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    具ACE抑制活性的油茶餅粕酶解物的制備及分離表征

    2016-10-17 08:09:49高剛峰陳勇強陳養(yǎng)陳莉沈雙玲
    福建輕紡 2016年1期
    關鍵詞:解物抑制率蛋白酶

    高剛峰,陳勇強,陳養(yǎng),陳莉,沈雙玲

    (1.三明市生物醫(yī)藥及生物產(chǎn)業(yè)工作辦公室, 福建 三明 365000;2.福建省農(nóng)產(chǎn)品加工推廣總站,福建 福州 350001;3.尤溪縣林業(yè)局,福建 尤溪 365100)

    具ACE抑制活性的油茶餅粕酶解物的制備及分離表征

    高剛峰1,陳勇強2,陳養(yǎng)3,陳莉1,沈雙玲1

    (1.三明市生物醫(yī)藥及生物產(chǎn)業(yè)工作辦公室, 福建 三明 365000;2.福建省農(nóng)產(chǎn)品加工推廣總站,福建 福州 350001;3.尤溪縣林業(yè)局,福建 尤溪 365100)

    以油茶餅粕為原料,研究通過5種蛋白酶水解制備的茶粕酶解物ACE抑制率隨酶解時間的變化規(guī)律,結果表明除蛋白酶C外,其余4種蛋白酶水解的茶粕酶解物ACE抑制率隨酶解時間呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。比較不同蛋白酶水解的茶粕酶解物ACE抑制活性得出經(jīng)蛋白酶A水解后的茶粕酶解物具有較高的ACE抑制率(94.4%);為獲得高純度并具有高ACE抑制活性的酶解組分,文章采用CM-SephadexC-25陽離子交換色譜和RP-HPLC純化經(jīng)蛋白酶A酶解的茶粕酶解物。由CM-SephadexC-25陽離子交換色譜分離得到一個組分A,通過RP-HPLC進一步分離組分A得到6個組分。對ACE抑制率最高的組分A-2 進行RP-HPLC二次純化,得出該分離組分達到色譜純,其半數(shù)抑制濃度(IC50)為98μg.mL-1。

    油茶餅粕;ACE抑制率;RP-HPLC

    ACE抑制活性物質通過抑制ACE活性達到降血壓的作用。它們對ACE活性區(qū)域的親和力大于血管緊張素I(Angiotensin I)和緩激肽(BradykininI)對ACE的親和力,并且一旦和ACE活性區(qū)域結合就難于釋放,從而阻礙ACE催化水解血管緊張素I(AngiotensinI)成為血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ)以及催化水解緩激肽(Bradykinin)成為失活片段的兩種生化反應過程,起到降血壓的作用[1,2]。目前,微生物發(fā)酵或蛋白酶水解是生產(chǎn)ACE抑制活性物質的最常用的方法,其次還有從自溶產(chǎn)物中提取、DNA重組技術及化學合成等方法[3-6]。酶法水解是目前獲得ACE抑制活性物質的主要途徑,該方法的優(yōu)點是生產(chǎn)成本低,而且產(chǎn)品的安全性高,無副作用。

    茶籽餅又名油茶餅粕,別名茶麩、茶枯,呈紫褐色顆粒,是野山茶油果實榨油后剩下的渣,其數(shù)量相當于茶油的3倍。我國年產(chǎn)茶油約15萬t,茶籽餅約50萬t[6]。用有機溶劑將茶籽餅進行進一步提油后的殘渣即為茶粕。全國每年有榨油后剩下的約50萬t。根據(jù)分析測定,油茶餅粕中富含蛋白質、脂肪、淀粉、茶皂素、粗纖維,茶粕蛋白質中含有18種氨基酸,包括畜禽生長所需的10種必需氨基酸,其中蘇氨酸、谷氨酸、組氨酸和精氨酸等含量較為豐富[1,8]。但由于茶粕味苦有毒,目前基本上被廢棄,造成了很大的資源浪費。因此,文章擬對茶粕進行深度開發(fā)和利用,通過酶解技術制備具ACE抑制活性的茶粕酶解物,再經(jīng)過色譜等分離方法對酶解產(chǎn)物的ACE活性活性物質進行分離和表征。

    表1 酶解處理表

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 材料和藥品

    油茶餅粕,沈郎食用油公司提供,粉碎過篩待用;蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D和蛋白酶E,丹麥NOVE公司;馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、血管緊張素轉化酶(ACE),Sigma公司。

    1.1.2 儀器和設備

    HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司;V-1200型可見光分光光度計:上海美譜達儀器有限公司; SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵:鄭州長城科工貿(mào)有限公司;ML-902型磁力攪拌器:上海浦江分析儀器廠;TDL-5-A型臺式離心機:上海安亭科學儀器廠;868型pH計:Orion Research公司;KQ-250E型超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;TE601-L型,BS110S型電子天平:北京賽多科斯天平有限公司;EasySepTM-1010型高效液相色譜儀:上海通微分析技術有限公司;CM-SephadexC-25陽離子交換柱:上海賀寶化工有限公司;BS-100A型自動部分收集器:上海滬西分析儀器廠。

    1.2 方法

    1.2.1 茶粕酶解物的制備

    將底物濃度為2.5%的茶粕置于250mL三角瓶中,采用表1的處理方法進行酶解,水解在恒溫水浴振蕩器中進行。反應結束后,將反應體系在85℃下加熱使酶失活。

    1.2.2 茶粕酶解物的分離純化

    1.2.2.1 離心和微濾

    酶解液經(jīng)過離心機4000r.min-1離心10min,收集上清液;將上清液經(jīng)過膜孔徑為0.2um的無機膜微濾,收集濾液供后續(xù)分離操作。

    1.2.2.2 離子交換層析初步分離

    陽離子交換樹脂預處理參照趙永芳[9]方法,采用濕法填柱。

    將濾液(經(jīng)過透析除鹽)20mL上樣至CMSephadexC-25陽離子層析柱,分離條件為:凝膠柱φ1.6×15cm,洗脫液0.02mol.L-1pH3.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和1mol.L-1氯化鈉溶液,氯化鈉線性洗脫梯度0~ mol.L-1,流速為0.5mL.min-1,每管收集時間為10mL,檢測波長為220nm。

    1.2.2.3 RP-HPLC分離純化

    [10]并略作改動。將經(jīng)離子交換層析分離的組分凍干,適當稀釋后采用RP-HPLC進一步分離。色譜條件:色譜柱EasySepTMC18 分析型色譜柱(5um4.6?250mm),檢測波長220nm,柱溫25℃;流速1mL.min-1;洗脫條件:0~5min,100%A;5~20min,100%A~60%A;20~30min,60%A~100%B;30~50min,100%B(A:0.05%TFA+5%乙腈,B:80%乙睛+0.05%TFA)。收集各組分峰,重復進樣,收集多次,冷凍干燥,并測定每個組分峰的ACE抑制活性。經(jīng) RP-HPLC一次制備的具有最高ACE抑制活性的組分再次進行二次純化。

    1.2.3 茶粕酶解物水解度的測定

    參考文獻甲醛滴定法[8]

    1.2.4 ACE抑制活性的測定

    ACE抑制率根據(jù)參考文獻[11]和[12]的方法測定,ACE半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定參考文獻[13]。

    2 結果與分析

    2.1 酶解時間與ACE抑制率的關系

    5種蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率和水解度隨酶解時間的變化趨勢見圖1。

    從圖1可以看出,水解度隨著時間的延長而增大,符合酶解的一般規(guī)律;但是,茶粕酶解物的ACE抑制率并不隨時間增加而增大,除蛋白酶C外,其余四種蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率隨酶解時間的延長呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。原因可能是:隨著酶解時間的延長,原來酶解出的具有ACE抑制活性的物質被進一步酶解,酶解物的端基和肽鏈長度等發(fā)生了變化,使得之前酶解出的物質失去了原有的ACE抑制活性,所以,ACE抑制活性不會隨著氨基氮含量呈先增加后穩(wěn)定的趨勢變化。從圖中還可以看出,不同酶解時間所獲得的茶粕酶解物都體現(xiàn)出一定的ACE抑制活性,即存在著多種ACE活性抑制物質。這一現(xiàn)象與吳建平等人的報道基本一致[14],即ACE是一類專一性相對較弱的酶,在蛋白質經(jīng)酶解后的酶解物中,存在著多種ACE抑制活性物質,這些ACE抑制活性物質并非是簡單的或有或無。

    2.2 不同蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率的對比分析

    由圖2可知,沒有經(jīng)過酶解的茶粕提取液就存在74.5%的ACE抑制率,說明茶粕提取液本身就含有一定的ACE抑制活性物質。茶粕經(jīng)蛋白酶酶解后,抑制率均有所提高,最高提高了27%,說明酶解液中有ACE抑制活性物質的存在。五種酶水解后的ACE抑制活性大小依次為:蛋白酶A>蛋白酶D>蛋白酶E>蛋白酶C>蛋白酶B;從氨基氮含量來看,蛋白酶C水解后氨基氮含量最高。相比之下,其他酶解液的氨基氮含量偏低,尤其蛋白酶D,其氨基氮含量只有0.037mg.mL-1,但抑制率就高達92.8%。

    ACE抑制肽大約包含2~12個氨基酸殘基,有研究表明分子質量小利于肽在體內的吸收利用,但也有極個別的由27個氨基酸組成的降血壓肽被發(fā)現(xiàn)。降血壓肽的抑制活性與其氨基酸結構和組成密切相關。經(jīng)研究認為ACE抑制肽的抑制活性主要取決于C端氨基酸, C端氨基酸為芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸)時,其抑制活性較高。而且,C端殘基上帶正電荷的氨基酸的存在可以顯著增強降壓肽的抑制活性,如精氨酸(胍基)。此外,ACE抑制肽的疏水性也是影響其活性的重要因素,高親水性使其無法接近ACE活性部位而導致弱或無活性。這些對ACE抑制肽的結構分析還局限于對已知氨基酸序列的肽進行定性的分析,許多肽并不符合這些研究結果,確切的構效關系模型至今仍未建立,有待進一步的研究[1,15]。

    蛋白酶B、C氨基氮含量高,但ACE抑制率偏低,這可能與這兩種酶是具有內切蛋白酶和外切蛋白酶兩種活性酶有關。內切酶和外切酶同時存在于一個酶解反應體系時,對增加酶解物中氨基酸的量和改善酶蛋白多肽的風味有好處,但可能不利于制備功能活性物質[16]。

    蛋白酶A、蛋白酶D和蛋白酶E酶解液的ACE抑制率均很高是由于這些酶的酶切位點均含有芳香族的氨基酸,這些氨基酸都具有ACE抑制活性。例如:蛋白酶D酶切位點所形成的氨基酸殘基中苯丙氨酸、色氨酸均是ACE抑制肽的端基組成,并且酶切后形成的丙氨酸殘基是疏水性氨基酸,酪氨酸殘基是帶正電荷的氨基酸殘基,這都有利于增強ACE抑制的活性,所以蛋白酶D酶解后的茶粕酶解物ACE抑制性很高。

    2.3 茶粕酶解物的分離純化

    2.3.1 離子交換層析分離茶粕酶解物

    茶粕經(jīng)蛋白酶酶解的產(chǎn)物經(jīng)CM-SephadexC-25陽離子交換層析分離的色譜見圖3。從圖3中可以看出分離結果只有一個峰A,其220nm的吸光值為0.409。

    2.3.2 RP-HPLC分離純化組分A

    將CM-SephadexC-25陽離子交換層析分離得到的A組分進行RP-HPLC進一步分離,分離結果見圖4。組分A經(jīng)RP-HPLC分離得到6個分離組分,分別標記為:A-1、A-2、A-3、A-4、A-5和A-6。測定各分離組分ACE抑制率見表2。

    表2 RP-HPLC各分離組分的ACE抑制率

    根據(jù)表2結果,組分A-2的ACE抑制率最高。將組分A-2進行RP-HPLC二次純化,結果見圖5。由圖5可知,組分A-2基本達到色譜純。

    3 結論

    5種蛋白酶(蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D和蛋白酶E)酶解后的茶粕酶解物ACE抑制率和氨基氮含量隨酶解時間的變化規(guī)律為:氨基氮含量隨酶解時間呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的變化趨勢,而酶解產(chǎn)物的ACE抑制率并沒有隨氨基氮含量的增加而增加;除了蛋白酶C外,其他4種蛋白酶的酶解液ACE抑制率都是隨著時間的延長呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢,蛋白酶C的酶解產(chǎn)物則是隨時間呈現(xiàn)波動變化。5種蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制活性大小依次為:蛋白酶A>蛋白酶D>蛋白酶E>蛋白酶C>蛋白酶B。其中,經(jīng)蛋白酶A水解后的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高,達到94.4%,對應的氨基氮含量為0.048mg.mL-1。

    采用CM-SephadexC-25陽離子交換色譜和RPHPLC純化經(jīng)蛋白酶A酶解的茶粕酶解物。由CMSephadexC-25陽離子交換色譜分離得到一個組分A,通過RP-HPLC進一步分離組分A得到6個組分。對ACE抑制率最高的組分A-2 進行RP-HPLC二次純化,分離圖譜為單峰,說明該分離組分達到色譜純,其半數(shù)抑制濃度(IC50) 為98μg.mL-1。

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    Q555

    A

    1007-550X(2016)01-0043-05

    10.3969/j.issn.1007-550X.2016.01.001

    2015-11-24

    高剛峰(1964-),男,高級工程師。

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