β -環(huán)糊精增敏熒光法測定β -雌二醇

陳金娥, 吳玉芳, 張海容

(忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州 034000)

雌二醇是一種類固醇雌激素，是雌激素中活性最強(qiáng)的激素，在許多生理過程中起著非常重要的作用。雌二醇[1]可以補(bǔ)充女性卵巢分泌的17-β-雌二醇的不足，能促使細(xì)胞合成DNA、RNA和相應(yīng)組織內(nèi)各種不同的蛋白質(zhì)，同時(shí)它也是一種具有較強(qiáng)雌性活力的內(nèi)分泌干擾物，并可產(chǎn)生代謝產(chǎn)物雌三醇。β-雌二醇在人體中含量的偏高或偏低均會(huì)引起相關(guān)疾病，如女性性腺功能不良、乳腺癌、前列腺癌、骨質(zhì)疏松、白細(xì)胞減少癥等，給人體健康帶來重大隱患。

目前，用于檢測β-雌二醇的方法主要有高效液相色譜法[2]、氣相色譜-質(zhì)譜法[3]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]、電化學(xué)分析法[5]、熒光免疫法[6]、反相高效液相色譜-熒光檢測法[1]等。這些分析方法操作繁瑣，成本較高，時(shí)間冗長[7]。β-環(huán)糊精(β-CD)是一類具有“內(nèi)疏水外親水”特殊分子結(jié)構(gòu)的大環(huán)化合物[8]，其有序的微環(huán)境可對(duì)熒光客體分子起到保護(hù)作用，減少客體分子各種猝滅過程及輻射與非輻射去活化過程，提高熒光量子產(chǎn)率[9]。本實(shí)驗(yàn)利用β-CD結(jié)構(gòu)特性，建立了一種簡單、快速的檢測雞蛋樣品中β-雌二醇的分析方法，尚未見有關(guān)此類報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；pHS-3B型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；AB204-N型電子分析天平(Mettler-Toledo Group公司)；85-2型磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；LC-4016型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

β-雌二醇(Sigma公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；聚氧乙烯月桂醚(Brij35，Alfa Aesar公司)；β-環(huán)糊精(β-CD)(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；無水乙醇(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；甲醇(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；硼酸(天津市北辰方正試劑廠)；磷酸(天津市北辰方正試劑廠)；36%乙酸(西隴化工股份有限公司)；氫氧化鈉(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；乙腈(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1β-雌二醇貯備液的配制準(zhǔn)確稱取0.0136 g雌二醇于燒杯中，用無水乙醇溶解后，移入50 mL容量瓶中用乙醇定容，濃度為1.0×10-3mol/L。

1.2.2有序介質(zhì)溶液的配制用水分別配制0.1 mol/L的SDS溶液、1.0×10-2mol/L CTMAB溶液、1.0×10-2mol/L Brij35溶液和1.0×10-2mol/Lβ-CD溶液，膠束體系濃度均大于其臨界膠束濃度。

1.2.3三酸緩沖溶液的配制[10]準(zhǔn)確稱取2.4745 g硼酸及2.71 mL磷酸(85%)與2.35 mL乙酸(36%)，用水定容至1 L，再用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至實(shí)驗(yàn)所需pH值。

1.2.4試樣制備與熒光測定參考文獻(xiàn)方法[11]，將新鮮雞蛋打碎攪勻，稱取樣品10.0 g，加入20.0 mL乙腈，在磁力攪拌器上混合攪勻，超聲20 min，于3 800 r/min條件下離心10 min，移出上清液。殘?jiān)屑尤?0.0 mL乙腈后做同樣處理，合并上清液。上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液備用。

在10 mL比色管中加入適量β-雌二醇溶液，再依次加入2 mL三酸緩沖溶液，適量有序介質(zhì)溶液，超聲15 min，靜置20 min后，在熒光光度計(jì)上測量熒光強(qiáng)度。熒光激發(fā)和發(fā)射通帶均為2.5 nm，掃描速度設(shè)定為1 200 nm/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 β -雌二醇熒光光譜

按照實(shí)驗(yàn)方法，測定β-雌二醇以及β-CD存在時(shí)的熒光激發(fā)和發(fā)射，發(fā)現(xiàn)在λex/λem=278/307 nm處出現(xiàn)強(qiáng)的熒光激發(fā)和發(fā)射峰，加入β-CD后熒光強(qiáng)度顯著增加，熒光光譜如圖1所示。

2.2 外界因素對(duì)β -雌二醇熒光強(qiáng)度的影響

2.2.1不同介質(zhì)的影響實(shí)驗(yàn)探究了在水、乙醇、甲醇、SDS、CTMAB、Brij35、β-CD七種不同介質(zhì)中β-雌二醇的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明：在酸性環(huán)境中，SDS、CTMAB、Brij35、β-CD對(duì)β-雌二醇均有熒光增敏作用，其中β-CD對(duì)雌二醇的熒光增敏效果最顯著。因此，本文選擇β-CD作為增敏介質(zhì)。表1列出了β-雌二醇在不同介質(zhì)中的熒光特性。

表1 不同介質(zhì)中雌二醇的熒光特性

2.2.2pH的影響在β-雌二醇、β-CD體系中分別用pH從1.95到12.02的三酸緩沖溶液控制溶液酸度，然后測定其熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖2。在pH為1.95～8.09范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度較強(qiáng)且比較穩(wěn)定，當(dāng)pH超過9.17時(shí)，隨著pH值的增大體系的熒光強(qiáng)度呈下降趨勢。這可能是由于pH的變化使得β-雌二醇的活性部位羥基結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致體系共軛電子云密度變化，進(jìn)而引起熒光強(qiáng)度值的改變[11]。因此實(shí)驗(yàn)選取pH=6.93的三酸緩沖溶液控制體系的酸度。

2.2.3穩(wěn)定性測量按照前述實(shí)驗(yàn)條件，以10 min為測量間隔，連續(xù)測定2 h內(nèi)體系的熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。在2 h內(nèi)熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定不變，說明測量體系穩(wěn)定性良好。

2.2.4β-CD濃度的影響選取pH=6.93的三酸緩沖溶液，固定β-雌二醇的濃度為1.0×10-5mol/L，改變?chǔ)?CD濃度，測量體系的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，β-CD濃度在2.0×10-4～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，隨著β-CD濃度的增加，熒光強(qiáng)度迅速增大；當(dāng)濃度超過1.0×10-3mol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度增長呈平緩趨勢。本文選擇β-CD濃度為2.0×10-3mol/L。

2.2.5金屬離子對(duì)β-雌二醇熒光干擾測定實(shí)驗(yàn)測定了10種不同金屬離子對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)金屬離子濃度為β-雌二醇濃度的20倍時(shí)，Ca2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Hg2+、Co2+對(duì)體系熒光強(qiáng)度無影響；Cu2+、Cd2+、Pb2+濃度降低為β-雌二醇濃度的5倍時(shí)對(duì)體系無影響；Ce3+影響較大，測量結(jié)果顯示體系在307 nm和345 nm處出現(xiàn)兩個(gè)熒光發(fā)射峰，可能生成了新的配合物，其作用機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

2.3 工作曲線、檢出限與精密度

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下繪制工作曲線，β-雌二醇濃度在6.0×10-7～4.0×10-5mol/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為：lgF=0.8181lgc+7.5124，相關(guān)系數(shù)R2=0.995，方法檢出限(3σ/k)為1.36×10-8mol/L(k為工作曲線斜率)，對(duì)1.0×10-5mol/Lβ-雌二醇溶液平行7次測量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.83%。

2.4 實(shí)際樣品分析及回收率測定

按照實(shí)驗(yàn)方法，測定3種雞蛋樣品(均購自本地超市)中β-雌二醇的含量，并進(jìn)行加入回收實(shí)驗(yàn)，取6份樣品平行測定，結(jié)果見表2。

表2 雞蛋中β -雌二醇含量測定結(jié)果

2.5 主客體分子的作用機(jī)理

2.5.1β-CD對(duì)β-雌二醇熒光強(qiáng)度的影響在β-雌二醇中加入β-CD后，隨著β-CD濃度的增加體系的熒光強(qiáng)度逐漸增大，形成了主客體包合物，其激發(fā)波長和發(fā)射波長基本保持不變。結(jié)果見圖4。

2.5.2包合比及其包合常數(shù)的測定Benes-Hildebrand雙導(dǎo)數(shù)法[11]是利用光譜法(包括吸收光譜法和熒光光譜法)測定主客體絡(luò)合物形成常數(shù)的經(jīng)典方法，本實(shí)驗(yàn)采用熒光法來測定包合物成及常數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1/△F對(duì)1/[CD]作圖呈良好線性關(guān)系，說明β-雌二醇與β-CD形成1∶1的穩(wěn)定的包合物。根據(jù)截距和斜率即可求得包合常數(shù)Kf=7.0×103。

2.5.3熱力學(xué)函數(shù)△G?、△H?、△S?測定實(shí)驗(yàn)選取25 ℃、30 ℃、35 ℃不同溫度，用雙導(dǎo)數(shù)法求得不同溫度下的包合常數(shù)Kf值，見表3。包合過程中△G?<0，△H?<0，說明該過程是一個(gè)可以自發(fā)進(jìn)行的放熱反應(yīng)，升高溫度包合物的穩(wěn)定性下降，不利于反應(yīng)正向進(jìn)行；△S?<0，說明β-雌二醇進(jìn)入β-CD分子中，使體系中分子的有序度增加[8]。研究結(jié)果表明，由于客體分子進(jìn)入β-CD空腔運(yùn)動(dòng)受限，使其熒光強(qiáng)度增大。

表3 熱力學(xué)函數(shù)測定

3 結(jié)論

本文通過β-CD增敏熒光法測定雞蛋樣品中β-雌二醇的含量，方法的線性范圍為6.0×10-7～4.0×10-5mol/L，檢出限為1.36×10-8mol/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.83%。同時(shí)采用Benes-Hildebrand雙倒數(shù)法研究了主客體包合物包合比、包合常數(shù)Kf及熱力學(xué)函數(shù)△G?、△H?、△S?變化，探討了雌二醇在環(huán)糊精體系中發(fā)光機(jī)理。