超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定人體尿液中3種甜味劑

陳 霞, 楊華梅, 楊建國, 張雪梅, 黃為紅, 杭 莉

(泰州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇泰州 225300)

人工合成甜味劑(Artificial Sweeteners,Ass)是一類能賦予食品甜味，且在人體內(nèi)幾乎不產(chǎn)生熱量的食品添加劑[1]，大多數(shù)甜味劑由多種成分復(fù)配使用[2]。甜蜜素、糖精鈉和安賽蜜均為非營養(yǎng)型甜味劑，具有甜度高、用量少等特點。甜蜜素化學名稱為環(huán)已基氨基磺酸鈉，自1970年P(guān)rice等人[3]報道甜蜜素對大鼠可誘發(fā)膀胱癌后，科學家們對甜蜜素的毒理以及甜蜜素體內(nèi)代謝機理展開了長期的研究[4，5]。糖精鈉化學名稱為鄰苯甲?；酋啺封c，從上世紀50年代開始至今，糖精鈉安全性就一直存在爭議，尤其是糖精鈉的致癌性一直受到科學家們的重視。安賽蜜化學名為6-甲基-1,2,3-氧惡嗪-4-(3H)-酮-2,2-二氧化物鉀鹽(乙酰磺胺酸鉀)，1997年Mukherjee等人[6]研究結(jié)果顯示在給予小鼠更高劑量(60、450、1100和2 250 mg/kg)安賽蜜時，其具有顯著致畸性和遺傳毒性。盡管我國對甜蜜素、糖精鈉和安賽蜜三種甜味劑有著嚴格的限量標準，但目前許多生產(chǎn)廠家并未嚴格執(zhí)行國家標準，導(dǎo)致超標濫用的情況屢屢出現(xiàn)[7,8]。

目前，多種甜味劑含量的測定主要有土壤樣品[1]、食品類樣品[9 - 11]、污水沉淀物[12]以及環(huán)境水樣[13,14]，而對人體尿液中甜味劑的測定只有甜蜜素有報道，采用的檢測方法主要為柱前衍生高效液相色譜法[15]和柱前衍生氣相色譜-質(zhì)譜法[4]。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時測定了人體尿液中甜蜜素、糖精鈉和安賽蜜3種甜味劑，與文獻報道的方法相比，本方法前處理簡單，無需衍生，分析速度快，靈敏度高，達到了定性和定量分析的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY超高效液相色譜(美國，Waters公司)；AB SCIEX API4000+質(zhì)譜儀(美國，ABSCIEX公司)；HC-3018R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

甜蜜素、安賽蜜和糖精鈉標準品(純度大于99%，美國Supelco公司)。標準品儲備溶液:分別準確稱取甜蜜素、糖精鈉和安賽蜜標準品各0.1 g(精確至0.1 mg)，各置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配成1.0 mg/mL標準儲備溶液，于4 ℃保存?；旌蠘藴使ぷ魅芤?分別準確移取適量各標準品儲備溶液于同一量瓶中，加水稀釋，制成所需濃度的混合標準工作溶液，將工作儲備溶液用水和50 μL空白尿樣配制成所需濃度的基質(zhì)標準系列溶液。甲醇(質(zhì)譜級，德國Merck公司)，乙酸銨(色譜純，美國Tedia公司)。實驗用水為屈臣氏瓶裝蒸餾水。

1.2 色譜及質(zhì)譜條件

1.2.1色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLCR?HSS T3色譜柱(50×2.1 mm，1.8 μm)；流動相：A為0.002 mol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序為：0～2 min，5%B;2～4 min,5%～95%B；4～6 min，95%B；6～8 min，95%～5%B；8～10 min，5%B。流速：0.2 mL/min；進樣體積：10.0 μL；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：25 ℃。

1.2.2質(zhì)譜條件掃描方式：電噴霧電離源(ESI-)掃描 ；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM) 模式；碰撞氣壓力(CAD)：4 Pa；氣簾氣壓力(CUR)：30 Pa；霧化氣壓力(GS1)：65 Pa；輔助氣壓力(GS2)：65 Pa；入口電壓(EP)：-10 V；碰撞室出口電壓(CXP)：-15 V；噴霧電壓：-4 500 V；氣化溫度：400 ℃。定量和定性離子、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 3種化合物的保留時間、相對分子質(zhì)量和優(yōu)化質(zhì)譜的分析參數(shù)

* Quantification ion,DP:Declustering potential,CE:Collision energy.

1.3 樣品制備

尿液樣品采集之后，置于冰箱中-20 ℃冷凍，用時取冰凍尿樣于室溫下緩慢解凍后，置于高速離心機中,以5 000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm水相濾膜。取濾液50 μL加950 μL水混勻，進行UPLC-MS/MS分析。如樣品濃度過高可將樣品稀釋適當倍數(shù)后進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

考察了Waters ACQUITY UPLC?C18和Waters ACQUITY UPLC?HSS T3 兩種色譜柱，根據(jù)峰形和分離度最后選擇Waters ACQUITY UPLC?HSS T3柱。以甲醇和乙酸銨水溶液為流動相，在水中加入0.002 mol/L乙酸銨有助于待測物良好峰形的形成，并能增強檢測的靈敏度。對三種物質(zhì)的混合基質(zhì)標準溶液進行分析，甲醇相起始比例為5%，最終比例為95%，運行10 min，梯度洗脫，可以實現(xiàn)三種物質(zhì)和尿液中干擾成分的分離。待測物的離子流色譜圖如圖1所示。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1定性、定量離子的選擇根據(jù)3種化合物的結(jié)構(gòu)特征，選擇負離子模式電離，采用流動注射泵進樣，分別對質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的甜蜜素、糖精鈉和安賽蜜標準溶液進行一級質(zhì)譜掃描，確定其準分子離子峰，并分別優(yōu)化其去簇電壓。分別以其準分子離子為母離子，通過碰撞氣碰撞產(chǎn)生碎片離子進行二級質(zhì)譜掃描，同時優(yōu)化碰撞電壓，選擇豐度較高的2種碎片離子作為定性與定量特征離子。通過試驗優(yōu)化，3種化合物的定性與定量特征離子及優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2.2分析物的子離子產(chǎn)生途徑從甜蜜素的化學結(jié)構(gòu)式可以看出它主要是由環(huán)己基和氨磺酸基兩部分構(gòu)成，圖2中碎裂途徑表明，甜蜜素在流動相乙酸銨的作用下脫去Na+形成m/z178.0母離子，環(huán)己基氨基磺酸負離子有兩種裂解方式，一種是N-S單鍵的斷裂脫去環(huán)己基氨基形成m/z79.9 SO3分子，另一種是C6H11-N鍵斷裂脫去環(huán)己基形成m/z95.9子離子。

從安賽蜜的化學結(jié)構(gòu)式可以看出它是一個六元雜環(huán)化合物，圖2中碎裂途徑表明，安賽蜜在流動相乙酸銨的作用下脫去K+形成m/z162.0母離子，母離子有兩種裂解方式：一種為N-S和C-O兩個單鍵的斷裂脫去一個SO3分子m/z82.0子離子；另一種方式為O-S和C-N兩個單鍵的斷裂脫去一個四元環(huán)酯化合物形成m/z78.0子離子。

糖精鈉的碎裂途徑表明，糖精鈉在流動相乙酸銨的作用下脫去Na+形成m/z182.0母離子，母離子有兩種裂解方式；一種為C-S和C-C兩個單鍵的斷裂脫去一個C6H4基團形成m/z106.0 子離子；另一種是N-S和C-C兩個單鍵的斷裂脫去一個C6H4基團和一個SO2分子形成m/z42.0子離子。

2.3 樣品前處理

糖精鈉、安賽蜜和甜蜜素三種人工合成甜味劑以原型存在于尿液中，且他們具有很好的水溶性，本方法采用冷凍離心后直接用水稀釋后直接測定。因取樣量少，基質(zhì)效應(yīng)影響不大，方法靈敏度能夠滿足。

2.4 線性范圍和檢出限

向空白尿樣中加入系列混合標準溶液，在優(yōu)化條件下測定，以定量離子的峰面積比(Y)為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標X(μg/L)進行線性回歸分析。三種化合物的相關(guān)系數(shù)大于0.99?；衔餀z出限(LOD)為樣品陰性基質(zhì)中添加標準品的方式獲得(S/N≥3)，定量限(LOQ)為樣品陰性基質(zhì)中添加標準品的方式獲得(S/N≥10)，結(jié)果見表2。

表2 3種物質(zhì)的線性方程和檢出限

Y:response value of quantitative ion of analyte;X:mass concentration of analyte,μg/L.

2.5 回收率、精密度和基質(zhì)效應(yīng)

取空白尿樣進行加標回收和精密度實驗。樣品中甜蜜素和安賽蜜添加濃度分別為50、150、450 μg/L，樣品中糖精鈉添加濃度為500、1 500、4 500 μg/L。每個添加水平樣品平行測定6次，計算回收率和精密度。在不同的添加水平下，平均回收率為99.0%～113%，相對標準偏差(RSD)為1.25%～1.78%。另外取50 μL空白樣品加標準溶液配成甜蜜素和安賽蜜均為1 mg/L，糖精鈉為10 mg/L的混合標樣測定，計算樣品的基質(zhì)效應(yīng)(表3)。結(jié)果表明本方法結(jié)果準確，可以滿足定量要求。

表3 加標回收率、RSD和基質(zhì)效應(yīng)(n=6)

2.6 實際樣品測定

應(yīng)用本方法測定了200份小學生尿樣，樣品中甜蜜素檢出率為93%，檢出濃度在0.015～200 mg/L之間；糖精鈉檢出率為52%，檢出濃度在0.10～41.4 mg/L之間；安賽蜜檢出率為64%，檢出濃度在0.010～96.6 mg/L；3種甜味劑都未檢出的樣品只有6份，檢測結(jié)果顯示3種甜味劑在小學生尿液中存在較為廣泛，其中甜蜜素更為普遍。甜蜜素的檢測結(jié)果為本研究進一步檢測尿樣中甜蜜素代謝物環(huán)己胺提供了信息。

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定人體尿液中3種合成甜味劑，該方法靈敏度高、選擇性好、前處理方法簡單，線性關(guān)系、回收率和重現(xiàn)性等方法學指標較好，分析時間短，僅用時10 min 即完成，為人體尿液中3種人工合成甜味劑的快速檢測提供了一個可靠的方法。