南瓜黃色素阻斷亞硝胺合成與抑菌活性研究

趙二勞，楊勤帥，郝麗琴，趙三虎

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州 034000)

亞硝胺是當(dāng)前最令人關(guān)注的一類化學(xué)致癌物，它能引起人和動(dòng)物多種組織器官病變或惡性腫瘤[1,2]，嚴(yán)重影響人體健康。迄今，尚未發(fā)現(xiàn)人和動(dòng)物能依靠自身機(jī)體功能抵抗和防御亞硝胺的致癌作用[3]。正常情況下，人們直接從食物中攝入的亞硝胺甚少，但形成亞硝胺的前體物質(zhì)亞硝酸鹽卻大量存在于食物中，極易通過食物鏈進(jìn)入人體。進(jìn)入人體的亞硝酸鹽在胃液條件下很適宜合成亞硝胺[4,5]。因此，清除體內(nèi)亞硝酸鹽以及阻斷亞硝胺在人體內(nèi)的合成是防癌抗癌的有效途徑。在人們?nèi)找骊P(guān)注自身保健的今天，研究食物清除亞硝酸鹽以及阻斷亞硝胺合成是一項(xiàng)極有意義的課題。

南瓜為葫蘆科南瓜屬植物南瓜(CucurbitamoschataDuch.)的果實(shí)，其營(yíng)養(yǎng)成分豐富、全面而獨(dú)特[6]。從南瓜中提取的南瓜黃色素作為一種天然色素，色澤自然、兼有營(yíng)養(yǎng)或藥理作用，受到人們廣泛關(guān)注[7]。目前，有關(guān)南瓜黃色素提取、純化的研究不少[8,9]，但對(duì)南瓜黃色素營(yíng)養(yǎng)功能的研究較少[10]，特別是關(guān)于南瓜黃色素清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成以及抑菌活性的研究未見報(bào)道。因此，本文研究南瓜黃色素清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成及其抑菌活性，以期為人們科學(xué)認(rèn)識(shí)南瓜黃色素的營(yíng)養(yǎng)保健功能，合理使用、深度開發(fā)利用南瓜黃色素提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

723型可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；WD-9403A型紫外儀(北京市六一儀器廠)；Scientz-10N型冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2 試劑與材料

無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、1-萘胺、檸檬酸、無(wú)水碳酸鈉、N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽和磷酸氫二鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純；質(zhì)量分?jǐn)?shù)33%的二甲胺、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)為化學(xué)純；蛋白胨、牛肉膏和瓊脂粉為生物試劑。實(shí)驗(yàn)用水為二去離子水。

供試菌種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌由本校生物系實(shí)驗(yàn)室提供。

南瓜購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，洗凈、晾干、去皮和瓤，切成5mm左右的薄片，在烘箱中烘干后，粉碎，過40目篩，制得南瓜粉，裝瓶備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1南瓜黃色素的提取參考文獻(xiàn)方法[11]略作改進(jìn)。稱取南瓜粉50 g，以95%乙醇為提取溶劑，在料液比(g∶mL)1∶15，超聲功率280 W，溫度60 ℃的條件下，提取40 min。提取液過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后冷凍真空干燥，得南瓜黃色素，產(chǎn)品得率為8.09%。

1.3.2南瓜黃色素與BHT對(duì)亞硝胺合成的阻斷率采用紫外光解法[12]測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)時(shí)參照文獻(xiàn)方法[2]略作改進(jìn)。精確吸取質(zhì)量濃度為2.34 mg/mL的南瓜黃色素溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 mL，置于10支25 mL比色管中，均依次加入10 mL pH約為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，1.0 mL 1.0 mmol/L的NaNO2溶液和1.0 mL 1.0 mmol/L二甲胺溶液，去離子水定容至刻度，在水浴鍋中37 ℃恒溫反應(yīng)1 h。準(zhǔn)確吸取此含有亞硝胺的反應(yīng)液1.0 mL于10 mL比色管中，加入0.5 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Na2CO3溶液，用紫外燈照射15 min，取出后加1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的對(duì)氨基苯磺酸溶液，1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的1-萘胺溶液，以及0.5 mL去離子水，搖勻，靜置15 min后，在波長(zhǎng)525 nm處測(cè)其吸光度值，計(jì)算阻斷率(%)。

阻斷率(%)=[(A0-A)/A0]×100

(1)

式中：A0為未加南瓜黃色素時(shí)體系吸光度；A為加入南瓜黃色素后體系吸光度。

為了比較南瓜黃色素對(duì)亞硝胺合成的阻斷能力，以上述方法測(cè)定不同體積質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的常用抗氧化劑BHT對(duì)亞硝胺合成的阻斷率。

1.3.3南瓜黃色素與BHT對(duì)亞硝酸鈉的清除率參考文獻(xiàn)方法[2,13]，采用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定。在10支25 mL比色管中分別加入2.0 mL 5.0g/mL的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入10 mL pH約為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，再分別加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 mL 2.34 mg/mL的南瓜黃色素溶液，在37 ℃恒溫反應(yīng)20 min，然后各加入2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的對(duì)氨基苯磺酸，搖勻，靜置5 min，再各加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%鹽酸萘乙二胺，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，靜置反應(yīng)15 min后，在最大吸收波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算南瓜黃色素對(duì)亞硝酸鈉的清除率(%)：

清除率(%)=[(A0-A)/A0]×100

(2)

式中：A0為未加南瓜黃色素時(shí)體系吸光度；A為加入南瓜黃色素后體系吸光度。

為了比較南瓜黃色素對(duì)亞硝酸鈉的清除能力，以上述方法，測(cè)定不同體積質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的常用抗氧化劑BHT對(duì)亞硝酸鈉的清除率。

1.3.4南瓜黃色素抑菌活性參考文獻(xiàn)采用濾紙片法[14]測(cè)定。將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基制成帶菌平皿，浸有南瓜黃色素溶液的直徑5 mm濾紙片分別貼于含菌平皿的外圍，浸有無(wú)菌水的濾紙片貼于中央，以做陰性對(duì)照。然后將平皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h。每種濃度濾紙片做3次重復(fù)，觀察結(jié)果并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑取平均值。陰性對(duì)照組抑菌圈直徑應(yīng)小于或等于5.0 mm，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均做三次重復(fù)，數(shù)據(jù)取平均值，數(shù)據(jù)分析采用Excel.2007進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 南瓜黃色素與BHT對(duì)亞硝胺合成的阻斷率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。由圖1可知，在模擬人體胃液條件(pH=3.0，溫度37 ℃)下，南瓜黃色素對(duì)亞硝胺合成具有一定的阻斷能力，阻斷率隨其用量的增加而增大。4.5 mL 2.34 mg/mL的南瓜黃色素溶液對(duì)亞硝胺合成阻斷率可達(dá)93.58%。但其阻斷率明顯弱于BHT，計(jì)算得南瓜黃色素、BHT對(duì)亞硝胺合成阻斷率的Ec50分別為1.14、0.09 mg/mL。

2.2 南瓜黃色素與BHT對(duì)亞硝酸鈉的清除率

由圖2可知，在模擬人體胃液條件下，南瓜黃色素與BHT對(duì)亞硝酸鈉的清除率，隨其用量的增加而增高，4.5 mL 2.34 mg/mL的南瓜黃色素溶液對(duì)亞硝酸鈉的清除率可達(dá)71.56 %。表明南瓜黃色素具有一定亞硝酸鈉清除能力。對(duì)亞硝酸鈉的清除率南瓜黃色素明顯弱于BHT，南瓜黃色素、BHT對(duì)亞硝酸鈉清除率的Ec50分別為1.47、0.13 mg/mL。

2.3 南瓜黃色素的抑菌活性

由表1可知，隨南瓜黃色素質(zhì)量濃度增大抑菌圈直徑增大，表明抑菌能力與南瓜黃色素質(zhì)量濃度正相關(guān)。南瓜黃色素對(duì)三種供試菌均有一定的抑制作用，對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用相對(duì)最弱。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，供試菌中既有桿菌，又有球菌；既有革蘭氏陽(yáng)性菌，又有革蘭氏陰性菌，這表明南瓜黃色素具有廣譜抑菌活性。

表1 南瓜黃色素的抑菌活性

Note:Table shows the antibacterial circle diameter(including the filter diameter),"-" antibacterial；"+" no antibacterial.

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌是食品加工和貯藏中常見的腐敗細(xì)菌，本實(shí)驗(yàn)證明南瓜黃色素對(duì)它們均有一定的抑制作用，表明南瓜黃色素具有作為食品防腐劑的應(yīng)用前景。有關(guān)南瓜黃色素的抑菌機(jī)制尚不很明確，一般認(rèn)為可能是南瓜黃色素中一些活性物質(zhì)能特異性地凝固細(xì)菌蛋白，從而改變了細(xì)菌生理功能抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)；或者是南瓜黃色素與細(xì)菌生長(zhǎng)所需的物質(zhì)結(jié)合，使細(xì)菌由于缺乏生長(zhǎng)所需的物質(zhì)受到抑制而死亡[14]。具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

在模擬人體胃液條件(pH=3.0,溫度37 ℃)下，南瓜黃色素對(duì)亞硝胺合成的阻斷率和對(duì)亞硝酸鈉的清除率，隨其濃度的增加而增加，對(duì)亞硝胺合成的阻斷率最大可達(dá)93.58%，對(duì)亞硝酸鈉的清除率可達(dá)71.56 %。表明南瓜黃色素具有一定的阻斷亞硝胺合成能力和清除亞硝酸鹽能力，但其阻斷亞硝胺合成能力和清除亞硝酸鹽能力明顯弱于常用抗氧化劑BHT。同時(shí)抑菌實(shí)驗(yàn)表明，南瓜黃色素對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均有一定的抑菌活性，且其對(duì)三種供試菌種抑制能力大小順序?yàn)椋捍竽c桿菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌。南瓜黃色素具有廣譜抑菌活性。

南瓜黃色素不僅是一種天然食用色素，可用于食品添加劑，本實(shí)驗(yàn)還證明南瓜黃色素具有防腐作用和防癌抗癌營(yíng)養(yǎng)保健功能，南瓜黃色素極有可能是一種防癌抗癌保健品和綠色天然防腐劑的新資源，開發(fā)前景可觀。值得進(jìn)一步深入研究。