• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    具ACE抑制活性的油茶餅粕酶解物的制備及分離表征

    2016-10-17 08:09:49高剛峰陳勇強陳養(yǎng)陳莉沈雙玲
    福建輕紡 2016年1期
    關鍵詞:解物抑制率蛋白酶

    高剛峰,陳勇強,陳養(yǎng),陳莉,沈雙玲

    (1.三明市生物醫(yī)藥及生物產(chǎn)業(yè)工作辦公室, 福建 三明 365000;2.福建省農(nóng)產(chǎn)品加工推廣總站,福建 福州 350001;3.尤溪縣林業(yè)局,福建 尤溪 365100)

    具ACE抑制活性的油茶餅粕酶解物的制備及分離表征

    高剛峰1,陳勇強2,陳養(yǎng)3,陳莉1,沈雙玲1

    (1.三明市生物醫(yī)藥及生物產(chǎn)業(yè)工作辦公室, 福建 三明 365000;2.福建省農(nóng)產(chǎn)品加工推廣總站,福建 福州 350001;3.尤溪縣林業(yè)局,福建 尤溪 365100)

    以油茶餅粕為原料,研究通過5種蛋白酶水解制備的茶粕酶解物ACE抑制率隨酶解時間的變化規(guī)律,結果表明除蛋白酶C外,其余4種蛋白酶水解的茶粕酶解物ACE抑制率隨酶解時間呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。比較不同蛋白酶水解的茶粕酶解物ACE抑制活性得出經(jīng)蛋白酶A水解后的茶粕酶解物具有較高的ACE抑制率(94.4%);為獲得高純度并具有高ACE抑制活性的酶解組分,文章采用CM-SephadexC-25陽離子交換色譜和RP-HPLC純化經(jīng)蛋白酶A酶解的茶粕酶解物。由CM-SephadexC-25陽離子交換色譜分離得到一個組分A,通過RP-HPLC進一步分離組分A得到6個組分。對ACE抑制率最高的組分A-2 進行RP-HPLC二次純化,得出該分離組分達到色譜純,其半數(shù)抑制濃度(IC50)為98μg.mL-1。

    油茶餅粕;ACE抑制率;RP-HPLC

    ACE抑制活性物質通過抑制ACE活性達到降血壓的作用。它們對ACE活性區(qū)域的親和力大于血管緊張素I(Angiotensin I)和緩激肽(BradykininI)對ACE的親和力,并且一旦和ACE活性區(qū)域結合就難于釋放,從而阻礙ACE催化水解血管緊張素I(AngiotensinI)成為血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ)以及催化水解緩激肽(Bradykinin)成為失活片段的兩種生化反應過程,起到降血壓的作用[1,2]。目前,微生物發(fā)酵或蛋白酶水解是生產(chǎn)ACE抑制活性物質的最常用的方法,其次還有從自溶產(chǎn)物中提取、DNA重組技術及化學合成等方法[3-6]。酶法水解是目前獲得ACE抑制活性物質的主要途徑,該方法的優(yōu)點是生產(chǎn)成本低,而且產(chǎn)品的安全性高,無副作用。

    茶籽餅又名油茶餅粕,別名茶麩、茶枯,呈紫褐色顆粒,是野山茶油果實榨油后剩下的渣,其數(shù)量相當于茶油的3倍。我國年產(chǎn)茶油約15萬t,茶籽餅約50萬t[6]。用有機溶劑將茶籽餅進行進一步提油后的殘渣即為茶粕。全國每年有榨油后剩下的約50萬t。根據(jù)分析測定,油茶餅粕中富含蛋白質、脂肪、淀粉、茶皂素、粗纖維,茶粕蛋白質中含有18種氨基酸,包括畜禽生長所需的10種必需氨基酸,其中蘇氨酸、谷氨酸、組氨酸和精氨酸等含量較為豐富[1,8]。但由于茶粕味苦有毒,目前基本上被廢棄,造成了很大的資源浪費。因此,文章擬對茶粕進行深度開發(fā)和利用,通過酶解技術制備具ACE抑制活性的茶粕酶解物,再經(jīng)過色譜等分離方法對酶解產(chǎn)物的ACE活性活性物質進行分離和表征。

    表1 酶解處理表

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 材料和藥品

    油茶餅粕,沈郎食用油公司提供,粉碎過篩待用;蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D和蛋白酶E,丹麥NOVE公司;馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、血管緊張素轉化酶(ACE),Sigma公司。

    1.1.2 儀器和設備

    HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司;V-1200型可見光分光光度計:上海美譜達儀器有限公司; SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵:鄭州長城科工貿(mào)有限公司;ML-902型磁力攪拌器:上海浦江分析儀器廠;TDL-5-A型臺式離心機:上海安亭科學儀器廠;868型pH計:Orion Research公司;KQ-250E型超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;TE601-L型,BS110S型電子天平:北京賽多科斯天平有限公司;EasySepTM-1010型高效液相色譜儀:上海通微分析技術有限公司;CM-SephadexC-25陽離子交換柱:上海賀寶化工有限公司;BS-100A型自動部分收集器:上海滬西分析儀器廠。

    1.2 方法

    1.2.1 茶粕酶解物的制備

    將底物濃度為2.5%的茶粕置于250mL三角瓶中,采用表1的處理方法進行酶解,水解在恒溫水浴振蕩器中進行。反應結束后,將反應體系在85℃下加熱使酶失活。

    1.2.2 茶粕酶解物的分離純化

    1.2.2.1 離心和微濾

    酶解液經(jīng)過離心機4000r.min-1離心10min,收集上清液;將上清液經(jīng)過膜孔徑為0.2um的無機膜微濾,收集濾液供后續(xù)分離操作。

    1.2.2.2 離子交換層析初步分離

    陽離子交換樹脂預處理參照趙永芳[9]方法,采用濕法填柱。

    將濾液(經(jīng)過透析除鹽)20mL上樣至CMSephadexC-25陽離子層析柱,分離條件為:凝膠柱φ1.6×15cm,洗脫液0.02mol.L-1pH3.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和1mol.L-1氯化鈉溶液,氯化鈉線性洗脫梯度0~ mol.L-1,流速為0.5mL.min-1,每管收集時間為10mL,檢測波長為220nm。

    1.2.2.3 RP-HPLC分離純化

    [10]并略作改動。將經(jīng)離子交換層析分離的組分凍干,適當稀釋后采用RP-HPLC進一步分離。色譜條件:色譜柱EasySepTMC18 分析型色譜柱(5um4.6?250mm),檢測波長220nm,柱溫25℃;流速1mL.min-1;洗脫條件:0~5min,100%A;5~20min,100%A~60%A;20~30min,60%A~100%B;30~50min,100%B(A:0.05%TFA+5%乙腈,B:80%乙睛+0.05%TFA)。收集各組分峰,重復進樣,收集多次,冷凍干燥,并測定每個組分峰的ACE抑制活性。經(jīng) RP-HPLC一次制備的具有最高ACE抑制活性的組分再次進行二次純化。

    1.2.3 茶粕酶解物水解度的測定

    參考文獻甲醛滴定法[8]

    1.2.4 ACE抑制活性的測定

    ACE抑制率根據(jù)參考文獻[11]和[12]的方法測定,ACE半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定參考文獻[13]。

    2 結果與分析

    2.1 酶解時間與ACE抑制率的關系

    5種蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率和水解度隨酶解時間的變化趨勢見圖1。

    從圖1可以看出,水解度隨著時間的延長而增大,符合酶解的一般規(guī)律;但是,茶粕酶解物的ACE抑制率并不隨時間增加而增大,除蛋白酶C外,其余四種蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率隨酶解時間的延長呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。原因可能是:隨著酶解時間的延長,原來酶解出的具有ACE抑制活性的物質被進一步酶解,酶解物的端基和肽鏈長度等發(fā)生了變化,使得之前酶解出的物質失去了原有的ACE抑制活性,所以,ACE抑制活性不會隨著氨基氮含量呈先增加后穩(wěn)定的趨勢變化。從圖中還可以看出,不同酶解時間所獲得的茶粕酶解物都體現(xiàn)出一定的ACE抑制活性,即存在著多種ACE活性抑制物質。這一現(xiàn)象與吳建平等人的報道基本一致[14],即ACE是一類專一性相對較弱的酶,在蛋白質經(jīng)酶解后的酶解物中,存在著多種ACE抑制活性物質,這些ACE抑制活性物質并非是簡單的或有或無。

    2.2 不同蛋白酶酶解的茶粕酶解物ACE抑制率的對比分析

    由圖2可知,沒有經(jīng)過酶解的茶粕提取液就存在74.5%的ACE抑制率,說明茶粕提取液本身就含有一定的ACE抑制活性物質。茶粕經(jīng)蛋白酶酶解后,抑制率均有所提高,最高提高了27%,說明酶解液中有ACE抑制活性物質的存在。五種酶水解后的ACE抑制活性大小依次為:蛋白酶A>蛋白酶D>蛋白酶E>蛋白酶C>蛋白酶B;從氨基氮含量來看,蛋白酶C水解后氨基氮含量最高。相比之下,其他酶解液的氨基氮含量偏低,尤其蛋白酶D,其氨基氮含量只有0.037mg.mL-1,但抑制率就高達92.8%。

    ACE抑制肽大約包含2~12個氨基酸殘基,有研究表明分子質量小利于肽在體內的吸收利用,但也有極個別的由27個氨基酸組成的降血壓肽被發(fā)現(xiàn)。降血壓肽的抑制活性與其氨基酸結構和組成密切相關。經(jīng)研究認為ACE抑制肽的抑制活性主要取決于C端氨基酸, C端氨基酸為芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸)時,其抑制活性較高。而且,C端殘基上帶正電荷的氨基酸的存在可以顯著增強降壓肽的抑制活性,如精氨酸(胍基)。此外,ACE抑制肽的疏水性也是影響其活性的重要因素,高親水性使其無法接近ACE活性部位而導致弱或無活性。這些對ACE抑制肽的結構分析還局限于對已知氨基酸序列的肽進行定性的分析,許多肽并不符合這些研究結果,確切的構效關系模型至今仍未建立,有待進一步的研究[1,15]。

    蛋白酶B、C氨基氮含量高,但ACE抑制率偏低,這可能與這兩種酶是具有內切蛋白酶和外切蛋白酶兩種活性酶有關。內切酶和外切酶同時存在于一個酶解反應體系時,對增加酶解物中氨基酸的量和改善酶蛋白多肽的風味有好處,但可能不利于制備功能活性物質[16]。

    蛋白酶A、蛋白酶D和蛋白酶E酶解液的ACE抑制率均很高是由于這些酶的酶切位點均含有芳香族的氨基酸,這些氨基酸都具有ACE抑制活性。例如:蛋白酶D酶切位點所形成的氨基酸殘基中苯丙氨酸、色氨酸均是ACE抑制肽的端基組成,并且酶切后形成的丙氨酸殘基是疏水性氨基酸,酪氨酸殘基是帶正電荷的氨基酸殘基,這都有利于增強ACE抑制的活性,所以蛋白酶D酶解后的茶粕酶解物ACE抑制性很高。

    2.3 茶粕酶解物的分離純化

    2.3.1 離子交換層析分離茶粕酶解物

    茶粕經(jīng)蛋白酶酶解的產(chǎn)物經(jīng)CM-SephadexC-25陽離子交換層析分離的色譜見圖3。從圖3中可以看出分離結果只有一個峰A,其220nm的吸光值為0.409。

    2.3.2 RP-HPLC分離純化組分A

    將CM-SephadexC-25陽離子交換層析分離得到的A組分進行RP-HPLC進一步分離,分離結果見圖4。組分A經(jīng)RP-HPLC分離得到6個分離組分,分別標記為:A-1、A-2、A-3、A-4、A-5和A-6。測定各分離組分ACE抑制率見表2。

    表2 RP-HPLC各分離組分的ACE抑制率

    根據(jù)表2結果,組分A-2的ACE抑制率最高。將組分A-2進行RP-HPLC二次純化,結果見圖5。由圖5可知,組分A-2基本達到色譜純。

    3 結論

    5種蛋白酶(蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D和蛋白酶E)酶解后的茶粕酶解物ACE抑制率和氨基氮含量隨酶解時間的變化規(guī)律為:氨基氮含量隨酶解時間呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的變化趨勢,而酶解產(chǎn)物的ACE抑制率并沒有隨氨基氮含量的增加而增加;除了蛋白酶C外,其他4種蛋白酶的酶解液ACE抑制率都是隨著時間的延長呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢,蛋白酶C的酶解產(chǎn)物則是隨時間呈現(xiàn)波動變化。5種蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制活性大小依次為:蛋白酶A>蛋白酶D>蛋白酶E>蛋白酶C>蛋白酶B。其中,經(jīng)蛋白酶A水解后的酶解產(chǎn)物ACE抑制率最高,達到94.4%,對應的氨基氮含量為0.048mg.mL-1。

    采用CM-SephadexC-25陽離子交換色譜和RPHPLC純化經(jīng)蛋白酶A酶解的茶粕酶解物。由CMSephadexC-25陽離子交換色譜分離得到一個組分A,通過RP-HPLC進一步分離組分A得到6個組分。對ACE抑制率最高的組分A-2 進行RP-HPLC二次純化,分離圖譜為單峰,說明該分離組分達到色譜純,其半數(shù)抑制濃度(IC50) 為98μg.mL-1。

    參考文獻:

    [1]孫勤, 陳季旺, 夏文水.食品蛋白源ACE抑制肽的生理和生化性質[J].武漢工業(yè)學院學報, 2009, 38(1):27~30.

    [2]王莉, 徐懷德, 王興, 等.堿性蛋白酶酶解魔芋飛粉制備ACE抑制肽研究[J].中國食品學報, 2010, 10(01): 42-47.

    [3]VERCRUYSS E L, SMAGGH E G, MAT S T, et al.Purification and identification of all angiotens in N converting enzyme(ACE)inhibitory peptide from the gastrointestinal hydrolysate of the cotton leafworm, Spodopter a littoralis[J].Proc Biochem, 2008(43): 900-904.

    [4]ZHIPENG Y, YONGGUANG Y, WENZHU Z, et al.Novel peptides derived from egg white protein inhibiting alphaglucosidase [J].Food Chemistry, 2011(129): 1376-1382.

    [5]馬麗麗.N+注入選育產(chǎn)ACE抑制的保加利亞乳桿菌[D].合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學,2010.

    [6]Li-Hua Chiu, Guoo-Shyng W, HSU, et al.Antihypertensive capacity of defatted soft-shelled turtle power after hydrolysis by gastrointestinal enzymes[J].Journal of food biochemistry,2006 (30): 589-603.

    [7]國家統(tǒng)計局.中國統(tǒng)計摘要[M].北京: 中國統(tǒng)計出版社, 1993:67.

    [8]徐英操, 劉春紅.蛋白質水解度測定方法綜述[J].食品研究與開發(fā), 2007,(07): 173~175.

    [9]趙永芳.生物化學技術原理及其應用[M].武漢: 武漢大學出版社, 1999:99-101.

    [10]管驍, 劉靜, 王立, 等.高活性燕麥蛋白源 ACE抑制肽的制備、純化及結構鑒定[J].高等學?;瘜W學報, 2009,30(10):1992~1997.

    [11]CUSHMAN D W,CHEUNGH S.Spectrophotometric assay and prop-erties of the angiotensin-I-converting enzyme of rabbitlung[J].Bio-chemical Pharmacology, 1971, 20: 1637-1648.

    [12]徐榕榕, 陶冠軍, 李進偉, 等.高效液相色譜測定血管緊張素轉換酶抑制肽的活性[J].河南工業(yè)大學學報: 自然科學版 , 2005,(04): 18~21.

    [13]李勇.蠶腎ACE抑制肽的制備及其ACE抑制活性的研究[D].南京:西南大學, 2012.

    [14]吳建平, 丁霄霖.大豆降壓肽的研制(Ⅰ)——生產(chǎn)高活性ACE抑制肽酶系的篩選[J].中國油脂, 1998, (02): 49~51.

    [15]Jiwang Chen, Yimei Wang, Qixin Zhong, et al.Purification and characterization of a novel angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptide derived from enzymatic hydrolysate of grass carp protein[J].Peptides, 2012, 33(01):52-58.

    [16]汪濤, 曾慶祝, 謝智芬.內肽酶與端肽酶水解扇貝邊蛋白質工藝的研究[J].大連水產(chǎn)學院學報, 2003, (02): 125~129.

    Q555

    A

    1007-550X(2016)01-0043-05

    10.3969/j.issn.1007-550X.2016.01.001

    2015-11-24

    高剛峰(1964-),男,高級工程師。

    猜你喜歡
    解物抑制率蛋白酶
    中藥單體對黃嘌呤氧化酶的抑制作用
    黑龍江科學(2023年8期)2023-06-04 08:40:58
    血栓彈力圖評估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
    思鄉(xiāng)與蛋白酶
    文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:30
    麥芽蛋白質組成分析及其酶解物ACE抑制活性
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:28
    日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
    貽貝的可控酶解及其酶解液的抗氧化活性
    制革下腳料酶解物對番茄生長的影響
    長江蔬菜(2016年10期)2016-12-01 03:05:36
    多胚蛋白酶 高效養(yǎng)畜禽
    IgA蛋白酶在IgA腎病治療中的潛在價值
    冷卻豬肉中產(chǎn)蛋白酶腐敗菌的分離鑒定
    真人做人爱边吃奶动态| 午夜精品国产一区二区电影| 一级片免费观看大全| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产成人精品无人区| 亚洲精品美女久久av网站| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 在线观看舔阴道视频| 久热爱精品视频在线9| 女性生殖器流出的白浆| 久久国产精品影院| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲天堂av无毛| 国产精品二区激情视频| 成年av动漫网址| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产日韩欧美亚洲二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美人与性动交α欧美软件| 啦啦啦在线免费观看视频4| www.精华液| 国产亚洲欧美精品永久| 啦啦啦 在线观看视频| 91字幕亚洲| 久久影院123| 爱豆传媒免费全集在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成人影院久久av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产有黄有色有爽视频| 青春草亚洲视频在线观看| 麻豆av在线久日| 啦啦啦啦在线视频资源| 91大片在线观看| 满18在线观看网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久久久久久久免费视频了| 精品国产国语对白av| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品亚洲成国产av| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产xxxxx性猛交| 一级毛片精品| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日本av免费视频播放| 亚洲国产成人一精品久久久| 青春草亚洲视频在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久精品区二区三区| 一区在线观看完整版| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 午夜福利,免费看| 男女午夜视频在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 丝袜脚勾引网站| 曰老女人黄片| 亚洲成人手机| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲熟女精品中文字幕| 51午夜福利影视在线观看| 1024香蕉在线观看| 自线自在国产av| 午夜91福利影院| 日本黄色日本黄色录像| 精品少妇内射三级| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产极品粉嫩免费观看在线| 69精品国产乱码久久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲精品美女久久av网站| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 操美女的视频在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| av在线老鸭窝| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲专区国产一区二区| 高清欧美精品videossex| 久久99热这里只频精品6学生| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| www.熟女人妻精品国产| 精品一区二区三区四区五区乱码| 黄色片一级片一级黄色片| 天天操日日干夜夜撸| 永久免费av网站大全| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久中文看片网| 国产野战对白在线观看| 不卡一级毛片| 婷婷丁香在线五月| 最近中文字幕2019免费版| 少妇 在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 日韩制服骚丝袜av| 国产麻豆69| 老鸭窝网址在线观看| 麻豆国产av国片精品| 男人操女人黄网站| 日韩欧美免费精品| 国产精品九九99| 国产淫语在线视频| 精品一区二区三卡| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲国产av新网站| 久久久久国内视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 极品少妇高潮喷水抽搐| 老司机深夜福利视频在线观看 | 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 99国产精品免费福利视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 中文字幕制服av| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品一二三区在线看| 国产精品1区2区在线观看. | 欧美国产精品一级二级三级| 欧美激情极品国产一区二区三区| 性色av一级| 亚洲五月色婷婷综合| 热re99久久国产66热| 国产精品免费大片| 国产精品成人在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美中文综合在线视频| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日韩欧美免费精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 窝窝影院91人妻| 亚洲免费av在线视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产在线观看jvid| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 免费在线观看影片大全网站| 悠悠久久av| 黄片小视频在线播放| 成在线人永久免费视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲人成电影观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 精品人妻在线不人妻| 精品一区二区三卡| 99re6热这里在线精品视频| 永久免费av网站大全| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 老司机影院成人| 91字幕亚洲| 日本精品一区二区三区蜜桃| 天天添夜夜摸| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美一级毛片孕妇| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 夫妻午夜视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 五月天丁香电影| 欧美日韩亚洲高清精品| videos熟女内射| 两个人免费观看高清视频| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 国产97色在线日韩免费| 日韩高清综合在线| 国产黄a三级三级三级人| 99热只有精品国产| 99热只有精品国产| 麻豆国产97在线/欧美 | 国产高清有码在线观看视频 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久这里只有精品中国| 久久久久久免费高清国产稀缺| av福利片在线观看| 99热这里只有是精品50| 久久久久精品国产欧美久久久| 人成视频在线观看免费观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 脱女人内裤的视频| 欧美极品一区二区三区四区| 黄色片一级片一级黄色片| 制服诱惑二区| 一进一出抽搐动态| 日韩大码丰满熟妇| 两性夫妻黄色片| 91国产中文字幕| 麻豆国产av国片精品| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美久久黑人一区二区| 手机成人av网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品,欧美在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 美女午夜性视频免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| www日本黄色视频网| 91麻豆精品激情在线观看国产| 成在线人永久免费视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产精品,欧美在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久精品影院6| 长腿黑丝高跟| 男女床上黄色一级片免费看| 九九热线精品视视频播放| 黄色视频,在线免费观看| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 嫩草影院精品99| 90打野战视频偷拍视频| 一级片免费观看大全| 露出奶头的视频| 一夜夜www| 欧美乱妇无乱码| 亚洲avbb在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| svipshipincom国产片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品第一国产精品| 日韩欧美在线乱码| 亚洲午夜理论影院| 免费观看精品视频网站| 国产69精品久久久久777片 | 天天添夜夜摸| АⅤ资源中文在线天堂| 成人国产综合亚洲| 久久国产精品人妻蜜桃| 老司机福利观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 桃红色精品国产亚洲av| 男女视频在线观看网站免费 | 老司机福利观看| xxxwww97欧美| 欧美3d第一页| 国产69精品久久久久777片 | 午夜福利在线观看吧| 日韩欧美免费精品| 亚洲国产欧美一区二区综合| 舔av片在线| 深夜精品福利| 黄色视频,在线免费观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲中文av在线| 性色av乱码一区二区三区2| 久久久久国内视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 香蕉av资源在线| 1024视频免费在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国内精品久久久久久久电影| 两人在一起打扑克的视频| 国产片内射在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产成人精品久久二区二区免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 韩国av一区二区三区四区| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 麻豆成人av在线观看| 国产爱豆传媒在线观看 | 精品免费久久久久久久清纯| 久久亚洲真实| 三级毛片av免费| 制服人妻中文乱码| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品久久久久久久电影 | 久久中文看片网| 亚洲国产欧美人成| 精品国产美女av久久久久小说| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲国产看品久久| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲18禁久久av| 哪里可以看免费的av片| 午夜免费激情av| 久久久久久久久免费视频了| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 搡老岳熟女国产| 国产午夜精品久久久久久| 久久久久久久久久黄片| 亚洲精品色激情综合| 国产伦人伦偷精品视频| 我要搜黄色片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 午夜两性在线视频| www日本在线高清视频| 久久久久久人人人人人| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲人成电影免费在线| 最新美女视频免费是黄的| 黑人操中国人逼视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲,欧美精品.| 嫩草影院精品99| 操出白浆在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲成人精品中文字幕电影| 一夜夜www| svipshipincom国产片| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美成人午夜精品| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美成人性av电影在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 91麻豆av在线| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲电影在线观看av| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲性夜色夜夜综合| 国内精品久久久久久久电影| 99热这里只有是精品50| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 色综合亚洲欧美另类图片| av有码第一页| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久草成人影院| 一本精品99久久精品77| 欧美性长视频在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 国产欧美日韩一区二区三| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 此物有八面人人有两片| 老鸭窝网址在线观看| 国内精品久久久久精免费| 亚洲自拍偷在线| 黄片大片在线免费观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 白带黄色成豆腐渣| 国产成人系列免费观看| 91成年电影在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产午夜精品论理片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精华一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩欧美国产一区二区入口| 18禁美女被吸乳视频| 欧美中文综合在线视频| 国产99白浆流出| 视频区欧美日本亚洲| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一本大道久久a久久精品| 久久这里只有精品中国| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品国内亚洲2022精品成人| 精品人妻1区二区| 免费看十八禁软件| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 黄频高清免费视频| 欧美大码av| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产成人啪精品午夜网站| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜亚洲福利在线播放| 精品久久久久久久久久久久久| www日本在线高清视频| 99热只有精品国产| 久久久久性生活片| 老司机深夜福利视频在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 国内精品久久久久久久电影| 国内精品一区二区在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 免费看日本二区| av天堂在线播放| 俺也久久电影网| 亚洲午夜理论影院| 91麻豆精品激情在线观看国产| 两人在一起打扑克的视频| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 男人的好看免费观看在线视频 | 少妇粗大呻吟视频| 国产欧美日韩一区二区三| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美日韩精品网址| 国产av不卡久久| www.熟女人妻精品国产| 在线观看免费视频日本深夜| 久久久久久久久久黄片| aaaaa片日本免费| 欧美精品亚洲一区二区| 免费电影在线观看免费观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久国产精品影院| 天堂√8在线中文| 在线观看免费午夜福利视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 午夜a级毛片| 久9热在线精品视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 身体一侧抽搐| 少妇的丰满在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产午夜精品论理片| 男女床上黄色一级片免费看| 少妇的丰满在线观看| 亚洲全国av大片| 亚洲五月天丁香| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99热这里只有是精品50| 国产精品免费一区二区三区在线| 在线看三级毛片| 日本熟妇午夜| 亚洲人成77777在线视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产又色又爽无遮挡免费看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 悠悠久久av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 人妻久久中文字幕网| 欧美又色又爽又黄视频| 一本久久中文字幕| 特级一级黄色大片| 长腿黑丝高跟| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日韩欧美国产一区二区入口| 十八禁人妻一区二区| 国产精品乱码一区二三区的特点| www.999成人在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 特级一级黄色大片| 亚洲国产欧美人成| 久久久精品大字幕| 草草在线视频免费看| 免费在线观看亚洲国产| 午夜激情av网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中出人妻视频一区二区| 三级国产精品欧美在线观看 | 亚洲美女视频黄频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品乱码久久久久久99久播| 最新在线观看一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日本在线视频免费播放| 午夜福利18| 三级毛片av免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 男女之事视频高清在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 日本 欧美在线| 久久精品国产综合久久久| 在线免费观看的www视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 黄片大片在线免费观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲九九香蕉| 日日夜夜操网爽| 国产欧美日韩一区二区三| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲自拍偷在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日韩欧美免费精品| 99国产精品99久久久久| 十八禁网站免费在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美黑人精品巨大| 午夜成年电影在线免费观看| 色在线成人网| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 婷婷精品国产亚洲av在线| 在线观看日韩欧美| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 人成视频在线观看免费观看| 99国产精品一区二区三区| 中文字幕熟女人妻在线| 久久久久久久久中文| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| www国产在线视频色| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 在线观看免费日韩欧美大片| 妹子高潮喷水视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美日韩精品网址| 69av精品久久久久久| 国产伦一二天堂av在线观看| 极品教师在线免费播放| 人人妻人人看人人澡| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产激情欧美一区二区| 亚洲av成人av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品一区二区三区四区久久| 特大巨黑吊av在线直播| 丰满的人妻完整版| www.熟女人妻精品国产| 精品国产美女av久久久久小说| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品av视频在线免费观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 色在线成人网| 亚洲免费av在线视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩有码中文字幕| 亚洲专区中文字幕在线| 日本一二三区视频观看| 国产午夜福利久久久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 老司机在亚洲福利影院| 日韩av在线大香蕉| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 最近最新中文字幕大全免费视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 精品乱码久久久久久99久播| 成年女人毛片免费观看观看9| 美女大奶头视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产成人系列免费观看| 成年免费大片在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 三级毛片av免费| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产单亲对白刺激| 精品久久久久久,| 国产单亲对白刺激| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 日本三级黄在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 黄色毛片三级朝国网站| 免费观看人在逋| 午夜激情av网站| 久久九九热精品免费| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 男女下面进入的视频免费午夜| 观看免费一级毛片| 久久久久久久午夜电影| 香蕉久久夜色| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产午夜福利久久久久久| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产不卡一卡二| 两个人看的免费小视频| 淫秽高清视频在线观看| 精品福利观看| 久99久视频精品免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 中国美女看黄片| 亚洲专区中文字幕在线| 中出人妻视频一区二区| 日韩欧美三级三区| svipshipincom国产片| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| a在线观看视频网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 成人亚洲精品av一区二区| www.999成人在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 国产av一区在线观看免费|