大米中限用合成色素測(cè)試方法研究

王彧婕，葉善蓉，劉明東，譚和平

（中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院，四川 成都 610021）

大米中限用合成色素測(cè)試方法研究

王彧婕，葉善蓉，劉明東，譚和平

（中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院，四川 成都 610021）

合成色素由于其芳香結(jié)構(gòu)的特殊性，具有高毒性和高殘留，因此食用染色大米會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生極大的危害。該文建立高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜定性檢測(cè)大米中52種限用合成色素的方法。樣品經(jīng)過正己烷、水和乙腈、1%氨水-甲醇分3級(jí)提取。采用XDB-C18液相色譜柱分析，正離子模式采用1%甲酸水溶液和乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，負(fù)離子模式采用20mmol/L乙酸銨水溶液和乙腈作為流動(dòng)相梯度洗脫，ESI全掃描模式檢測(cè)。結(jié)果表明：52種合成色素分別得到有效提取，加標(biāo)回收率為80%~102%。通過優(yōu)化錐孔電壓，得到52種合成色素的最大豐度分子離子峰，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)的匹配度均達(dá)到95%以上。該定性檢測(cè)方法對(duì)大米中濫用色素篩查具有良好的適應(yīng)性。

高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜；大米；合成色素；定性檢測(cè)

0　引　言

黑米、紅米、紫米、黃小米和竹香米等有色大米，由于其豐富的營(yíng)養(yǎng)和更高的食、藥用價(jià)值，受到人們的普遍喜愛。但是近年來有媒體報(bào)道，檸檬黃色素[1]被不法商販用于陳小米染色，在市場(chǎng)上大肆流通；在遼寧、山東等地，曾出現(xiàn)免淘洗綠色竹香米，經(jīng)有關(guān)部門抽檢后發(fā)現(xiàn)實(shí)際是以人工合成色素亮藍(lán)和檸檬黃混合染色而成。美國(guó)、日本、歐盟等國(guó)家和地區(qū)都對(duì)食品添加劑類色素的限量和禁止使用的色素有明確的規(guī)定。我國(guó)于2008年底至今公布的6批食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單中就有7種為工業(yè)色素[2]。合成色素由于其經(jīng)過苯、甲苯、萘、蒽等化工原料有機(jī)反應(yīng)合成，且大多含有芳香結(jié)構(gòu)，可在人體內(nèi)代謝分解產(chǎn)生芳香胺類高毒性、高殘留物質(zhì)，并具有致畸、致癌、致突變等嚴(yán)重危害[3]。同時(shí)，國(guó)外報(bào)道合成色素和兒童患多動(dòng)癥有關(guān)，歐美國(guó)家正逐步立法減少合成色素的使用，如英國(guó)食品安全局禁止檸檬黃、日落黃、誘惑紅等6種合成色素在兒童食品中使用[4]。因此，建立一種高通量的快速定性檢測(cè)方法用以檢測(cè)有色大米中是否添加合成色素，是一項(xiàng)十分重要和緊迫的工作。

目前對(duì)食品中合成色素的檢測(cè)方法主要有毛細(xì)管電泳法[5]、薄層色譜法[6]、電化學(xué)分析法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、高效液相色譜法[9]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]等，毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法和電化學(xué)分析法靈敏度低、選擇性較差；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法難于分析高沸點(diǎn)、揮發(fā)性強(qiáng)的合成色素；液相色譜法適用范圍廣、前處理較簡(jiǎn)單，但無法對(duì)化合物進(jìn)行有效確認(rèn)，易出現(xiàn)假陽性。限用合成色素種類繁多，如何在有限的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)其的高通量快速篩查，是亟需解決的問題。高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（time-of-flight mass spectrometry，TOF）檢測(cè)技術(shù)可提供精確質(zhì)量數(shù)，分辨率高，具有很寬的質(zhì)量掃描范圍，該技術(shù)已經(jīng)在農(nóng)藥殘留、獸藥殘留和環(huán)境分析等方面建立了較為完善的篩查體系。本文以有色大米為研究對(duì)象，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器聯(lián)合飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)52種合成色素（包括水溶性色素、極性工業(yè)染料和脂溶性色素）進(jìn)行研究，建立了大米中合成色素的快速定性檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

色素標(biāo)準(zhǔn)品：檸檬黃、赤蘚紅、新紅、堿性紅2、羅丹明B、堿性橙2、堿性橙21、喹啉黃、分散橙11、分散橙3、分散黃23、直接黑38、羅丹明B、酸性紫49、麗春紅 SX、酸性紅26、堿性紫5BN、隱性結(jié)晶紫、蘇丹黃、對(duì)位紅、蘇丹紅7B、分散紅17、分散橙1、分散紅11、堿性嫩黃O和堿性紫14（Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；酸性黑1、亮黑PN、酸性黃36、酸性黃3、酸性綠50、堅(jiān)牢綠FCF、亮綠SF、酸性綠3和萘酚黃S（CNW公司）；蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV（上海滬試）；日落黃、莧菜紅沃凱；胭脂紅（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；誘惑紅（TCI公司）；亮藍(lán)（aladdin公司）；酸性橙II（TCI公司）；堿性橙2（Sigma公司）。

乙腈、甲酸、甲醇、正己烷（色譜純，美國(guó)sigmaaldrich公司）；乙酸銨、氨水（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；水（Milli-Q超純水）。

1.2儀器與設(shè)備

6210型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司），精確分子量范圍：m/z（50~3200）；1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），配DAD檢測(cè)器；分析天平（德國(guó)sartorius公司）。

1.3色譜及質(zhì)譜條件

液相條件：液相色譜柱：Agilent XDB-C18液相色譜柱（3.0 mm×100 mm×1.8 μm）；流動(dòng)相：負(fù)模式：20 mmol/L乙酸銨水溶液（A）和乙腈（B）；正模式：0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）；流量：0.3 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。

質(zhì)譜條件：霧化壓力40psi（1psi=6.895 kPa）；毛細(xì)管電壓：3 500 V；去溶劑氮?dú)饬髁浚? L/min，溫度：350℃；除液電壓65V；錐孔電壓：120～175V。

2　樣品前處理

稱取有色大米樣品約1g，加入15mL水和20mL正己烷，渦旋震蕩1min，超聲提取5min后，5000r/min低速離心，得到正己烷層和水層，正己烷層提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干后以甲醇定容于5 mL容量瓶，0.45 μm濾膜過濾后待用；水層加入30 mL乙腈，渦旋震蕩1min，超聲提取5min，提取液過濾后70℃水浴蒸發(fā)近干以純水定容于5 mL容量瓶，0.45 μm濾膜過濾后待用；剩余殘?jiān)尤?5mL 1%氨水-甲醇溶液渦旋震蕩1min，超聲提取5min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后以甲醇定容至5mL容量瓶，0.45μm濾膜過濾后待用。

3　結(jié)果與討論

3.1前處理?xiàng)l件

3.1.1提取溶劑的選擇

本文研究的限用合成色素主要分為3類，第1類是食品添加劑類的水溶性合成色素；第2類是強(qiáng)極性的工業(yè)染料；第3類是蘇丹類脂溶性化合物及其他。在有色大米的色素定性檢測(cè)體系中，提取溶劑必須全面考慮各類不同性質(zhì)的合成色素，才能最大限度地在前處理過程中提取出各種添加色素[10]。同時(shí)，考慮到大米樣品本身脂肪含量非常低，因此，提取體系第1級(jí)采用正己烷提取蘇丹類脂溶性化合物；第2級(jí)采用水提取食品添加劑類水溶性合成色素，同時(shí)以2倍體積的乙腈沉淀樣品中的蛋白質(zhì)；第3級(jí)采用1%氨水-甲醇溶液提取強(qiáng)極性的工業(yè)染料類色素。

3.1.2提取體系的考察

考察提取溶劑的不同體積以及提取時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)提取效率的影響。分別向樣品中添加以檸檬黃、酸性橙II和蘇丹紅I為代表的色素，溶劑考察體積為5，10，15，20，25mL。

由圖1可見，當(dāng)水的體積達(dá)到15mL時(shí)，檸檬黃的回收率趨于穩(wěn)定，故將水的提取體積確定為15mL；由圖2可見，1%氨水-甲醇體積在15mL時(shí)，酸性橙的回收率最高，故將1%氨水-甲醇體積確定為15mL；由圖3可見，正己烷體積達(dá)到20mL時(shí)，蘇丹紅I回收率較好，故正己烷提取體積為20mL。

圖1　水的體積對(duì)檸檬黃回收率的影響

圖2　1%氨水-甲醇體積對(duì)酸性橙II回收率的影響

圖3　正己烷體積對(duì)蘇丹紅I回收率的影響

以水為提取溶劑，考察超聲時(shí)間5，10，15，20，25min對(duì)檸檬黃回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超聲時(shí)間對(duì)檸檬黃回收率無顯著影響，證明色素在相應(yīng)溶劑中的溶解性很好，故將超聲提取時(shí)間設(shè)置為5min。

3.2色譜/質(zhì)譜分離

3.2.1色譜條件的選擇

液相色譜的檢測(cè)器采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD），可以多波長(zhǎng)檢測(cè)，避免雜質(zhì)組分的干擾。根據(jù)各個(gè)化合物的最大吸收波長(zhǎng)，將檢測(cè)波長(zhǎng)確定為254，410，518，610nm。正模式采用乙腈-0.1%甲酸水溶液流動(dòng)相；負(fù)模式采用乙腈-20mmol/L乙酸銨水溶液流動(dòng)相，具體梯度洗脫條件如表1所示。

表1　合成色素的液相梯度洗脫條件1）

3.2.2質(zhì)譜條件的選擇

ESI過程是將離子從溶液中轉(zhuǎn)移至氣相；所以，使待測(cè)成分在試樣溶液中成為離子狀態(tài)，可提高生成氣相離子的效率，以提高檢測(cè)靈敏度。TOF定性主要依靠分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)，錐孔電壓對(duì)分子離子峰強(qiáng)度影響較大，較大的電壓會(huì)發(fā)生碰撞誘導(dǎo)解離，可獲得分子離子峰的碎片離子。通常情況下，在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸能增加色素在正離子檢測(cè)模式下的電離效率，促進(jìn)[M+H]+分子離子峰的形成；同樣，在流動(dòng)相中加入乙酸銨，能夠促進(jìn)負(fù)離子檢測(cè)模式下[M-H]-分子離子峰的形成。因此，實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸水溶液和乙腈作為正模式流動(dòng)相，20mmol/L乙酸銨水溶液和乙腈作為負(fù)模式流動(dòng)相。

合成色素大多帶有磺酸根、Na+以及Cl-等[4]，結(jié)構(gòu)多為雙萘型、苯-萘型、氧雜蒽型或三芳甲烷類。在合適的錐孔電壓下，負(fù)離子模式下易失去Na+形成[M-nNa+nH-H]-的分子離子峰，正離子模式下易直接失去Cl-形成[M-Cl]+的分子離子峰；故將錐孔電壓優(yōu)化設(shè)置為120～175V，得到各色素的最大豐度分子離子峰（如表2、表3所示）。

3.3HPLC-TOF/MS分析結(jié)果

將加標(biāo)質(zhì)量濃度為1μg/mL的大米樣品按建立的方法前處理及高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜ESI正負(fù)模式全掃描分析，得到52種合成色素的目標(biāo)母離子的實(shí)際提取離子圖。以酸性橙II、堿性橙II、羅丹明B、蘇丹紅I、堿性嫩黃O和孔雀石綠為例，如圖4～圖9所示。

通過目標(biāo)母離子理論精確質(zhì)量數(shù)和實(shí)際檢測(cè)質(zhì)量數(shù)的差異得到每種色素與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物的匹配度，同時(shí)計(jì)算各色素的加標(biāo)回收率，如表2、表3所示。

配制正模式25種、負(fù)模式27種合成色素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線，將線性范圍最低點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋在S/N=3時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度換算成樣品中含量即為檢出限（LOD），如表2、表3所示。

圖4　酸性橙II

圖5　堿性橙II

圖6　羅丹明B

圖7　蘇丹紅I

圖8　堿性嫩黃O

圖9　孔雀石綠

表2　負(fù)模式27種合成色素匹配度、錐孔電壓、加標(biāo)回收率及檢出限

由表可知，52種合成色素的實(shí)際檢測(cè)精確質(zhì)量數(shù)偏離都小于5/1000000，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)的匹配度均達(dá)到95%以上，可以推測(cè)篩查的化合物即為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物；同時(shí)，化合物的加標(biāo)回收率介于80%~102%之間，回收率良好，說明經(jīng)正己烷-水/乙腈-1%氨水/甲醇的3級(jí)提取系統(tǒng)可以將52種限用合成色素有效提取。綜合分析，該實(shí)驗(yàn)方法能夠有效地應(yīng)用于合成色素的定性檢測(cè)，為下一步有色大米中合成色素的未知成分篩查打下基礎(chǔ)。

表3　正模式25種合成色素匹配度、錐孔電壓、加標(biāo)回收率及檢出限

4　結(jié)束語

大米中濫用合成色素對(duì)人體會(huì)造成極大的危害，目前國(guó)內(nèi)在這一領(lǐng)域的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)缺失，應(yīng)及早建立相應(yīng)的檢測(cè)方法和測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)大米的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行有效監(jiān)管。本文建立了大米中52種限用合成色素的液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜定性檢測(cè)方法。樣品前處理采用正己烷-水/乙腈-氨水/甲醇提取溶劑進(jìn)行3級(jí)提取，保證了不同性質(zhì)合成色素的最大提取效率；樣品檢測(cè)采用飛行時(shí)間質(zhì)譜精確分子量定性，檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配度均達(dá)到95%以上，加標(biāo)回收率良好，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中52種限用合成色素的定性檢測(cè)。本方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高，對(duì)有色大米中限用色素的快速篩查具有良好的適應(yīng)性。

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（編輯：莫婕）

Determination of limitative synthetic pigments in rice

WANG Yujie，YE Shanrong，LIU Mingdong，TAN Heping
（National Institute of Measurement and Testing Technology，Chengdu 610021，China）

Synthetic pigment in dyed rice is harm to human health because of its special aromatic structure as well as high toxicity and high residual.HPLC-TOF/MS is introduced in this paper to determine 52 kinds of limitative synthetic pigment in rice.First，samples are extracted with nhexane，acetonitrile and water，and 1%aqueous ammonia-methanol in succession;second，a XDB-C18 HPLC column is used for analysis;third，1%aqueous formic acid and acetonitrile are used for mobile phase gradient elution in positive ion mode while 20 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile are used for mobile phase gradient elution in negative ion mode;and the last step is ESI full scan testing.The results show that all the synthetic pigment is efficiently extracted，with an adding standard recovery of 80%to 102%.Cone voltage is optimized to acquire the most abundant molecular ion peaks of the synthetic pigment，matching with the results in reference materialspectradatabasesbymorethan95%.Thisqualitativedetectionmethodhasgood adaptability in screening the rice with synthetic pigment.

HPLC-TOF/MS；rice；synthetic pigment；qualitative detection

A

1674-5124（2016）03-0048-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.03.012

2015-10-18；

2015-11-23

四川省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013NZ0040）作者簡(jiǎn)介：王彧婕（1982-），女，四川成都市人，助理研究員，主要從事化學(xué)分析測(cè)試技術(shù)研究。

譚和平（1957-），男，重慶市人，研究員，享受國(guó)務(wù)院政府津貼專家，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)研究。