環(huán)糊精修飾毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜同時(shí)分離檢測橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體

孫照霞， 蘇 慧， 叢日琳,2， 徐 偉， 褚克丹， 余麗雙*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122;2.榮成市中醫(yī)院，山東威海 264300)

橙皮苷(Hesperidin)和柚皮苷(Naringin)均屬于黃酮類化合物，在C-2位存在手性中心，具有旋光性，廣泛存在于蕓香科柑橘屬植物的果肉和果皮中，在臨床上具有抗炎[1]、抗癌[2]、抗氧化[3]、神經(jīng)保護(hù)[4]、改善糖尿病[5]等多種生理活性，具有較高的藥用價(jià)值。目前，文獻(xiàn)報(bào)道橙皮苷或柚皮苷對(duì)映體拆分方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6,7]和毛細(xì)管電泳法(CE)[8 - 13]。相較于HPLC，CE具有分離能力強(qiáng)，快速，樣品、溶劑和手性選擇劑用量少，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，可選擇和改變的手性選擇劑種類多等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于手性拆分。采用環(huán)糊精修飾手性毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法(CD-MEKC)，如CE中添加環(huán)糊精和膽酸鹽雙手性選擇劑，可提高CE手性拆分能力[14,15]。但未見利用CD-MEKC同時(shí)分離檢測橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體的報(bào)道。

本文采用羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD修飾手性膠束毛細(xì)管電動(dòng)色譜法同時(shí)分離檢測橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體。在優(yōu)化分離條件下，橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體在9 min內(nèi)得到完全分離，將該方法應(yīng)用于中藥制劑胃蘇顆粒中橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體的測定，回收率為86.0%～113.2%。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(美國，Beckman Coulter公司)，附二極管陳列檢測器(DAD)；未涂層熔融石英毛細(xì)管(63.5 cm×75 μm i.d.,有效長度52 cm，美國Beckman coulter公司)；雷磁pHS-3C型精密酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；XS105電子分析天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):110721-201014，中國藥品生物制品檢定所)；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110722-200309，中國藥品生物制品檢定所)。膽酸鈉(SC，北京百靈威科技有限公司)；羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD，美國 SIGMA-ALDRICH)；硼砂、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為分析純，所用水為Milli-Q超純水。

胃蘇顆粒(批號(hào)：12031101，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán))。

1.2 對(duì)照品及供試品溶液配制

精密稱取橙皮苷和柚皮苷的對(duì)照品，分別用甲醇溶解配成濃度為1 mg/mL的溶液，冷藏備用，使用時(shí)用超純水稀釋成所需濃度即可。精密稱取研細(xì)的胃蘇顆粒藥品粉末2 g，置于具塞錐形瓶中，用20 mL甲醇超聲提取30 min，靜置，過濾，殘?jiān)ㄔ俨僮饕淮危喜纱螢V液，水浴濃縮至3～4 mL，甲醇定容至10 mL。使用前均需用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

未使用過的毛細(xì)管分別用1 mol/L的HCl，超純水，1 mol/L的NaOH溶液，超純水，運(yùn)行緩沖液各沖洗20 min。使用過的毛細(xì)管分別用超純水，0.1 mol/L的NaOH，超純水，運(yùn)行緩沖液各沖洗5 min即可。兩次進(jìn)樣間用運(yùn)行緩沖液沖洗2 min。所有溶液在電泳前均需用0.22 μm聚乙烯濾膜過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳分離檢測條件的優(yōu)化

圖1 HP-β -CD濃度對(duì)橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體拆分的影響Fig.1 Effect of HP-β -CD concentration on the chiral separation of hesperidin and naringin Running buffer:10 mmol/L NaB4O7+60 mmol/L SC+different concentrations of HP-β -CD:(a)20 mmol/L;(b)25 mmol/L;(c)30 mmol/L;(d)35 mmol/L;separation voltage:25 kV;hydrodynamic injection:0.5 psi×4s;detection wavelength:214 nm;temperature:25 ℃.1,1′:Hesperidin;2,2′:Naringin.

2.1.1手性選擇劑的選擇及濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察了α，β，γ-環(huán)糊精及其衍生物HP-β-CD和SC手性膠束對(duì)橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體拆分效果的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HP-β-CD對(duì)橙皮苷對(duì)映體拆分效果最佳，且可達(dá)到基線分離；SC手性膠束對(duì)柚皮苷對(duì)映體拆分效果最佳，但單獨(dú)使用它們均無法實(shí)現(xiàn)同時(shí)拆分橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體。進(jìn)一步考察了采用HP-β-CD和SC膠束雙手性選擇劑對(duì)橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體拆分效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明由于HP-β-CD和SC膠束的協(xié)同作用，橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體均能得到拆分。

實(shí)驗(yàn)考察雙手性選擇劑濃度對(duì)分析物拆分效果的影響?？疾炝薙C濃度為50、55、60、65、70 mmol/L時(shí)對(duì)分析物拆分效果的影響，結(jié)果表明60 mmol/L SC拆分效果最佳?？疾霩P-β-CD濃度在20～35 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)拆分效果的影響，結(jié)果如圖1。隨著HP-β-CD濃度的增大，分析時(shí)間縮短，柚皮苷對(duì)映體的分離度變大，但橙皮苷對(duì)映體的分離度變?。划?dāng)濃度大于30 mmol/L時(shí)，柚皮苷對(duì)映體分離度降低。綜合考慮橙皮苷對(duì)映體和柚皮苷對(duì)映體的分離情況，選擇30 mmol/L為HP-β-CD最佳濃度。

2.1.2緩沖液pH的優(yōu)化緩沖液pH的大小是影響分離的重要因素之一，pH的變化會(huì)影響電滲流的大小，改變手性選擇劑和分析物的帶電情況，進(jìn)而影響其遷移率及分離度。實(shí)驗(yàn)以20 mmol/L NaH2PO4-100 mmol/L NaOH為背景緩沖液，考察了pH在8.0～9.5范圍內(nèi)對(duì)分離的影響。結(jié)果表明，隨著pH的增大，分析物的分離度變大，遷移時(shí)間縮短；當(dāng)pH大于9.0時(shí)，橙皮苷對(duì)映體的分離度變小。綜合考慮分離度及分析時(shí)間的影響，選擇20 mmol/L NaH2PO4-100 mmol/L NaOH(pH=9.0)為最佳背景緩沖液。

2.1.3有機(jī)添加劑的選擇有機(jī)添加劑主要的作用是抑制電滲流，延長遷移時(shí)間，增加分析物的溶解度，從而改善分離度。為了進(jìn)一步提高其分離度，實(shí)驗(yàn)考察了不同有機(jī)添加劑對(duì)分離的影響，分別考察了乙腈、甲醇、異丙醇的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)加入乙腈或異丙醇時(shí)，隨著其濃度的增大，柚皮苷對(duì)映體的峰形展寬且分離度下降；而甲醇則可以改善柚皮苷對(duì)映體的分離，考察了甲醇在2%～10%(V/V)范圍對(duì)其分離的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加3%(V/V)甲醇時(shí)，高濃度的柚皮苷對(duì)映體亦能得到基線分離。

圖2 橙皮苷和柚皮苷混合標(biāo)準(zhǔn)品的分離譜圖Fig.2 Electropherogram of the standard mixture solution of hesperidin and naringin Running buffer:60 mmol/L SC+30 mmol/L HP-β -CD +20 mmol/L NaH2PO4-100 mM NaOH(pH=9.0，97%(V/V))+3%(V/V)methanol;other conditions as in Fig.1.

2.1.4分離電壓的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察了在20～26 kV范圍內(nèi)，分離電壓對(duì)分離效果的影響。當(dāng)分離電壓低于25 kV時(shí)，遷移時(shí)間延長，峰形展寬；分離電壓大于25 kV時(shí)，柚皮苷對(duì)映體不能達(dá)到基線分離。綜合考慮分離度、峰形和分析時(shí)間，選擇25 kV為最佳分離電壓。

綜上所述，優(yōu)化條件為：60 mmol/L SC+30 mmol/L HP-β-CD+20 mmol/L NaH2PO4-100 mmol/L NaOH(pH=9.0，97%(V/V))+3%(V/V)甲醇為運(yùn)行緩沖液，分離電壓25 kV。在上述條件下橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)混合液的電泳圖如圖2。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1精密度試驗(yàn)在上述優(yōu)化的條件下，將一定濃度的橙皮苷和柚皮苷混合標(biāo)準(zhǔn)液在1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算各對(duì)映體的峰面積和遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，測得橙皮苷1、橙皮苷1′、柚皮苷2和柚皮苷2′的遷移時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.43%、0.46%、0.54%、0.57%和3.5%、1.0%、2.7%、3.7%。

2.2.2線性關(guān)系及檢測限在優(yōu)化條件下，對(duì)一系列不同濃度的橙皮苷和柚皮苷混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行分析測定，以電泳譜圖的峰面積(Y)分別對(duì)橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體濃度(X，μg/mL)進(jìn)行回歸分析；由于橙皮苷和柚皮苷為消旋體，故其異構(gòu)體濃度可視為其濃度的1/2)，并根據(jù)三倍信噪比(S/N=3)確定其檢測限。所得的線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)及檢測限如表1所示。

表1 橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體線性回歸方程和檢測限

圖3 胃蘇顆粒劑提取物的毛細(xì)管電泳分離譜圖Fig.3 Electropherograms of the extract of Weisu granules(a) and the above extract + the accurate amount of analytes(b) The separation conditions as in Fig.2.

2.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱定同一批號(hào)的胃蘇顆粒粉末，按1.2節(jié)制備供試品溶液，室溫條件下每隔4 h進(jìn)樣測定橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體的峰面積變化，經(jīng)計(jì)算，在24 h內(nèi)各對(duì)映體峰面積的RSD均小于5%，說明樣品的穩(wěn)定性較好。

2.3 樣品分析及回收率試驗(yàn)

取同一批胃蘇顆粒制劑，按1.2節(jié)制備供試品溶液，在最佳電泳條件下，測定樣品中橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體的含量，結(jié)果如表2所示。實(shí)際樣品的毛細(xì)管電泳圖見圖3。為驗(yàn)證方法的可靠性，對(duì)胃蘇顆粒樣品進(jìn)行加入回收率試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體的回收率在86.0%～113.2%之間。

表2 胃蘇顆粒中橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體的含量及回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

本文建立了一種同時(shí)分離檢測胃蘇顆粒中橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體的環(huán)糊精修飾毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜法(CD-MEKC)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)采用一種手性選擇劑如HP-β-CD或SC均無法同時(shí)拆分橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體；而采用雙手性選擇劑，由于HP-β-CD和SC手性膠束的協(xié)同作用，橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體得到有效分離。所建立的方法簡單快速，分離度好，精密度高，有望為含橙皮苷和柚皮苷對(duì)映體的復(fù)雜樣品的定量檢測提供新方法。