超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法快速測定煙草中8種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留

師君麗*， 孔光輝， 逄 濤， 李 勇， 劉彥紅

(云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南玉溪 653100)

植物生長調(diào)節(jié)劑(Plant Growth Regulators，PGRs)是人工合成的具有植物激素活性的一類物質(zhì)，它們在較低濃度下即可對植物的生長發(fā)育表現(xiàn)出調(diào)節(jié)作用[1,2]，但植物生長調(diào)節(jié)劑施用不當(dāng)會在農(nóng)作物中造成殘留，給人體帶來危害。中國、美國、歐盟、日本等國家對此類物質(zhì)制訂了嚴(yán)格的限量要求，如我國規(guī)定蘋果和番茄中萘乙酸的最大殘留限量為0.1 mg/kg[3]；歐盟食品法規(guī)規(guī)定新鮮番茄中烯效唑的最大殘留限量為0.01 mg/kg；日本規(guī)定蔬菜中萘乙酸的最大殘留限量為0.1 mg/kg?，F(xiàn)在植物生長調(diào)節(jié)劑在煙草生產(chǎn)中已有使用，因此，對煙草中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的檢測顯得尤為重要。

目前，植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測方法主要集中在果蔬上，報道的方法有氣相色譜法(GC)[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6 - 8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9 - 13]，而有關(guān)煙草中其檢測方法未見報道。HPLC法雖可以測定多數(shù)植物生長調(diào)節(jié)劑，但不能滿足歐盟等國制定的殘留限量要求，且不能提供結(jié)構(gòu)方面的信息，不能完成對目標(biāo)化合物的確證工作，因而在實際應(yīng)用中受到很大的限制。將超高效液相色譜(UPLC)-MS/MS法應(yīng)用于植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留分析，不僅可以實現(xiàn)對多種植物生長調(diào)節(jié)劑的快速測定和結(jié)構(gòu)確證，還能滿足復(fù)雜基質(zhì)樣品的痕量檢測要求。

本文建立了煙草中比久、多效唑、烯效唑、矮壯素、萘乙酸、2，4-D、赤霉素、脫落酸8種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的UPLC-ESI MS/MS分析方法，該方法具有操作簡便、快速、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜(美國，Waters公司)；AB Sciex QTRAP 5500 質(zhì)譜儀(美國，AB Sciex公司)；Millipore Simplicity超純水機(jī)(美國，Millipore公司)；Eppendorf 5804高速離心機(jī)(德國，Eppendorf公司)；Talboys數(shù)顯型多管式旋渦混合器(上海安譜科學(xué)儀器公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：赤霉素、萘乙酸、比久、多效唑、烯效唑、矮壯素、2，4-D(純度均大于98%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)，脫落酸(純度大于99%，美國Sigma公司)。乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸均為色譜純(美國Fisher公司)。C18散裝吸附劑和PSA散裝吸附劑(美國Agilent公司)。實驗用水為超純水。

1.2 樣品提取與凈化

烤煙樣品40 °C烘干，粉碎后過60目篩。準(zhǔn)確稱取煙樣2 g于50 mL具蓋離心管中，加入10 mL乙腈，漩渦振蕩2 min，超聲15 min，以6 000 r/min離心3 min。移取上清液1 mL至1.5 mL離心管中，加入50 mg C18分散吸附劑，旋渦振蕩2 min，以6 000 r/min 離心2 min。吸取上清液200 μL，加入800 μL乙腈，過0.22 μm有機(jī)相濾膜后上機(jī)分析。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC?HSS T3柱(100×2.1 mm ，1.8 μm)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速0.3 mL/min。流動相A:甲醇，流動相B:5 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫：0～0.5 min，5%A；0.5～4 min，5%～100%A；4～6 min，100%A；6～7 min，100%～5%A；7～8 min，5%A。

1.3.2質(zhì)譜條件電離方式：電噴霧ESI；掃描方式：正/負(fù)離子掃描；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；正離子模式電噴霧電壓：5 000 V，負(fù)離子模式電噴霧電壓：-4 500 V；霧化氣壓力：0.344 MPa；氣簾氣壓力：0.241 MPa；輔助加熱氣壓力：0.379 MPa；離子源溫度：600 ℃。8種化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 8種化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)

*quantification transition；DP：declustering potential；CE：collision energy.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別取單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用流動注射的方式以10 μL/min的流速將單一標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源，在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描以選擇合適的分子離子峰和電離方式。結(jié)果表明，在電噴霧正離子模式下，矮壯素、烯效唑、多效唑全掃描的分子離子[M+H]+最理想，在負(fù)離子模式下，赤霉素、萘乙酸、丁酰肼、脫落酸、2，4-D全掃描的分子離子[M-H]-最理想。分別對分子離子峰進(jìn)行子離子掃描，得到二級碎片離子信息，選擇豐度相對較高和相對分子質(zhì)量較大的碎片離子，優(yōu)化錐孔電壓、離子源溫度和碰撞能等參數(shù)，使8種化合物特征碎片離子的靈敏度達(dá)到最大。優(yōu)化出的結(jié)果見1.3.2節(jié)。

2.2 液相色譜條件的選擇

比較了乙腈-水和甲醇-水兩種流動相對目標(biāo)化合物信號強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明以甲醇為有機(jī)相時，各組分的信號強(qiáng)度比較穩(wěn)定，而以乙腈為有機(jī)相時的信號強(qiáng)度明顯降低。可能是甲醇為質(zhì)子給體溶劑，有利于目標(biāo)化合物產(chǎn)生正離子，而乙腈是受體，不如甲醇優(yōu)越。

進(jìn)一步研究流動相中加入一定量的乙酸銨和甲酸對目標(biāo)化合物離子化效率的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，在流動相中加入乙酸銨有助于改善峰形，加入0.1%甲酸有助于正離子模式下待測物母離子峰的形成，但會抑制負(fù)離子模式下待測物母離子的響應(yīng)。實驗對比了甲醇和不同濃度的乙酸銨溶液作流動相時各目標(biāo)物的響應(yīng)，結(jié)果顯示，用甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液作流動相時，各目標(biāo)化合物的信號強(qiáng)度較穩(wěn)定、峰形較好、靈敏度較高。

優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件下8種植物生長調(diào)節(jié)劑的色譜圖見圖1。

圖1 8種植物生長調(diào)節(jié)劑的MRM色譜圖Fig.1 Chromatograms of 8 plant growth regulators by MRM

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇比較了以甲醇、乙腈、水、甲醇-水(體積比1∶1)為提取溶劑時，8種目標(biāo)化合物的提取效率。結(jié)果表明，甲醇-水(1∶1)和水作為提取溶劑時乳化現(xiàn)象較嚴(yán)重，乙腈提取液干擾物較少，且效率最高。進(jìn)一步比較了2%氨水的乙腈溶液、2%甲酸的乙腈溶液作為提取液的提取效果，發(fā)現(xiàn)提取液的酸堿度對8種植物生長調(diào)節(jié)劑的提取效率無明顯差異。

此外實驗對比了QuEChERS 提取方法：加入10 mL乙腈振蕩后，再加入4 g無水MgSO4，1 g NaCl，1 g 檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉提取。實驗結(jié)果表明，該方法與直接加入乙腈提取的效果無明顯差異，結(jié)合分析時間和成本考慮，實驗選用乙腈作為提取溶劑。

2.3.2提取方法的選擇實驗對提取方法進(jìn)行了比較。分別試驗了漩渦振蕩2 min后不超聲，以及分別超聲10 min、15 min、20 min和30 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨超聲時間的延長，各待測物的提取量逐漸增大，當(dāng)超聲時間為15 min時，各待測物的提取量最大，繼續(xù)延長超聲時間，各待測物的提取量不再增大，因此選擇加入乙腈后超聲15 min。

2.3.3吸附劑的選擇及用量分別稱取50、100、150、200 mg的C18吸附劑和PSA吸附劑于2.0 mL 離心管中， 分別加入1 μg/mL的8種生長調(diào)節(jié)劑基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.5 mL， 考察2種吸附劑對8種植物生長調(diào)節(jié)劑的回收率影響和凈化效果。實驗結(jié)果表明：PSA作為弱陰離子交換劑，對脂肪酸、有機(jī)酸、有機(jī)碳水化合物等極性化合物有較強(qiáng)的吸附作用，它的吸附作用隨著吸附劑用量增加而加強(qiáng)，因此除雜較凈，但對極性目標(biāo)化合物丁酰肼、矮壯素、萘乙酸和脫落酸的回收率均低于55%。C18對脂類具有較好的凈化效果，對8種生長調(diào)節(jié)劑有較好的回收率，隨著吸附劑用量增加，除雜效果和8種目標(biāo)物的回收率并無明顯變化。綜合考慮兩種吸附劑的去雜質(zhì)效果和對目標(biāo)化合物的吸附情況，選擇50 mg C18吸附劑對提取液進(jìn)行凈化。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法的回收率和檢出限

采用煙草空白基質(zhì)配制0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/L 5個濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液， 以濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.005～0.1 mg/L范圍內(nèi)，各標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積值均有良好的線性關(guān)系(表2)。選用煙草空白基質(zhì)，分別在0.005、0.01、0.05 mg/kg三個添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，每個水平重復(fù)5次，回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表2。結(jié)果表明，在3個加標(biāo)水平上，8種植物生長調(diào)節(jié)劑的回收率為85.4%～103.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～6.2%，檢出限為0.001～0.004 mg/kg。

表2 8種植物生長調(diào)節(jié)劑的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和檢出限

2.5 實際樣品分析

利用本方法對收集到的60個樣品進(jìn)行了檢測。檢測結(jié)果顯示，所有樣品均檢出脫落酸，其余7種植物生長調(diào)節(jié)劑均未檢出，樣品中脫落酸含量為0.787～1.927 mg/kg，原因為脫落酸是植物內(nèi)源激素之一。

3 結(jié)論

建立了煙草中8種植物生長調(diào)節(jié)劑的UPLC-ESI MS/MS分析方法，樣品采用乙腈提取，經(jīng)過C18分散吸附劑凈化，電噴霧正負(fù)離子模式下分析檢測。8種植物生長調(diào)節(jié)劑的檢出限為1～4 μg/kg，添加回收率為85.4%～103.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～6.2%，完全能夠滿足殘留限量要求。該方法操作簡單、靈敏度高、選擇性和穩(wěn)定性好，且分析時間短，是一種快速、準(zhǔn)確測定煙草中8種植物生長調(diào)節(jié)劑的分析方法。