基于羅丹明B和金納米粒子熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測卡托普利

田 銳， 薛李慧， 馬 晨， 王靖原， 孫雪花， 欒建明， 李曉江

(1.延安大學(xué)化工學(xué)院，陜西延安 716000；2.延安市實驗中學(xué)，陜西延安 716000)

卡托普利(Captopril)是第一代口服血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，臨床上廣泛用于治療各種高血壓、冠心病等，然而當(dāng)卡托普利用量過大時，會導(dǎo)致腎臟損害、循環(huán)系統(tǒng)衰竭等癥狀[1,2]，因此，建立準確、靈敏測定卡托普利含量的方法對指導(dǎo)臨床用藥有著重要的意義。目前，測定卡托普利的方法主要有高效液相色譜法[3 - 5]、化學(xué)發(fā)光法[6]、光度法[7]、原子吸收法[8]、流動注射分析法[9]和電泳法[10]等。但這些方法或需要昂貴的儀器、或操作繁瑣，制約了它們的應(yīng)用。

近年來，金納米粒子(Gold Nanoparticles,AuNPs)因其制備簡單、生物兼容性好、催化活性高，尤其是良好的光學(xué)性質(zhì)而得到廣泛應(yīng)用[11]。基于分散態(tài)AuNPs對鄰近熒光基團(如熒光染料)熒光猝滅的熒光分析法被廣泛用于DNA、藥物、金屬離子等[12 - 14]的分析。本研究建立了一種基于羅丹明B(RhB)與AuNPs熒光共振能量轉(zhuǎn)移測定卡托普利的熒光分析新方法，用于卡托普利藥片中卡托普利含量的測定，取得了滿意結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-7000型熒光分光光度計(日本，日立公司)；JEM-2100型透射電鏡(日本，日立公司)；TU1901 紫外-可見分光光度計(普析光學(xué)儀器有限公司)；5804R型高速離心機(德國，艾本德股份公司)。

卡托普利標準溶液(4.6×10-3mol/L)：準確稱取卡托普利標準品(含量99.5%，上海江萊生物科技有限公司)25 mg，用超純水溶解后定容于25 mL的容量瓶中，使用時逐級稀釋。羅丹明B標準儲備溶液(1.0×10-4mol/L)：準確稱取47.9 mg羅丹明B(分析純，西安化學(xué)試劑廠)，用超純水溶解后，定容于100 mL 容量瓶中。氯金酸(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸三鈉(分析純，西安化學(xué)試劑廠)。實驗用水均為超純水。

卡托普利藥片(25 mg/tablet，上海普康藥業(yè)有限公司，山西津華暉星制藥有限公司)。

1.2 實驗原理

以檸檬酸鈉還原氯金酸得到的AuNPs被檸檬酸根保護，表面帶負電荷，通過靜電排斥作用使其保持穩(wěn)定[16]。將AuNPs與RhB混合后，RhB分子可通過靜電作用吸附在AuNPs表面，此時，由于AuNPs對RhB的熒光猝滅作用使體系呈現(xiàn)弱熒光；加入卡托普利后，卡托普利分子巰基上的S原子可與納米金形成穩(wěn)定的Au-S鍵而置換出RhB，使RhB遠離AuNPs恢復(fù)其熒光，體系熒光增強。據(jù)此，通過測定加入不同濃度卡托普利后AuNPs-RhB體系熒光信號的變化，可以對卡托普利進行定量分析?？ㄍ衅绽臒晒鉁y定機理見圖1。

圖1 卡托普利的熒光測定機理Fig.1 Schematic diagram showing the mechanism for catopril detection

1.3 實驗方法

1.3.1AuNPs的制備AuNPs按文獻方法[15]進行制備。具體步驟為：將50 mL 1 mmol/L的氯金酸加入到100 mL圓底燒瓶中攪拌、加熱，待溶液開始回流后快速向其中加入5 mL 38.8 mmol/L檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)回流15 min后停止加熱，待溶液冷卻后用0.45 μm濾膜過濾，濾液置于棕色試劑瓶中，于4 ℃ 保存。

1.3.2實驗方法取2.0 mL AuNPs溶液于4 mL離心管中，加入1.0 mL 1.0×10-5mol/L RhB溶液，搖勻，靜態(tài)吸附1 h后，于10 000 r/min高速離心10 min，用移液槍小心移去上清液，往沉淀中加入2 mL超純水洗滌、離心、棄去上清液，然后加入2 mL超純水重新分散后定量轉(zhuǎn)移入10 mL棕色容量瓶，適當(dāng)稀釋后加入2 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，最后用超純水定容，得AuNPs-RhB測定液。分別取900 μL測定液于一系列離心管中，然后依次往其中加入100 μL 超純水、卡托普利標準品或樣品溶液，放置反應(yīng)1 h 后，在熒光分光光度計上測定背景(FB)和樣品(FS)熒光信號，根據(jù)樣品和背景的信號差△F(△F=FS-FB)測定卡托普利含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs的表征及實驗機理驗證

圖2 納米金的吸收光譜圖(內(nèi)插圖為TEM圖)Fig.2 Absorption spectra of AuNPs(inset:TEM photogrph of AuNPs )

為了確定所制備AuNPs的尺寸和形貌，分別測了其透射電鏡(TEM)和吸收光譜，結(jié)果如圖2所示。圖2顯示合成的AuNPs在520 nm有強吸收，表明AuNPs直徑為13 nm左右且無團聚[16]，由TEM結(jié)果可見AuNPs粒徑均一分散性良好。

為了驗證我們提出的實驗機理，實驗分別對AuNPs、AuNPs-RhB、AuNPs-RhB-卡托普利的吸收光譜及熒光光譜進行了掃描，結(jié)果如圖3所示。由圖3(A)可見，加入羅丹明B及卡托普利后納米金的吸收光譜沒有發(fā)生變化，表面羅丹明B和卡托普利的加入沒有引起納米金的團聚。圖3(B)為RhB及加入卡托普利前后AuNPs-RhB體系的熒光光譜，圖中曲線a、b、c的峰形及最大發(fā)射波長一致，表明AuNPs、卡托普利沒有與RhB作用生成新物質(zhì)。但比較曲線b、c可發(fā)現(xiàn)加入卡托普利后體系的熒光信號明顯增強，這是由于加入卡托普利后，卡托普利可通過其分子中巰基S原子與AuNPs形成穩(wěn)定的Au-S共價鍵而置換出RhB使其遠離AuNPs，減小AuNPs對其熒光的猝滅作用，從而使體系熒光強度增強。以上結(jié)果都證明了我們提出的機理，即體系熒光信號的變化是由于AuNPs對RhB熒光的猝滅作用及卡托普利對RhB的置換作用。

圖3 吸收光譜及熒光光譜Fig.3 Absorption and fluorescence spectra(A) Absorption spectrum(a.AuNPs;b.AuNPs-RhB;c.AuNPs-RhB-catopril;d.rhodamin B);(B) Flurescence spectrum(a.RhB;b.AuNPs-RhB-catopril;c.AuNPs-RhB).

2.2 分析條件的選擇

圖4 pH對測定體系熒光信號變化的影響Fig.4 Effect of pH on the change of fluorescence intensity

2.2.1溶液pH的選定溶液pH是影響分析檢測的重要因素，它不僅影響AuNPs和卡托普利在溶液中的存在形式，也影響Au-S鍵形成后體系的穩(wěn)定性。實驗對4.0～10.0范圍內(nèi)不同pH值對測定的影響進行了考察，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，不同pH值加入卡托普利后體系熒光增加值△F不同，當(dāng)體系pH為6.0時△F達到最大。這可能是由于：pH值過低時，一方面RhB質(zhì)子化程度高使其與AuNPs的吸附作用增強，不利于RhB從AuNPs表面脫落；另一方面，卡托普利分子中的巰基也可能質(zhì)子化使Au-S鍵不易形成，不能有效從AuNPs表面置換RhB。而當(dāng)pH過高時，卡托普利分子中的羧基可能去質(zhì)子化形成-COO-，-COO-與帶負電荷的AuNPs之間的靜電排斥作用增強，不利于卡托普利在AuNPs表面的吸附，RhB會自發(fā)從AuNPs表面脫落，背景信號增大。

此外，實驗還考察了緩沖液組成及濃度對測定影響。分別將pH為6.0的等濃度的磷酸鹽、Tris-HCl、乙酸-乙酸鈉和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液加入到AuNPs-RhB體系中；測定加入卡托普利后體系的熒光變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中體系最穩(wěn)定且信噪比高；改變緩沖溶液濃度，發(fā)現(xiàn)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液濃度為5 mmol/L時測定結(jié)果最佳，故實驗選擇加入pH=6.0的濃度為5 mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖來控制體系pH。

圖5 不同卡托普利濃度下測定體系熒光光譜(內(nèi)插圖為標準曲線)Fig.5 Fluorescence spectra of AuNPs-RhB in different concentrations of catopril(inset:linearity curve) from bottom to top:0,9.2,23,46,92,125,148,184×10-8 mol/L of captopril.

2.2.2反應(yīng)時間的選定取20.0 mL AuNPs-RhB溶液，加入500 μL 4.6×10-4mol/L的卡托普利標準溶液在室溫下進行反應(yīng)，每隔一定時間從反應(yīng)體系中取出1.0 mL測定其熒光。結(jié)果表明，1 h內(nèi)△F快速增大，此后△F增加緩慢，12 h后熒光信號不再增加。結(jié)合考慮測定靈敏度和實驗效率選擇反應(yīng)時間為1 h。

2.2.3AuNPs和RhB濃度的選擇AuNPs和RhB的濃度直接影響測定的靈敏度，由于游離RhB自身有很強的熒光，如果其濃度太高，會使背景信號增大；反之，若RhB濃度太低，則其在AuNPs表面吸附量不夠，加入卡托普利后不能與其發(fā)生有效置換，使測定靈敏度降低。因此，只有在二者之間的平衡態(tài)時，測定才最靈敏，為此實驗考察了AuNPs和RhB的濃度對測定結(jié)果的影響。實驗中我們將一定量AuNPs與足夠量的RhB混合作用后，通過離心洗滌除去過量的羅丹明B，然后將得到的AuNPs-RhB體系稀釋一定倍數(shù)后進行測定，結(jié)果顯示AuNPs與RhB(1.0×10-5mol/L)按體積比2∶1混合作用，稀釋5倍后測定靈敏度最高。

2.3 標準曲線及檢出限

優(yōu)化實驗條件下，對卡托普利進行測定，結(jié)果表明在9.2×10-8～1.8×10-6mol/L濃度范圍內(nèi)體系的△F與卡托普利的濃度呈良好的線性關(guān)系(圖5)，線性方程為:△F=2.4728c-1.0515，相關(guān)系數(shù)r=0.9929，檢出限為6.9×10-8mol/L。優(yōu)化的實驗條件下，對2.3×10-7mol/L卡托普利標準溶液平行測定，其相對標準偏差為1.32%(n=11)。

2.4 干擾的測定

在優(yōu)化的實驗條件下，考察了可能存在的添加劑對卡托普利測定的影響，結(jié)果表明：控制相對誤差在±5%以內(nèi)時，同濃度的葡萄糖、抗壞血酸、糊精、乳糖、蔗糖、淀粉，20倍的Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe3+均無干擾。因此藥物中常用的助劑、添加劑及一些常見金屬離子對卡托普利的測定無影響。

2.5 樣品測定

隨機抽取10片卡托普利藥片，研細混勻后準確稱取適量(相當(dāng)于卡托普利25 mg)，加入去離子水溶解后，轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中定容、靜置，依次用濾紙和0.45 μm濾膜過濾，按實驗方法測定。測定結(jié)果表明該法測得的卡托普利含量與藥品的標示量基本一致。為了進一步驗證方法的準確性，采用標準加入法測定了樣品的回收率，測得回收率在96.5%～106.5%之間，表明該法用于卡托普利片劑中卡托普利含量的測定結(jié)果準確。

表1 樣品及回收率測定(n=3)

3 結(jié)論

在羅丹明B與納米金粒子的混合體系中，金納米粒子可通過靜電作用與羅丹明B結(jié)合，使其熒光猝滅，加入卡托普利后，金納米粒子與卡托普利形成穩(wěn)定Au-S鍵而置換出羅丹明B，使羅丹明B遠離金納米粒子而恢復(fù)其熒光。據(jù)此建立了羅丹明B金納米粒子熒光共振能量轉(zhuǎn)移測定卡托普利的熒光分析新方法，該方法能夠快速、靈敏的用于藥物中卡托普利含量的檢測。