測定：根據(jù)GB 5413.34-2010測定.

總酸的測定：根據(jù)GB/T 12456-2008測定.

pH值的測定用pH計(jì).

醋酸菌的CO2補(bǔ)償和CO2飽和點(diǎn)的確定方法：40 mL的稀釋細(xì)胞懸液 (光吸收值0.1) 置于250 mL的搖瓶中培養(yǎng)，利用中和法測定水中游離二氧化碳.

以上各個實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次.

1.2氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)

氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器由玻璃做成，頂部配置各種傳感器，小導(dǎo)管位于反應(yīng)器的一側(cè)(圖1A). 上升氣體被氣體分散孔均勻輸送到分隔的區(qū)域. 氣體分散孔擋板(圖1B)固定在同一中心軸承上，上升區(qū)域輸進(jìn)壓縮的CO2. 液體在分隔的區(qū)域內(nèi)形成渦流，這樣帶動細(xì)胞在狹窄的氣體分散孔擋板區(qū)域和孔區(qū)域交替運(yùn)動 (圖1C)，分別用有氣體分散擋板和無氣體分散擋板兩種不同生物反應(yīng)器測試其效應(yīng). 循環(huán)冷卻水通過固定在反應(yīng)器前方的透明套管控制溫度，溫度和pH感應(yīng)器置于反應(yīng)器的頂部，鄰接在氣體出口.

圖1A氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖；B氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器氣體分散擋板；C 氣體分散效應(yīng)示意圖.

1.3培養(yǎng)物在氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器中的生長

為獲得一定濃度的種子，醋酸菌接種在帶有蠕動泵的環(huán)管反應(yīng)器中，培養(yǎng)過程中用空氣壓縮機(jī)輸入CO2. pH值根據(jù)需求通過注入CO2的方法控制在7 ± 0.1的范圍內(nèi). 醋酸菌在接種到氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器之前，需要生長到 15～20 OD.

1.4醋酸菌產(chǎn)率和pH值評價氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器的性能

醋酸菌的生長實(shí)驗(yàn)分別在氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器和具有相同體積及形狀的柱狀3.0 L反應(yīng)器(對照)中完成. 最終以醋酸菌的產(chǎn)率和反應(yīng)產(chǎn)物為評價標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而確定反應(yīng)器的優(yōu)劣. 培養(yǎng)過程如下：反應(yīng)器用3%的過氧化氫過夜滅菌，然后用無菌水沖洗3次. 醋酸菌在反應(yīng)器中生長從起始光密度3.5到最終光密度11 ± 1. 在每次實(shí)驗(yàn)之前，將醋酸菌的OD值稀釋到3.5. 通過逐步調(diào)節(jié)CO2流量，直到匹配的培養(yǎng)要求. 當(dāng)CO2流量到達(dá)0.7 L/s的時候?yàn)樽罴?，故采用的CO2流量為0.7 L/s，溫度為37 °C，pH為7 ± 0.1，通過感應(yīng)器控制.

2　結(jié)果與分析

2.1醋酸菌的生長曲線

醋酸菌的生長速率和CO2流速之間的關(guān)系如圖2所示. 由圖2可以看出CO2補(bǔ)償點(diǎn)為0.125 L/ s，CO2飽和點(diǎn)約為0.75 L/s，最大生長速率為0.125 OD/h. 這些結(jié)果顯示：通過調(diào)節(jié)CO2在生物反應(yīng)器中變化可以控制醋酸菌的生長，同時避免CO2抑制現(xiàn)象的出現(xiàn).

圖2　醋酸菌和CO2流速之間的關(guān)系

2.2醋酸菌在氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器和普通反應(yīng)器中的培養(yǎng)和生產(chǎn)率

圖3A 醋酸菌在氣升式厭氧反應(yīng)器中的生長曲線圖；B醋酸菌在氣升式厭氧反應(yīng)器中乙酸產(chǎn)量曲線圖

醋酸菌在氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器和普通反應(yīng)器中的生產(chǎn)率如圖3A所示. 氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器單位體積的生產(chǎn)量是普通生物反應(yīng)器的1.3倍. 他們的最大生產(chǎn)率分別是1.2和0.9 OD，具有顯著性差異(P<0.05). 按0.5 g/L培養(yǎng)基干重計(jì)算，氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器和普通反應(yīng)器的醋酸菌菌體的生產(chǎn)效率分別是2.4%和1.8%. 乙酸的產(chǎn)量在200 h時達(dá)到最大(圖3B)，氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器和普通反應(yīng)器中的產(chǎn)量分別為70和60 mg/100 mL. 因?yàn)椴僮鳁l件和反應(yīng)器體積都是一致的，他們只有氣體分散擋板的差別，故所顯示的結(jié)果表明氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器生產(chǎn)率的提高是由于安裝了氣體分散擋板緣故.

2.3氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器中CO2對總酸和pH值的影響

圖4培養(yǎng)過程中總酸和pH值的變化

醋酸菌在氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器和普通反應(yīng)器中的總酸和pH值的變化如圖4A和4B所示. 總酸最大生產(chǎn)量分別是98.2和80.0 mg/100 mL. 氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器單位體積的總酸生產(chǎn)量是普通反應(yīng)器的1.2倍(圖4A). 醋酸菌在氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器中耐酸性更強(qiáng)，其生長環(huán)境的酸度比普通反應(yīng)器中的高(圖4B). 上述結(jié)果表明氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器生產(chǎn)的總酸量高于普通生物反應(yīng)器，并且為醋酸菌的生長提供了一個更好的酸性馴化環(huán)境.

3　討論

在一個厭氧有限的反應(yīng)器中，厭氧環(huán)境越優(yōu)越，厭氧細(xì)胞密度就越高，單位體積的生產(chǎn)率就越高[6]. 安裝氣體分散擋板提高生產(chǎn)率的原因有以下幾個方面:(1)氣體分散擋板提高了CO2在生物反應(yīng)器中的滯留時間，進(jìn)而影響CO2和氧的轉(zhuǎn)換速率. 氧的積累減少和CO2的增多能夠滿足醋酸菌的厭氧需求. 但是這樣并不能完全解釋氣體分散擋板反應(yīng)器就可以具有較高的生產(chǎn)效率. (2)氣體分散擋板增強(qiáng)了培養(yǎng)基的混合性. 然而兩個反應(yīng)器都能夠提供充分的混合為細(xì)胞提高充足的養(yǎng)分. 事實(shí)上，在生物量很低的時候，兩個反應(yīng)器的生產(chǎn)率是相似的(圖2A). 因此氣體分散擋板提供可溶解的養(yǎng)分并不能解釋兩個反應(yīng)器生產(chǎn)率差異的原因. 因?yàn)榈土资浅刻砑拥?，故營養(yǎng)限制被排除，并且早期的實(shí)驗(yàn)中，同樣的培養(yǎng)基中可以獲得相似的產(chǎn)率和產(chǎn)物. 氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器比普通反應(yīng)器效果較好的唯一原因是培養(yǎng)基和CO2的濃度變得更均勻. 例如，一定體積空間培養(yǎng)基和CO2更能均勻分散，在這樣的區(qū)域混合能使其效果更好，CO2的滯留時間更長. 在普通反應(yīng)器中，培養(yǎng)基和CO2的混合區(qū)域無序運(yùn)動的，并且沒有有效的滯留時間. 氣升擋板式厭氧生物反應(yīng)器的氣體分散擋板為醋酸菌提供了CO2滯留與分散效應(yīng).

在醋酸菌培養(yǎng)時沒有檢測到一系列關(guān)于CO2和O2抑制現(xiàn)象. 顯微檢測顯示沒有細(xì)胞器損害，沒有明顯的膜破損和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象. 在醋酸菌批量培養(yǎng)的后期檢測到一些異味氣體，表明厭氧效應(yīng)不夠完美[7]，在普通反應(yīng)器中早期檢測到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象.

精確的CO2-培養(yǎng)基混合模式通過滯留效應(yīng)增強(qiáng)醋酸菌的產(chǎn)率是必要的. 相反，雜亂的CO2-培養(yǎng)基混合模式不能有效地增強(qiáng)醋酸菌的產(chǎn)率.

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[2]Frey B, Rime T, Phillips M, et al. Microbial diversity in European alpine permafrost and active layers[J]. Fems Microbiology Ecology, 2016，92(3):1-3.

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A airlift anaerobic bioreactor with scattering baffle are benefit for anaerobic environment of vinegar organism

ZHANG Jie

(College of Life Science and Agronomy,Zhoukou Normal University, Zhoukou 466001,China)

A newly developed airlift anaerobic bioreactor with air hole and circulatory pathway was tested for anaerobic microorganism. The airlift anaerobic bioreactor provide anaerobic environment for cells by loop of CO2. The production of vinegar organism is 1.3 times higher than the common bioreactor. The production of total acid is 1.2 times higher than the control after culturing 200 h. The above results showed that the newly developed airlift anaerobic bioreactor performance prior to the common bioreactor in culturing vinegar organism.

vinegar organism;airlift anaerobic bioreactor;retention effect;air scattering baffle

2016-05-22;

2016-06-25

河南省教育廳自然科學(xué)資助項(xiàng)目(No.2011B180061);(No.2011-zknufh-01);(No.2011B180058)

張杰(1975- ), 男, 河南太康人, 博士研究生，講師,主要研究方向:分子生物學(xué)與生物工程.

TP391

A

1671-9476(2016)05-0117-03

10.13450/j.cnki.jzknu.2016.05.030