高產(chǎn)輔酶Q10類球紅細(xì)菌的化學(xué)誘變篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

扶教龍，錢大偉，吳晨奇，徐敏強(qiáng)，胡翠英，李良智

（蘇州科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇蘇州215000）

高產(chǎn)輔酶Q10類球紅細(xì)菌的化學(xué)誘變篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

扶教龍，錢大偉*，吳晨奇，徐敏強(qiáng)，胡翠英，李良智

（蘇州科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇蘇州215000）

利用菌株對（維生素K3+疊氮化鈉+對羥基苯甲酸）的復(fù)合抗性作為篩選標(biāo)記，對產(chǎn)輔酶Q10的類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）使用亞硝基胍進(jìn)行化學(xué)誘變，篩選高產(chǎn)菌株并采用響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基。結(jié)果表明，經(jīng)誘變選育得到一株遺傳穩(wěn)定的輔酶Q10高產(chǎn)菌株R.sp3-7，其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖31.7 g/L，玉米漿干粉5.6 g/L，（NH4）2SO45.3 g/L、谷氨酸鈉3.0 g/L、NaCl 3.0 g/L、MgSO4·7H2O 12.5 g/L、KH2PO43.0 g/L、CaCO32.0 g/L、輔液1 mL/L。在此培養(yǎng)條件下，誘變菌株R.sp3-7的輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)（93.63±0.59）mg/L，與出發(fā)菌株相比提高了116.8%。

輔酶Q10；抗性平板；化學(xué)誘變；響應(yīng)面分析方法；類球紅細(xì)菌

輔酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）廣泛存在于高等動物線粒體內(nèi)膜中的一種內(nèi)源性物質(zhì)，是呼吸鏈的重要遞氫體，是生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的必需成分［1］。它具有抗氧化性、清除自由基、提高機(jī)體免疫力等功效，可預(yù)防和治療多種疾病，在治療心臟衰竭、延緩皮膚衰老等方面具有較廣泛的應(yīng)用［2-4］。因此，經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)CoQ10的途徑也變得尤為重要。目前，CoQ10的主要生產(chǎn)方法有：動植物提取法、植物細(xì)胞培養(yǎng)法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。相比其他三種方法，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)CoQ10具有分離過程相對簡單、產(chǎn)品活性好、可規(guī)模放大生產(chǎn)能力等優(yōu)點(diǎn)，成為最有發(fā)展?jié)摿Φ腃oQ10生產(chǎn)方法。要實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)CoQ10首先要解決的問題是獲得一株高產(chǎn)菌株。但是自然篩選獲得的菌株產(chǎn)量都很低，需要通過誘變育種、構(gòu)建工程菌、優(yōu)化發(fā)酵工藝等策略，來最大限度地提高菌株生產(chǎn)CoQ10的能力，以實(shí)現(xiàn)CoQ10的工業(yè)化生產(chǎn)［5］。

由于CoQ10的生物合成途徑比較復(fù)雜，涉及到超過20種中間產(chǎn)物和調(diào)控相關(guān)反應(yīng)的酶類。目前通過基因工程方法通過改變某一或某幾個關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來提高發(fā)酵菌株中CoQ10的含量并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)仍存在一定困難，傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變育種手段仍是獲得CoQ10高產(chǎn)菌株的有效方法。鄭君等［6］以球形紅假單胞菌（Rhodopseudomlonas sphaeroides）1.1737T為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線和亞硝基胍誘變，并結(jié)合羅紅霉素和對羥基苯甲酸抗性突變株篩選，獲得了一株CoQ10產(chǎn)量為50.6 mg/L的高產(chǎn)突變株P(guān)HBR-2，較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了90.9%。YOSHIDA H等［7］對類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）KY-4113進(jìn)行NTG誘變篩選耐L-乙硫氨基酪酸的突變株，獲得的一株綠色突變株，該株菌可能喪失合成紅色類胡蘿卜素的能力而表達(dá)細(xì)菌葉綠素，故在肉湯瓊脂培養(yǎng)基上呈綠色菌落，該菌株CoQ10含量比野生株提高20%。

本研究采用超聲輔助酸熱法對類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）進(jìn)行CoQ10破壁提取，可實(shí)現(xiàn)批量提取菌體中CoQ10。使用紫外-氯化鋰（LiCl）、亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）最佳誘變劑量誘變處理，篩選耐維生素K3（vitamin K3，VK3）、疊氮化鈉（NaN3）、對羥基苯甲酸（para hydroxy benzoic acid，PHBA）等前體物質(zhì)的CoQ10生產(chǎn)菌株。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵初篩、復(fù)篩獲得CoQ10高產(chǎn)菌株，并使用單因素與響應(yīng)面法結(jié)合進(jìn)一步對其發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化［8-10］，以進(jìn)一步提高CoQ10產(chǎn)量，為CoQ10在國內(nèi)的工業(yè)化生產(chǎn)奠定一定的科學(xué)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）：由浙江大學(xué)于洪巍教授贈送。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖3 g/L，酵母提取物8 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO41.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，1 mL/L輔液；用NaOH調(diào)pH至7.2。121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40g/L，玉米漿干粉3g/L，谷氨酸鈉3 g/L，NaCl 3 g/L，硫酸銨3 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 12.5 g/L，CaCO32 g/L，1 mL/L輔液；用NaOH調(diào)pH至7.2。121℃滅菌20 min。

輔液：鹽酸硫胺1 g/L，生物素0.015 g/L，煙酸1 g/L［11］。

1.1.3化學(xué)試劑

對羥基苯甲酸、氯化鋰、亞硝基胍、維生素K3、疊氮化鈉、CoQ10標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇、乙醇（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；葡萄糖、酵母提取物、瓊脂粉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、MgSO4·7H2O、鹽酸硫胺、生物素、煙酸、NaOH、谷氨酸鈉、硫酸銨、CaCO3、無水乙醇、乙酸乙酯：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米漿干粉：上海緣肽生物有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜：日本島津企業(yè)管理（中國）有限公司；UNE500滅菌烘箱：德國MEMMERT公司；SW-CJ-2FD超凈臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；TS-2102型搖床：上海天呈科技有限公司；GHP隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化和種子培養(yǎng)液的制備

將甘油管保存的菌種稀釋涂布到基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基上，32℃條件下靜置培養(yǎng)7 d；待菌落生長成熟后，挑起平板上單個菌落接入種子培養(yǎng)基，于32℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。裝液量均為50 mL/250 mL。

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)

取種子培養(yǎng)液以8%（V/V）接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于32℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.3.3CoQ10的超聲輔助酸熱破壁提取

取發(fā)酵液1 mL，加入200 μL 0.02 mol/L HCl，70℃、500 W超聲水浴處理15 min。5 000 r/min離心10 min，棄盡上清。加入5 mL提取液（乙酸乙酯∶乙醇=5∶3，V/V），混勻后置于超聲波清洗儀中超聲提取10 min，暗室中抽提15 min，每隔5 min搖勻一次。將抽提液10 000 r/min離心10 min，得CoQ10提取液［12］。

1.3.4CoQ10含量的測定

采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）法進(jìn)行CoQ10含量的測定。HPLC色譜條件：Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶異丙醇=3∶1（V/V）；柱溫40℃；檢測波長275 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

CoQ10標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取10 mg的CoQ10標(biāo)準(zhǔn)品溶于50 mL的無水乙醇中，得200 mg/L的CoQ10母液，以此母液出發(fā)分別稀釋至質(zhì)量濃度分別為40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L和160 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過HPLC分析獲得CoQ10各標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度對應(yīng)的峰面積，并建立CoQ10質(zhì)量濃度與峰面積之間的關(guān)系曲線。按照CoQ10標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算發(fā)酵液中CoQ10的含量。

1.3.5誘變方法

（1）菌懸液的制備

取10 mL對數(shù)生長期的類球紅細(xì)菌種子培養(yǎng)液，5 000 r/min離心10 min，棄上清，用無菌生理鹽水洗滌兩次，重新懸浮10 mL生理鹽水中，即得菌懸液。

（2）抗性濃度確定

將稀釋后菌懸液分別涂布在含有不同質(zhì)量濃度疊氮化鈉（NaN3）、對羥基苯甲酸（PHBA）、維生素K3（VK3）和空白的平板培養(yǎng)基中，32℃條件下，培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長情況。

（3）化學(xué)誘變方法

取1 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的亞硝基胍母液加入9 mL菌懸液中，調(diào)節(jié)終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，30℃恒溫水浴振蕩處理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后，離心終止反應(yīng)，稀釋涂布到平板培養(yǎng)基中，后置于32℃避光培養(yǎng)5 d培養(yǎng)，計算活菌數(shù)，繪制致死率曲線。致死率計算公式如下：

1.3.6菌株的篩選

（1）初篩

將經(jīng)過NTG誘變處理30 min后的菌懸液，涂布到含有一定濃度NaN3、PHBA、VK3的平板培養(yǎng)基中，待菌落生長成熟后，從誘變后的平板中挑取顏色變化（除紅色以外的菌株）［14-15］或者平板中相對較大且紅的單菌落，接入斜面培養(yǎng)基中，斜面培養(yǎng)。

（2）復(fù)篩

將初篩得到的菌株逐個進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測定其CoQ10產(chǎn)量。

（3）突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將突變株R.sp3-7進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代5次，測定其CoQ10產(chǎn)量（每代重復(fù)3次），驗(yàn)證高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性。

1.3.7發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化設(shè)計

單因素試驗(yàn)：選擇葡萄糖質(zhì)量濃度為25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L、45 g/L，選擇玉米漿干粉質(zhì)量濃度為3 g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L，選擇硫酸銨質(zhì)量濃度為3g/L、4g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L，分別考察葡萄糖、玉米漿干粉及硫酸銨添加量對誘變菌株發(fā)酵產(chǎn)CoQ10的影響［16］。

中心組合設(shè)計試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選用葡萄糖（X1）、玉米漿干粉（X2）及硫酸銨（X3）添加量為考察因素，以CoQ10產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析及驗(yàn)證試驗(yàn)，最終獲得最佳培養(yǎng)基配方［17-18］。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments g/L

2　結(jié)果與分析

2.1CoQ10標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以CoQ10質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制CoQ10標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，CoQ10標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.067 29x，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 96，說明二者線性關(guān)系良好［13］。

圖1　輔酶Q10的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of CoQ10

2.2誘變篩選結(jié)果

2.2.1抗性平板中VK3、NaN3、PHBA濃度的確定

維生素K3是的結(jié)構(gòu)類似物，作為抗性篩選，可以篩選到突破生物合成中的底物質(zhì)量濃度反饋抑制的突變株。不同質(zhì)量濃度維生素K3條件下類球紅細(xì)菌出發(fā)菌株的生長狀況，結(jié)果見表2。由表2可知，維生素K3質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/L時沒有菌落生長，將其作為最低抑菌濃度。

表2　維生素K3最低抑菌濃度的確定Table 2 Determination of minimum inhibitory concentration of vitamin K3

疊氮化鈉具有阻斷電子傳遞鏈中電子從細(xì)胞色素氧化酶到氧分子間的傳遞，所以將其作為抗性篩選。不同質(zhì)量濃度對羥基苯甲酸條件下，類球紅細(xì)菌出發(fā)菌株的生長狀況，結(jié)果見表3。由表3可知，對羥基苯甲酸質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/L時沒有菌落生長，將其作為最低抑菌濃度。

表3　疊氮化鈉最低抑菌濃度的確定Table 3 Determination of minimum inhibitory concentration of NaN3

對羥基苯甲酸是CoQ10生物合成中的前體物質(zhì)，作為抗性因素，既可以增加CoQ10的合成量，又有可能篩選到解除自身前體物的抑制突變株。不同質(zhì)量濃度對羥基苯甲酸條件下類球紅細(xì)菌出發(fā)菌株的生長狀況，結(jié)果見表4。由表4可知，對羥基苯甲酸質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 g/L時沒有菌落生長，將其作為最低抑菌濃度。

表4　對羥基苯甲酸最低抑菌濃度的確定Table 4 Determination of minimum inhibitory concentration of p-hydroxybenzoie acid

2.2.2亞硝基胍誘變劑量的選擇

圖2　類球紅細(xì)菌的NTG誘變致死率Fig.2 Fatality rate ofR.sphaeroides by NTG mutagenesis

NTG為高效誘變劑，能在較低的致死劑量下得到較高的突變率。實(shí)驗(yàn)確定NTG的作用濃度為0.5 mg/mL，分別對出發(fā)菌株誘變處理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后，通過測定不同劑量下的菌體活菌數(shù)，繪制亞硝基胍誘變致死率曲線見圖2。由圖2可知，隨著NTG誘變時間延長，類球紅細(xì)菌致死率逐步升高至100%。因此，選擇致死率在80%的作用時間30 min作為最佳誘變劑量，對菌懸液進(jìn)行誘變處理。

2.2.3高產(chǎn)誘變菌株的篩選

對菌懸液以最佳誘變劑量誘變，涂布到同時含有VK3、NaN3和PHB的平板上，從篩選平板上挑取50株生長良好的單菌落進(jìn)行初篩和復(fù)篩，測定CoQ10產(chǎn)量，篩選結(jié)果見圖3。前16株是顏色變化的菌株，其中1～4為黃色，5～7為白色，8～16為粉色；17～50為紅色。對比篩選的各株菌發(fā)現(xiàn)，顏色變化的菌CoQ10產(chǎn)量變化幅度較大，且負(fù)突變較多，大多數(shù)產(chǎn)量遠(yuǎn)低于出發(fā)菌的產(chǎn)量，但易獲得提高幅度較大的CoQ10生產(chǎn)菌株。其中粉色應(yīng)是類球紅細(xì)菌退化后的菌，產(chǎn)量普遍偏低，篩選時可避開。而平板中相對其他菌落，較大且紅的菌變化幅度雖然不大，但正突變率較大。經(jīng)篩選選取3株產(chǎn)量較高的菌株（7號、25號、31號三株菌株）斜面甘油管保藏并進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，最終選取7號菌株進(jìn)行后續(xù)研究。其是一株白色突變菌株R.sp3-7，CoQ10產(chǎn)量為71.23mg/L，與出發(fā)菌株（43.19 mg/L）相比提高了64.92%。該株菌可能喪失合成紅色類胡蘿卜素的能力。

圖3　化學(xué)誘變篩選結(jié)果Fig.3 Screening results of chemical mutagenesis

2.2.4突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

表5　菌株R.sp3-7的遺傳穩(wěn)定性Table 5 Genetic stability of strain R.sp3-7

為了驗(yàn)證高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性，在實(shí)驗(yàn)中將突變株R.sp3-7在斜面上連續(xù)傳代，每代均進(jìn)行液體發(fā)酵，傳代10次，測定其CoQ10產(chǎn)量（每代重復(fù)3次），結(jié)果見表5。由表5可知，菌體產(chǎn)量較高，波動小，遺傳穩(wěn)定性好。經(jīng)過多輪選育，菌落形態(tài)較單一。因此，菌株R.sp3-7可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究和工業(yè)應(yīng)用。

2.3發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1單因素試驗(yàn)

（1）葡萄糖質(zhì)量濃度對CoQ10產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度對發(fā)酵生產(chǎn)CoQ10的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到30 g/L時，CoQ10產(chǎn)量達(dá)到最大，可以達(dá)到（83.39±0.48）mg/L，進(jìn)一步提高葡萄糖質(zhì)量濃度則會對CoQ10積累產(chǎn)生一定的抑制作用。故選擇葡萄糖最佳質(zhì)量濃度為30 g/L。

圖4　葡萄糖質(zhì)量濃度對輔酶Q10產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of glucose content on the yield of CoQ10

（2）玉米漿干粉質(zhì)量濃度對CoQ10產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基中玉米漿干粉質(zhì)量濃度對發(fā)酵生產(chǎn)CoQ10的影響，結(jié)果見圖5。

圖5　玉米漿干粉質(zhì)量濃度對輔酶Q10產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of corn steep powder content on the yield of CoQ10

由圖5可知，當(dāng)玉米漿干粉質(zhì)量濃度3～6 g/L時，CoQ10產(chǎn)量不斷增加，并在玉米漿干粉質(zhì)量濃度為6g/L時，CoQ10產(chǎn)量達(dá)到最大值（82.23±0.58）mg/L，進(jìn)一步提高玉米漿干粉的質(zhì)量濃度則不利于CoQ10產(chǎn)量的積累。故選擇玉米漿干粉質(zhì)量濃度為6 g/L。

（3）硫酸銨質(zhì)量濃度對CoQ10產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基中硫酸銨質(zhì)量濃度對發(fā)酵生產(chǎn)CoQ10的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量濃度為5 g/L時，CoQ10產(chǎn)量達(dá)到最大值（80.43±0.46）mg/L，繼續(xù)增加硫酸銨質(zhì)量濃度，CoQ10產(chǎn)量反而降低，這表明過多的硫酸銨并不利于CoQ10的形成。這可能是由于硫酸銨為無機(jī)氮源，而發(fā)酵液里已有有機(jī)氮源，過多的NH4+不利于菌體生長和CoQ10合成。故選擇硫酸銨的最佳質(zhì)量濃度為5 g/L。

圖6　硫酸銨質(zhì)量濃度對輔酶Q10產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of（NH4）2SO4content on the yield of CoQ10

2.3.2響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

（1）模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，參照Box-Behnken試驗(yàn)方案，對葡萄糖（X1）、玉米漿干粉（X2）、硫酸銨（X3）質(zhì)量濃度3個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見表6。

表6　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

用Design-Expert V8.0.6軟件，對表6進(jìn)行多元回歸擬合，可以得到CoQ10產(chǎn)量（Y）對葡萄糖（X1）、玉米漿干粉（X2）、硫酸銨（X3）的回歸方程為：Y=-609.378 50+23.742 80X1+ 54.65983X2+65.30725X3-9.53333E-003X1X2+2.19020X1X3-4.352 67X2X3-0.558 71X12-2.765 22X22-10.319 75X32。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果見表7。

表7　回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

由表7可知，方差模型顯著性P值為0.000 9＜0.05，表明該模型是顯著的，方程擬合度較好；同時失擬項(xiàng)的P值為0.072 2＞0.05，說明模型失擬不顯著，殘差由隨機(jī)誤差引起，模型有效；該方程決定系數(shù)R2=0.980 5，說明方程的擬合程度較好，該模型能較好地預(yù)測發(fā)酵培養(yǎng)基組分與CoQ10產(chǎn)量的關(guān)系；校正決定系數(shù)R2Adj=0.945 4，表明方程模型可信度較高，能夠較好地描述試驗(yàn)結(jié)果［19］。

（2）響應(yīng)面優(yōu)化及分析

根據(jù)BB試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果做出三維響應(yīng)面，結(jié)果見圖7。由圖7可知，該方程的拋物線圖形開口均向下，說明方程存在最大值，即響應(yīng)面范圍覆蓋了最大值所在的區(qū)域。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度一定時，CoQ10產(chǎn)量隨著玉米漿干粉質(zhì)量濃度增加而增大，但當(dāng)玉米漿干粉質(zhì)量濃度＞5.63 g/L時，CoQ10產(chǎn)量呈下降趨勢。當(dāng)玉米漿干粉質(zhì)量濃度一定時，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，CoQ10產(chǎn)量也隨之增大，但當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時，CoQ10產(chǎn)量逐漸降低。等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強(qiáng)弱，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。結(jié)果表明，葡萄糖與玉米漿干粉交互作用不顯著，而葡萄糖與硫酸銨和玉米漿干粉與硫酸銨交互作用顯著［20］。

通過Design-Expert軟件，進(jìn)行分析計算，可得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖31.66 g/L、玉米漿干粉5.63 g/L，（NH4）2SO45.34 g/L，在此條件下，CoQ10產(chǎn)量的預(yù)測最大值為94.57 mg/L?？紤]到實(shí)際培養(yǎng)基的配制，最終確定這3個因素的質(zhì)量濃度分別為：葡萄糖31.7 g/L、玉米漿干粉5.6 g/L、（NH4）2SO45.3 g/L。

圖7　葡萄糖、玉米漿干粉和硫酸銨質(zhì)量濃度交互作用對輔酶Q10產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between of glucose，corn steep powder and（NH4）2SO4content on the yield of CoQ10

（3）優(yōu)化培養(yǎng)基的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，按上述最終培養(yǎng)基參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的CoQ10產(chǎn)量分別為94.41 mg/L、93.53 mg/L、92.96 mg/L，平均值為（93.63±0.59）mg/L，與預(yù)測值只相差1%，表明此模型是可行有效的，能夠較好的描述試驗(yàn)結(jié)果。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)采用NTG化學(xué)誘變，結(jié)合VK3+NaN3+PHBA三種抗性的代謝控制育種方法，考察了不同顏色突變株生產(chǎn)CoQ10的產(chǎn)量變化情況。篩選獲得一株CoQ10高產(chǎn)白色誘變菌株R.sp3-7，其CoQ10產(chǎn)量為71.23 mg/L，遺傳穩(wěn)定性良好，比出發(fā)菌株提高了64.922%。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用BB試驗(yàn)設(shè)計，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，通過響應(yīng)面法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化與評價，得到影響CoQ10產(chǎn)量的二次多項(xiàng)式回歸模型，并對該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。最終得到優(yōu)化的培養(yǎng)基為：葡萄糖31.7 g/L，玉米漿干粉5.6 g/L，（NH4）2SO45.3 g/L，MgSO4·7H2O 12.5 g/L，谷氨酸鈉3 g/L，NaCl 3 g/L，KH2PO43 g/L，CaCO32 g/L，輔液1 mL/L。在此條件下，測得CoQ10產(chǎn)量為（93.63±0.59）mg/L，與預(yù)測值（94.57 mg/L）相差不大。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化類球紅細(xì)菌培養(yǎng)基組成穩(wěn)定可行。綜上所述，代謝控制育種方法和響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基都為后續(xù)進(jìn)一步深入研究打下了良好的基礎(chǔ)。同時，也可為其他菌種的選育提供一定參考借鑒。

［1］CLUIS C P，EKINS A，NARCROSS L，et al.Identification of bottlenecks inEscherichiacoliengineered for the production ofCoQ10［J］.Metab Eng，2011，13（6）：733-744.

［2］LOHAN S B，BAUERSACHS S，AHLBERG S，et al.Ultra-small lipid nanoparticles promote the penetration of coenzyme Q10in skin cells and counteract oxidative stress［J］.Eur J Pharm Biopharm，2015，89（12）：201-207.

［3］萬艷娟，吳軍林，吳清平.輔酶Q10生理功能及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（14）：390-395.

［4］ZHONG W，F(xiàn)ANG J，LIU H，et al.Enhanced production of CoQ10by newly isolatedSphingomonassp.ZUTEO3 with a coupled fermentation extraction process［J］.J Ind Microbiol Biot，2009，36（5）：687-693.

［5］JEYA M，MOON H J，LEE J L，et al.Current state of coenzyme Q10 production and its applications［J］.Appl Microbiol Biot，2010，85（6）：1653-1663.

［6］鄭君，管斌，孔青，等.高產(chǎn)輔酶Q10光合細(xì)菌的選育［J］.中國釀造，2008，21（5）：83-86.

［7］YOSHIDA H，KOTANI Y，OCHIAI K，et al.Production of ubiquinone-10 using bacteria［J］.J Gen Appl Microbiol，1998，44（1）：19-26.

［8］NDIKUBWIMANA J D D，LEE B H.Enhanced production techniques，properties and uses of coenzyme Q10［J］.Biotechnol Lett，2014，36（10）：1917-1926.

［9］曹燕妮，岳田利，袁亞紅，等.輔酶Q10高產(chǎn)菌株的誘變選育［J］.食品科學(xué)，2012，33（11）：121-125.

［10］WEI Q I，JING L I，JIAN L I，et al.Breeding of the analogue-resistant strains for high production of coenzyme Q10［J］.Ind Microbiol，2007，37（6）：12-15.

［11］WEN Q L，LI D Y，HAO M X，et al.Enhanced production of coenzyme Q10by self-regulating the engineered MEP pathway inRhodobacter sphaeroides［J］.Biotechnol Bioeng，2014，111（4）：761-769.

［12］郜曉峰，范成英，何開澤，等.薄層色譜紫外分光光度法定量測定微生物發(fā)酵產(chǎn)物輔酶Q10［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2006，12（3）：420-423.

［13］李繼揚(yáng)，丁妍，周珮.通過耐受前體或結(jié)構(gòu)類似物篩選提高輔酶Q10產(chǎn)量［J］.復(fù)旦學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2008，35（3）：393-395.

［14］黨磊，田菁，印紅，等.利用空間誘變選育輔酶Q10高產(chǎn)菌［J］.科技導(dǎo)報，2010，28（14）：40-43.

［15］楊威，柯崇榕，邵慶偉，等.類球紅細(xì)菌產(chǎn)輔酶Q10發(fā)酵工藝的優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（2）：75-79.

［16］RAMBIR K，DUBEY K K，BHANSALI A G，et al.Process conditions optimization for CoQ10production byParacoccussp.［J］.J Biotechnol，2008，136（4）：S513-S514.

［17］張輝，桑青.響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉HQ-1產(chǎn)纖維素酶固體發(fā)酵條件［J］.中國釀造，2011，30（7）：17-22.

［18］李俊峰，姚淑敏，李紅芳.產(chǎn)輔酶Q10海洋酵母的篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2008，29（12）：426-430.

［19］WU H S，TSAI J J.Separation and purification of coenzyme Q10from Rhodobacter sphaeroides［J］.J Taiwan Inst Chem Eng，2013，44（6）：872-878.

［20］康遠(yuǎn)軍，楊華，李欣，等.基于響應(yīng)面法的魯氏酵母發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.中國釀造，2015，34（4）：25-29.

FU Jiaolong，QIAN Dawei*，WU Chenqi，XU Minqiang，HU Cuiying，LI Liangzhi
（School of Chemical and Biological Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009，China）

Using multiple resistance of vitamin K3，NaN3and p-hydroxybenzoie acid（PHBA）as selective marker，CoQ10-producingRhodobacter sphaeroideswas mutated by nitrosoguanidine（NTG），and the high CoQ10-producing strains was screened.The fermentation medium was optimized by response surface methodology.Results showed that a strain R.sp3-7 with genetic stability and high CoQ10-production was obtained by mutation breeding.The optimum component of fermentation medium was glucose 31.7 g/L，corn steep powder 5.6 g/L，（NH4）2SO45.3 g/L，sodium glutamate 3.0 g/L，NaCl 3.0 g/L，MgSO4·7H2O 12.5 g/L，KH2PO43.0 g/L，CaCO32.0 g/L and auxiliary fluids 1 ml/L.Under the conditions，the yield of CoQ10produced by mutant strain R.sp3-7 was up to（93.63±0.59）mg/L，which was increased by 116.8%than that produced by original strain.

CoQ10；resistant plate；chemical mutagenesis；response surface methodology；Rhodobacter sphaeroides

TS201.3

0254-5071（2016）06-0090-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.019

2016-03-27

蘇州市科技計劃項(xiàng)目（sYN201317）；蘇州科技學(xué)院科研基金項(xiàng)目（XKZ201411）

扶教龍（1969-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锘?、發(fā)酵工程。

錢大偉（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘?、微生物育種。