基于多孔石墨烯的電位型核酸適體傳感器快速檢測啶蟲脒

李敬慧，尹坦姬，秦　偉

(1.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所 中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點實驗室 山東省海岸帶環(huán)境過程重點實驗室，山東 煙臺 264003； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

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基于多孔石墨烯的電位型核酸適體傳感器快速檢測啶蟲脒

李敬慧1,2，尹坦姬1，秦偉1

(1.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所 中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點實驗室 山東省海岸帶環(huán)境過程重點實驗室，山東 煙臺 264003； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

以核酸適體為識別分子、以多孔石墨烯為傳導(dǎo)層，發(fā)展了一種檢測煙堿類殺蟲劑啶蟲脒的電位型核酸適體傳感器。核酸適體與目標物之間的特異性識別作用誘導(dǎo)核酸適體的構(gòu)象發(fā)生一定的變化，從而引起電極電位的改變。結(jié)果表明，所構(gòu)建的電位型核酸適體傳感器對啶蟲脒檢測的線性范圍為0.5 nmol· L-1～ 1.0 μmol·L-1，檢出限為0.3 nmol·L-1，表明該傳感器對啶蟲脒具有很高的靈敏度，為其測試實際樣品提供了可能。根據(jù)所用核酸適體的不同，本適體傳感器亦可對其它有機農(nóng)藥進行檢測。

核酸適體；啶蟲脒；多孔石墨烯；電位測定；核酸適體傳感器

啶蟲脒(acetamiprid) 作為氯化煙堿類殺蟲劑，于1996年由日本曹達株式會社開發(fā)。啶蟲脒具有高效、低毒等特點，除了具有觸殺、胃毒、滲透和內(nèi)吸等殺蟲作用，還具有速效的殺蟲能力，是防治蚜蟲的較為理想的新型殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于黃瓜、油菜等蔬菜以及蘋果、梨等水果上，殘效期可達20d之久。而當啶蟲脒殘留過量時，其進入人體會對人體健康產(chǎn)生不利影響。因此，對其檢測方法的研究具有重要的實際意義。

啶蟲脒的檢測方法主要包括氣相色譜法(GC)[1]、液相色譜法(LC)[2]、高效液相色譜法 (HPLC)[3]以及固相萃取-氣相色譜法(SPE-GC)[4]等。但是這些檢測方法存在儀器體積大、操作成本高、檢測時間長等缺點。而電化學(xué)傳感技術(shù)具有操作簡單、攜帶方便、靈敏度高、檢測快速、易于實現(xiàn)自動化和實時監(jiān)測等一系列的顯著優(yōu)點，已在環(huán)境監(jiān)測、臨床診斷、食品分析等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[5-7]。核酸適體具有特異性高、親和力強、性質(zhì)穩(wěn)定、易于修飾以及目標分子范圍廣等特點，受到研究者越來越多的關(guān)注。將核酸適體作為識別元件，與電化學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合組建的電化學(xué)適體傳感器由于結(jié)合了核酸適體和電化學(xué)傳感技術(shù)兩方面的優(yōu)點，成為了近年來的研究熱點[8-11]。

電位型核酸適體傳感器是電化學(xué)適體傳感器的一個重要分支，是通過將核酸適體作為分子識別元件固定于電極表面，通過核酸適體與目標物結(jié)合后引起構(gòu)型轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致電位信號的變化來實現(xiàn)對目標物的檢測[10，12-14]。碳基納米材料具有比表面積大、吸附能力強、生物相容性好等優(yōu)點，可以與核酸適體通過共價鍵以及非共價鍵相結(jié)合的方式將其固定在電極表面并保持其生物活性。同時，將碳基納米材料修飾到電極表面，可以有效地加快電子的傳遞，增強電極的導(dǎo)電性，從而提高響應(yīng)速度，改善傳感器的性能。碳納米管是最早用于構(gòu)建電位型核酸適體傳感器的碳基納米材料[10]，然而由于碳納米管之間相互纏繞而形成的立體結(jié)構(gòu)阻礙了電子的傳輸，限制了傳感器靈敏度的提升。除碳納米管外，石墨烯也被用于構(gòu)建電位型核酸適體傳感器[12]。但是，由于石墨烯片層之間強的π-π作用和范德華力，使石墨烯片層之間容易發(fā)生堆疊，造成比表面積減小，不利于核酸適體的固定，從而導(dǎo)致識別分子在電極表面固定量減少。此外，石墨烯片層之間的相互堆疊還會阻礙電子的傳輸與轉(zhuǎn)移，延長傳感器的響應(yīng)時間。這些不足之處均對傳感器靈敏度造成影響，限制其發(fā)展與應(yīng)用。

為了進一步提高電位型核酸適體傳感器的分析性能，作者將多孔石墨烯(PGR)用于傳感器的構(gòu)建，利用核酸適體作為識別分子，通過電位信號的變化來檢測有機農(nóng)藥啶蟲脒。

1　實驗

1.1試劑與儀器

啶蟲脒、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma-Aldrich公司；濃鹽酸、濃硝酸、氯化鈉、高錳酸鉀等，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；石墨烯(GR)，南京先豐納米材料科技有限公司。

核酸適體，其堿基序列如下：5′-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATA-TTATGAAGA-3′；干擾DNA，其堿基序列如下：5′-TCTTCATAATATGGTGTCAGCGATCAAGAAC-CGCTGCAGACAAATTACA-3′，上海生工生物有限責任公司。

CHI 660C型電化學(xué)工作站，上海辰華；PHSJ-216型雷磁離子計，上海精科；CASCADE-BIO型超純水系統(tǒng)，美國頗爾；XS105DU 型精密電子天平，梅特勒-托利多；S-4800型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立。

1.2PGR修飾玻碳電極(GC/PGR電極)的制備

在100 mL石墨烯分散液中加入5 mL 16 mg·mL-1KMnO4溶液，攪拌1 h； 得到的產(chǎn)物用 60 ℃的熱鹽酸處理30 min，隨后用去離子水和乙醇沖洗，在真空干燥箱中干燥，得到PGR，備用[15]。

將玻碳(GC)電極用拋光粉打磨，清洗后干燥。稱取一定量的PGR溶于水中，配成3 mg·mL-1的水溶液，量取10 μL的PGR水溶液滴于GC電極表面，待其完全干燥后，重復(fù)上述步驟2次，制得GC/PGR電極。

1.3GC/PGR-Aptamer電極的制備

核酸適體使用前經(jīng)95 ℃加熱5 min，然后量取10 μL 1 μmol·L-1核酸適體滴于GC/PGR電極表面，待其干燥后進行測試。測試前用1 mmol· L-1pH 值7.4的Tris-HCl緩沖溶液沖洗電極，以洗去未與GC/PGR結(jié)合的核酸適體。

對所制備的GC/PGR-Aptamer電極在5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]和0.1 mol·L-1KCl溶液中進行循環(huán)伏安和阻抗分析。

1.4電位檢測

以GC/PGR-Aptamer電極為指示電極、雙液接Ag/AgCl (3 mol·L-1)為參比電極(0.1 mol·L-1LiOAc溶液為鹽橋電解質(zhì))，利用離子計記錄加入不同濃度的啶蟲脒溶液時電極電位的變化。

2　結(jié)果與討論

2.1PGR的掃描電鏡照片(圖1)

從圖1可以看出，所合成的PGR具有很明顯的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小約為200 nm。

圖1　PGR的掃描電鏡照片

2.2循環(huán)伏安及阻抗分析

為了考察核酸適體是否修飾到GC/PGR電極表面，分別進行了循環(huán)伏安及阻抗分析，結(jié)果如圖2所示。

a.掃速100 mV·s-1　b.掃描頻率0.1 Hz ～100 kHz，激發(fā)振幅5 mV

面時，氧化還原峰之間的電位差值明顯增大且氧化還原峰電流也顯著減小。這主要是因為核酸適體的不導(dǎo)電性，當核酸適體以非共價作用吸附在PGR表面時，阻礙了電解質(zhì)和電極之間電子的轉(zhuǎn)移。

2.3檢測條件的選擇

在進行檢測條件優(yōu)化時，所用的核酸適體濃度均為1.0 μmol·L-1。

2.3.1緩沖溶液對電位響應(yīng)的影響

將制備的核酸適體傳感器放入2 mL 1 mmol·L-1pH值7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，待電位穩(wěn)定后開始計時。在200 s時，往緩沖溶液中分別加入20 μL 1 mmol· L-1緩沖溶液和20 μL 1 μmol·L-1啶蟲脒溶液，考察緩沖溶液對電位響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3　緩沖溶液對電位響應(yīng)的影響

從圖3可以看出，當加入緩沖溶液時，電位值并沒有發(fā)生變化；相反，當加入啶蟲脒溶液時電極電位則明顯降低。這是由于核酸適體與配體啶蟲脒之間發(fā)生特異性結(jié)合，引起核酸適體的構(gòu)型發(fā)生變化，導(dǎo)致了明顯的電位變化。表明，緩沖溶液不會對電極電位造成影響，引起電位變化的原因是核酸適體與啶蟲脒的特異性結(jié)合作用。

2.3.2基底材料對電位響應(yīng)的影響

制備基于不同基底材料的核酸適體傳感器，一種以GR為基底，一種以PGR為基底，測試條件同2.3.1，待電位穩(wěn)定后，往緩沖溶液中加入20 μL 1 μmol·L-1啶蟲脒溶液，考察基底材料對電位響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4　基底材料對電位響應(yīng)的影響

由圖4可以看出，加入啶蟲脒溶液后，兩種不同基底的電極電位都發(fā)生了變化，其中以PGR為基底的電極電位變化大于以GR為基底的電極。主要原因是PGR相比于GR具有多孔結(jié)構(gòu)，能夠增大其比表面積，使吸附在其表面的核酸適體增多，從而能夠與更多的啶蟲脒相結(jié)合，使電極電位發(fā)生更明顯的變化，有助于提高電極的靈敏度。

2.3.3干擾DNA對電位響應(yīng)的影響

為了探究電極電位發(fā)生變化是由核酸適體與目標物的特異性結(jié)合所引起，考察了干擾DNA對電位響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5　干擾DNA對電位響應(yīng)的影響

由圖5可知，加入啶蟲脒溶液后，GC/PGR電極電位沒有發(fā)生明顯變化，表明PGR與啶蟲脒不能發(fā)生結(jié)合，排除PGR的影響。GC/PGR-DNA電極電位則有稍微的變化，可能是由于啶蟲脒的加入引起了電極與溶液界面微環(huán)境的改變，造成電極表面電位的微小變化。相比于GC/PGR-DNA電極，GC/PGR-Aptamer電極電位則表現(xiàn)出大幅度的變化，這可以歸因于核酸適體與配體啶蟲脒之間的特異性結(jié)合作用。表明，核酸適體與啶蟲脒之間的特異性結(jié)合作用是造成電位發(fā)生變化的原因。

2.3.4核酸適體用量對電位響應(yīng)的影響(圖6)

圖6　核酸適體用量對電位響應(yīng)的影響

由圖 6可知，隨著核酸適體用量的增加，GC/PGR-Aptamer電極電位發(fā)生了明顯的降低；當核酸適體用量為 10 μL時，電極電位變化最大；用量為15 μL時，電極電位變化和10 μL時相差無幾；而當核酸適體用量為5 μL和20 μL時，電極電位變化相對較小。結(jié)果表明，核酸適體的用量過少(5 μL)或者過多(20 μL)時，均不利于 GC/PGR-Aptamer電極電位發(fā)生變化。主要原因可能是核酸適體用量過少時，沒有足夠的核酸適體與目標物相結(jié)合，從而造成電極電位變化不明顯；而當核酸適體用量過多時，因核酸適體的不導(dǎo)電性，過多的核酸適體纏繞在電極表面會阻礙電子的轉(zhuǎn)移，從而減小電極電位的變化。綜合考慮，對目標物進行檢測時選擇核酸適體用量為 10 μL。

2.4電極檢測啶蟲脒的工作曲線

以1.0 μmol·L-1核酸適體為指示分子，對不同濃度的啶蟲脒進行檢測，結(jié)果見圖7。

由圖7a可知，當加入0.5 nmol·L-1～ 1.0 μmol·L-1的啶蟲脒溶液時，所構(gòu)建的核酸適體電位傳感器電位響應(yīng)立即發(fā)生變化，響應(yīng)時間約為50 s，表明核酸適體和啶蟲脒之間存在一個快速的親和力平衡且傳導(dǎo)層能夠有效地傳遞電子。主要原因是PGR表面缺陷較少、導(dǎo)電性強、能夠促進電子轉(zhuǎn)移，有利于傳導(dǎo)層非對稱性類電容行為，進一步全面增強傳導(dǎo)層的效率。由圖7b可知，電極電位與啶蟲脒濃度的對數(shù)呈良好的

1～7，啶蟲脒濃度：0.5 nmol·L-1，1 nmol·L-1，5 nmol·L-1，10 nmol·L-1，100 nmol·L-1，1 μmol·L-1，10 μmol·L-1

線性關(guān)系，線性方程為：E=323.76+4.42(-logc)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9941，線性范圍為0.5 nmol·L-1～ 1.0 μmol·L-1,電極的檢出限為0.3 nmol·L-1。電極具有低檢出限是由于PGR具有多孔結(jié)構(gòu)，增大了其比表面積，通過π-π作用能夠固定更多的核酸適體，從而增加結(jié)合位點的數(shù)量，促進核酸適體與啶蟲脒的相互結(jié)合。

3　結(jié)論

構(gòu)建了一種以PGR為傳導(dǎo)層、以核酸適體作為識別分子的具有低檢出限的電位型核酸適體傳感器，并用于檢測啶蟲脒。PGR的多孔結(jié)構(gòu)使其具有大的比表面積，能夠固定更多的核酸適體，進而提供更多的結(jié)合位點，便于對目標物進行檢測。核酸適體與目標物的特異性結(jié)合能夠改變核酸適體的構(gòu)象，引起電位變化。該傳感器對啶蟲脒檢測的線性范圍為0.5 nmol·L-1～1.0 μmol·L-1，檢出限為0.3 nmol·L-1；響應(yīng)快速，響應(yīng)時間約為50 s。此外，電位型核酸適體傳感器根據(jù)所使用核酸適體的不同，可以實現(xiàn)對不同目標物的檢測。

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Porous Graphene-Based Potentiometric Aptasensors for Rapid Determination of Acetamiprid

LI Jing-hui1,2，Yin Tan-ji1，QIN Wei1

(1.YantaiInstituteofCoastalZoneResearch，ChineseAcademyofSciences；KeyLaboratoryofCoastalEnvironmentalProcessesandEcologicalRemediation，ChineseAcademyofSciences;ShandongProvincialKeyLaboratoryofCoastalEnvironmentalProcesses，YICCAS,Yantai264003，China;2.UniversityoftheChineseAcademyofSciences，Beijing100049，China)

Apotentiometricaptasensorforrapiddetectionofnicotinamideinsecticideacetamipridwasdevelopedusingporousgrapheneasatransducerlayerandaptamersasrecognitionmolecules，respectively.Thespecificidentificationbetweentheaptamerandthetargetinducedaconformationalchangeintheaptamer，resultinginasubsequentchangeoftheelectrodepotential.Resultsshowedthat，theproposedaptasensorexhibitedagoodlinearrelationshiptoacetamipridintheconcentrationrangeof0.5nmol·L-1～1.0μmol·L-1andthedetectionlimitwas0.3nmol·L-1.Theseresultsindicatedthatthedevelopedaptasensorhadagoodsensitivitytoacetamiprid，whichprovidedapossibilityforthedeterminationofacetamipridforrealsamples.Thisaptasensorcanalsobeusedtodetectotherorganicpesticidesbasedondifferentaptamers.

aptamer；acetamiprid；porousgraphene；potentiometry；aptasensor

國家自然科學(xué)基金資助項目(21475148)，山東省泰山學(xué)者人才計劃

2016-04-28

李敬慧(1990-)，女，山東濟寧人，博士研究生，研究方向：環(huán)境監(jiān)測，E-mail：jinghuili@yic.ac.cn；通訊作者：秦偉，博士，研究員，E-mail：wqin@yic.ac.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.09.015

O 657.15

A

1672-5425(2016)09-0062-05

李敬慧，尹坦姬，秦偉.基于多孔石墨烯的電位型核酸適體傳感器快速檢測啶蟲脒[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(9)：62-66.