煙嘧磺隆人工抗原的合成與鼠源多克隆抗體的制備

李瀟瀟，尤會(huì)會(huì)，郭　晴，杜俊婷，丁書茂，楊　旭，袁均林

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079)

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煙嘧磺隆人工抗原的合成與鼠源多克隆抗體的制備

李瀟瀟，尤會(huì)會(huì)，郭晴，杜俊婷，丁書茂，楊旭，袁均林

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430079)

為了制備煙嘧磺隆的多克隆抗體、建立煙嘧磺隆殘留的免疫分析方法，以2-氨基磺?；?N,N-二甲基煙酰胺(ASDM)和琥珀酸酐為原料合成半抗原，采用活潑酯法制備人工抗原并免疫小鼠。結(jié)果表明：經(jīng)紫外可見吸收光譜掃描和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，人工抗原合成成功，半抗原與卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)比分別為10.5∶1和26.9∶1。5次免疫后小鼠抗血清的效價(jià)均達(dá)到1∶16 000以上，以ASDM-BSA為免疫原的小鼠產(chǎn)生了抑制煙嘧磺隆的多克隆抗體，建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)煙嘧磺隆的檢測(cè)范圍是1 ng·mL-1～10 μg·mL-1。為進(jìn)一步建立更為高效、靈敏和方便的煙嘧磺隆ELISA檢測(cè)方法提供了參考。

煙嘧磺?。蝗斯た乖?；多克隆抗體；ELISA

農(nóng)藥的使用促進(jìn)了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展?；酋ｋ孱惓輨┮蚓哂懈咝?、低毒和性價(jià)比高等特點(diǎn)，應(yīng)用非常廣泛[1]。煙嘧磺隆(nicosulfuron)，又名玉農(nóng)樂(lè)，是1987～1988年由日本石原產(chǎn)業(yè)公司與美國(guó)杜邦公司聯(lián)合開發(fā)的一類磺酰脲類除草劑，可有效去除玉米田中多種禾本科雜草以及闊葉雜草，作用原理是通過(guò)抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的合成，導(dǎo)致雜草體內(nèi)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸合成受阻，最終雜草因細(xì)胞分裂受阻，生長(zhǎng)停滯而枯死[2]。研究表明，土壤對(duì)煙嘧磺隆的吸附性較弱，使其流動(dòng)性較高，很容易污染地下水[3-4]，且生產(chǎn)此類除草劑的農(nóng)藥廠所排放的廢水中也含有較高濃度的煙嘧磺隆[5]，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。因此，煙嘧磺隆殘留的問(wèn)題逐漸引起人們的關(guān)注。

目前，煙嘧磺隆的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等，但這些方法都需要使用大型儀器，樣品的制備及分離耗時(shí)耗力，費(fèi)用昂貴。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法因具有方便、靈敏和快速的優(yōu)點(diǎn)可以彌補(bǔ)上述方法的不足，被廣泛地應(yīng)用于臨床試驗(yàn)與化學(xué)物質(zhì)分析中[6]。作者通過(guò)合成煙嘧磺隆人工抗原，成功制備出煙嘧磺隆多克隆抗體，旨在為建立煙嘧磺隆的ELISA方法提供參考。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1材料、試劑與儀器

雌性BALB/c小鼠，6周齡，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

煙嘧磺隆(純度為95%)、丁二酸酐，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠抗體IgG，Jackson公司；卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA)，Sigma公司；2-氨基磺酰基-N,N-二甲基煙酰胺(ASDM，純度98%)，北京百靈威公司；二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，成都西亞試劑公司；低分子量Marker，北京天根生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

Eppendorf5415R型低溫冷凍離心機(jī)，Beckman公司；UV-2700型紫外可見分光光度計(jì)，Shimadzu公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一儀器廠；酶標(biāo)分析儀，北京普朗新公司。

1.2方法

1.2.1人工抗原的合成

煙嘧磺隆分子結(jié)構(gòu)中不含活潑基團(tuán)，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，采用煙嘧磺隆分子一半結(jié)構(gòu)的化合物ASDM來(lái)合成人工抗原，合成路線如圖1所示：

圖1煙嘧磺隆人工抗原的合成路線

Fig.1Synthetic route of nicosulfuron artificial antigen

參照文獻(xiàn)[7]合成人工抗原ASDM-OVA，并做適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。將46 mg ASDM與20 mg琥珀酸酐溶于3 mL二甲基甲酰胺(DMF)中攪拌過(guò)夜，加入23 mg NHS和41.23 mg DCC，繼續(xù)攪拌12 h。稱取50 mg OVA 用10 mL 0.2 mol·L-1pH 值9.0硼酸鹽緩沖液溶解，將上述反應(yīng)液逐滴加入到蛋白溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)12 h，3 000 r·min-1離心5 min。將上清液放入透析袋中，于4 ℃PBS緩沖液中透析72 h，期間每隔12 h更換一次PBS緩沖液，收集透析袋內(nèi)液體，得到人工抗原ASDM-OVA。

將OVA更換為BSA，同法合成人工抗原ASDM-BSA。

1.2.2人工抗原的鑒定

1.2.2.1紫外可見吸收光譜掃描

用PBS緩沖液調(diào)零，將ASDM稀釋至一定倍數(shù)時(shí)即可進(jìn)行紫外可見吸收光譜掃描獲得清晰的光譜，然后將BSA、OVA和兩種人工抗原均稀釋至1 mg·mL-1進(jìn)行紫外可見吸收光譜掃描。

1.2.2.2SDS-PAGE鑒定

配制10%的分離膠和4%的濃縮膠，電泳完畢后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色45 min，用脫色液洗脫至膠的背景接近透明時(shí)，凝膠成相。

1.2.3小鼠的免疫及煙嘧磺隆多克隆抗體的制備

將6只雌性BLAB/c小鼠隨機(jī)分成2組：ASDM-OVA免疫組和ASDM-BSA免疫組。初次免疫將人工抗原與FCA等體積混合并充分乳化，免疫用量為每只100 μg。4周后進(jìn)行第二次免疫，用等體積FIA乳化，免疫用量為每只50 μg，以后每隔2周按第二次免疫方法重復(fù)免疫一次，第5次免疫結(jié)束后的第7 d，將小鼠斷尾取血，收集血清。用間接ELISA方法檢測(cè)其效價(jià)，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)其靈敏度進(jìn)行檢測(cè)[8]。

2　結(jié)果與討論

2.1紫外可見吸收光譜(圖2)

圖2 紫外可見吸收光譜

由圖2可知，ASDM、載體蛋白和人工抗原的紫外可見吸收光譜不同。ASDM的最大吸收峰在264.3 nm處；OVA、ASDM-OVA的最大吸收峰分別在279.0 nm、277.8 nm處;而BSA、ASDM-BSA的最大吸收峰分別在278.0 nm、276.8 nm處。兩種人工抗原與載體蛋白相比波峰均有所偏差，證實(shí)ASDM與載體蛋白偶聯(lián)成功。

2.2人工抗原的SDS-PAGE圖譜(圖3)

圖3　人工抗原的SDS-PAGE圖譜

從圖3可以看出，第3和第5泳道的人工抗原與第2和第4 泳道相應(yīng)的載體蛋白相比明顯滯后，表明ASDM與載體蛋白偶聯(lián)成功。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的遷移距離得到蛋白相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值與電泳相對(duì)遷移率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。

圖4　蛋白相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值與電泳相對(duì)遷移率標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖4的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人工抗原ASDM-OVA的相對(duì)分子質(zhì)量為48 450.69，人工抗原ASDM-BSA的相對(duì)分子質(zhì)量為74 851.41，而兩種載體蛋白OVA、BSA的相對(duì)分子質(zhì)量分別為45 kDa和66 kDa，計(jì)算可得ASDM與OVA和BSA的偶聯(lián)比分別為10.5∶1和26.9∶1。

2.3抗血清的效價(jià)及靈敏度的檢測(cè)

以其中一種人工抗原為免疫原時(shí)則用另一種人工抗原作為包被抗原，以0.5 μg·mL-1的濃度包被時(shí)測(cè)得第5次免疫后小鼠血清OD值如表1所示。以O(shè)D值約為1時(shí)的血清稀釋倍數(shù)作為小鼠抗血清的效價(jià)(即中點(diǎn)效價(jià))。

表1小鼠抗血清效價(jià)

Tab.1　Titer of mice antiserum

由表1可知，ASDM-OVA免疫組3只小鼠抗血清效價(jià)分別為1∶32 000、1∶64 000和1∶128 000；ASDM-BSA免疫組小鼠抗血清效價(jià)分別為1∶32 000、1∶32 000和1∶16 000，可見所有免疫的小鼠均產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體。確定所有小鼠的效價(jià)后，設(shè)置濃度梯度為10 μg·mL-1、1 μg·mL-1、10-1μg·mL-1、10-2μg·mL-1、10-3μg·mL-1和10-4μg·mL-1的煙嘧磺隆溶液對(duì)每只小鼠的抗血清進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然ASDM-OVA作為免疫原產(chǎn)生了高效價(jià)的抗體，但其抑制效果不明顯，檢測(cè)不到靈敏度；而以ASDM-BSA作為免疫原的2號(hào)和3號(hào)小鼠的抗血清能對(duì)煙嘧磺隆產(chǎn)生抑制，且3號(hào)小鼠的抑制效果最好，進(jìn)一步證實(shí)兩種人工抗原合成成功，也表明成功制備出煙嘧磺隆的多克隆抗體。

采用1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、0.25 μg·mL-1、0.125 μg·mL-1的包被濃度對(duì)3號(hào)小鼠的抗血清進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同的包被濃度對(duì)抑制率并沒有太大的改變，而且較低濃度的包被抗原會(huì)降低抗原的最大抑制率的檢測(cè)濃度，即檢測(cè)上限。本研究發(fā)現(xiàn)以0.5 μg·mL-1的包被濃度檢測(cè)靈敏度時(shí)得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系最好。3號(hào)小鼠的抗血清對(duì)煙嘧磺隆的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線如圖5所示。

由圖5可知，在1 ng·mL-1～10 μg·mL-1范圍內(nèi)抑制率與煙嘧磺隆濃度對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.0768lgc+0.2979，R2=0.9954。

2.4討論

農(nóng)藥等小分子物質(zhì)不具有免疫原性，必須通過(guò)與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)偶聯(lián)才有可能使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，因此，合成人工抗原是多克隆抗體制備的關(guān)鍵步驟。為了使小分子物質(zhì)連接到載體蛋白上時(shí)能夠充分

圖5　煙嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線

暴露其抗原決定簇，需要用一定長(zhǎng)度的“連接臂”使半抗原與載體蛋白偶聯(lián)?；酋ｋ孱惓輨┑姆肿咏Y(jié)構(gòu)特點(diǎn)是中間含有一個(gè)磺酰脲橋結(jié)構(gòu)，兩端連接芳環(huán)和雜環(huán)。Zhao等[9]以戊二醛作交聯(lián)劑，將芐嘧磺隆分子與載體蛋白偶聯(lián)，成功制備出兩種人工抗原，最終用制備的單克隆抗體建立了芐嘧磺隆的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。煙嘧磺隆的分子結(jié)構(gòu)與芐嘧磺隆類似，其脲橋兩端分別連接兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)的雜環(huán)，由于兩側(cè)基團(tuán)電荷分布不均勻，理論上脲結(jié)構(gòu)中兩個(gè)亞氨基上的氫可以被取代。

在對(duì)磺酰脲類除草劑人工抗原合成方法的探索中，研究人員采用農(nóng)藥分子一半的結(jié)構(gòu)與琥珀酸酐反應(yīng)合成半抗原，使其連上一個(gè)含有4個(gè)C原子的羧基，再采用活潑酯法進(jìn)行人工抗原的合成，最終成功制備出芐嘧磺隆、甲磺隆和氯嘧磺隆的抗體[10-12]。本研究也采取活潑酯法合成煙嘧磺隆人工抗原，ASDM不僅是煙嘧磺隆分子結(jié)構(gòu)的一半，而且其結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)活潑氨基，可與琥珀酸酐反應(yīng)生成半抗原。在半抗原合成過(guò)程中往往要對(duì)生成的產(chǎn)物進(jìn)行萃取、蒸餾、重結(jié)晶和質(zhì)譜鑒定等一系列復(fù)雜的操作，而本研究選用DMF作溶劑，將加入的ASDM和琥珀酸酐長(zhǎng)時(shí)間攪拌后直接加到蛋白溶液中合成人工抗原，省去了上述復(fù)雜的操作流程。人工抗原經(jīng)SDS-PAGE和紫外可見吸收光譜檢測(cè)，結(jié)果表明偶聯(lián)成功。小鼠經(jīng)免疫后獲得了對(duì)煙嘧磺隆產(chǎn)生抑制的抗血清，不僅證明人工抗原的合成成功，而且表明對(duì)此種方法的改進(jìn)是可行的。

以ASDM-OVA作為免疫原的小鼠抗血清效價(jià)均達(dá)到1∶32 000以上，而以ASDM-BSA作為免疫原的小鼠最高效價(jià)才達(dá)到1∶32 000，從產(chǎn)生抗體效價(jià)的角度來(lái)看，以O(shè)VA為載體蛋白的免疫效果更好。小鼠抗血清產(chǎn)生較高的效價(jià)說(shuō)明產(chǎn)生的抗體與包被抗原具有良好的結(jié)合能力，通過(guò)檢測(cè)并計(jì)算抑制率可判定抗體能否被小分子識(shí)別，從而最終證明所需要的目標(biāo)抗體是否產(chǎn)生。本研究結(jié)果表明，以ASDM-BSA為免疫原的小鼠產(chǎn)生了能夠識(shí)別煙嘧磺隆的多克隆抗體，所以在人工抗原合成后都要作為免疫原進(jìn)行測(cè)試，研究其免疫效果；并且免疫的動(dòng)物數(shù)量要盡可能多一些，從而避免動(dòng)物的個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。

所合成抗體對(duì)煙嘧磺隆的最高抑制率只有38%，可能的原因是ASDM連接到蛋白上作為抗原決定簇使被免疫的小鼠不僅產(chǎn)生能與煙嘧磺隆結(jié)合的抗體，而且還產(chǎn)生了ASDM與連接臂相結(jié)合，或者連接到載體上的其它小分子的抗體，從而使多克隆抗體中非目標(biāo)抗體的含量增加。該多抗建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法對(duì)煙嘧磺隆具有良好的檢測(cè)效果，檢測(cè)范圍為1 ng·mL-1～10 μg·mL-1，其最低檢測(cè)限為1 ng·mL-1，低于UPLC-MS/MS方法的最低檢測(cè)殘留量0.01 mg·L-1[13]。

3　結(jié)論

以煙嘧磺隆分子結(jié)構(gòu)的一半的物質(zhì)ASDM和琥珀酸酐為原料，以DMF為反應(yīng)溶劑直接合成半抗原，反應(yīng)產(chǎn)物不需要復(fù)雜的提純與鑒定程序就可以直接與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。免疫小鼠后獲得高效價(jià)并具有靈敏度的抗血清，證實(shí)該方法合成人工抗原的可行性，不僅為煙嘧磺隆多克隆抗體的制備與ELISA檢測(cè)方法的建立提供條件，也為合成含有氨基基團(tuán)的小分子的人工抗原提供了更便捷的技術(shù)。

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Synthesis of Nicosulfuron Artificial Antigen and Preparation of Mouse Polyclonal Antibody

LI Xiao-xiao，YOU Hui-hui，GUO Qing，DU Jun-ting，DING Shu-mao，YANG Xu，YUAN Jun-lin

(HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology，CollegeofLifeScience，CentralChinaNormalUniversity，Wuhan430079，China)

Topreparethepolyclonalantibodiesagainstpesticidenicosulfuronandestablishanimmunochemicalassaytodetectnicosulfuronresidue，haptensweresynthesizedwith2-aminosulfonyl-N，N-dimethylnicotinamide(ASDM)andsuccinicanhydrideasrawmaterials.Artificialantigensweresynthesizedbyconnectingthehaptentocarrierproteinswithanactiveestermethod，andthenmicewereimmunized.ThetwoartificialantigenswerepreparedsuccessfullyandidentifiedbyUV-visiblespectroscopyandSDS-PAGE.Thecouplingratioswere10.5∶1and26.9∶1forASDMtoovalbumin(OVA)andbovineserumalbumin(BSA)，respectively.Afterquinticanimalimmunizations，theantibodytiterofallimmunizedmicewereover1∶16 000，wherebypolyclonalantibodiesagainstnicosulfuronwereacquiredfrommiceimmunizedbyASDM-BSA.AndthenanindirectcompetitiveELISAwasestablishedfornicosulfuroncontentdeterminationwithadetectionrangeof1ng·mL-1～10μg·mL-1.Thisresearchcouldprovidereferenceforfurtherdevelopmentofmoresensitive，effectiveandfeasibleELISAdetectionmethod.

nicosulfuron；artificialantigen；polyclonalantibody；ELISA

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21577045)

2016-03-24

李瀟瀟(1993-)，男，安徽亳州人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)，E-mail：lixiaoxiao201409@sina.com；通訊作者：袁均林，副教授，E-mail:yuanjl@mail.ccnu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.09.007

TQ 450S 859.84

A

1672-5425(2016)09-0027-05

李瀟瀟，尤會(huì)會(huì)，郭晴，等.煙嘧磺隆人工抗原的合成與鼠源多克隆抗體的制備[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(9)：27-31.