L-谷氨酸氧化酶與CBD的融合表達及其在微晶纖維素上固定化分析

宋輝，張文宇，王鵬舉，譚煥波，蘇文成，趙樹欣，鄒培建

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L-谷氨酸氧化酶與CBD的融合表達及其在微晶纖維素上固定化分析

宋輝1,2，張文宇2，王鵬舉2，譚煥波2，蘇文成2，趙樹欣1，鄒培建2

1 天津科技大學生物工程學院，天津 300457;2 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300308

酶的固定化作為一種重要的技術，已在生物催化領域得到了廣泛的應用?，F(xiàn)將來源于普拉特鏈霉菌3304 (NTU3304) 產(chǎn)生的胞外L-谷氨酸氧化酶 (L-glutamate oxidase，Gox) 基因融合到來源于糞堿纖維單胞菌的纖維素結(jié)合域 (CBDcex) 的基因上，構(gòu)建表達載體pETM10-Gox-CBD，并在大腸桿菌中表達。通過蛋白純化獲得融合蛋白，并命名為Gox-CBD。利用CBD對微晶纖維素特異性吸附的特性將其固定在微晶纖維素上，并對固定化酶的制備條件、結(jié)合量、酶學性質(zhì)及其微晶纖維素結(jié)合穩(wěn)定性等進行了研究。在4 ℃條件下結(jié)合約1 h，融合蛋白Gox-CBD結(jié)合在纖維素上的結(jié)合量即可達到9.0 mg/g。通過對重組型、融合表達游離的以及固定化在微晶纖維素上的谷氨酸氧化酶的酶學性質(zhì)進行比較發(fā)現(xiàn)，固定化酶的比酶活有所降低；但固定化酶的熱穩(wěn)定性相對于游離酶有了很大的提高，在60 ℃孵育30 min后還保留有約70%的活性，而游離的重組Gox在相同條件下幾乎完全失去活性。當固定化結(jié)合蛋白在pH<10或者鹽濃度>5 mmol/L的NaCl條件下可以牢固結(jié)合。并且可以通過一步純化方法固定化融合蛋白Gox-CBD于微晶纖維素上。因此，L-谷氨酸氧化酶與纖維素結(jié)合域融合表達的研究為蛋白的純化及酶的固定化提供了一種新策略。

L-谷氨酸氧化酶，纖維素結(jié)合域，固定化

L-谷氨酸氧化酶 (EC 1.4.3.11) (簡稱Gox) 作為一種工具酶，它是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基的黃素蛋白酶類，其作為一種工具酶，能專一地將谷氨酸氧化脫氨基生成α-酮戊二酸，同時伴隨著氨氣和過氧化氫的產(chǎn)生[1]。其催化反應式為：

谷氨酸氧化酶廣泛應用于食品、化學和醫(yī)藥等領域[2]。利用谷氨酸氧化酶對谷氨酸的特異性催化反應原理建立的傳感器及試劑盒可以在谷氨酸的生產(chǎn)中對谷氨酸的生產(chǎn)發(fā)酵進行實時監(jiān)測[3]，在臨床上可以對血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶進行活性檢測，從而可以診斷身體組織如心臟和肝臟的健康狀況[4]。根據(jù)Gox能將L-谷氨酸氧化脫氨基作用生成α-酮戊二酸的原理，Niu等[5]對酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸進行了研究，從而給α-酮戊二酸的生產(chǎn)提供了一個綠色生產(chǎn)工藝。由于Gox是一種應用比較廣泛的工具酶，因而從它的發(fā)現(xiàn)至今，仍然是一種研究比較熱門的工具酶之一。

Gox已在毒蛇、動植物組織和微生物等[2, 6-9]中發(fā)現(xiàn)，微生物中主要來源于鏈霉菌屬。而對來源于普特拉鏈霉菌NTU3304胞外產(chǎn)生的Gox研究發(fā)現(xiàn)，它具有較高的比酶活和較強底物專一性等優(yōu)于其他Gox的酶學特性[10]。

酶的固定化技術在工業(yè)生產(chǎn)中具有誘人的前景，它易于從反應系統(tǒng)中分離，易于控制，并能反復利用，便于自動化生產(chǎn)[11]。而纖維素是分布最廣、含量最多的多糖，是比較廉價的材料，可以作為實用的固定化酶的載體。在研究纖維素酶降解纖維素時，發(fā)現(xiàn)纖維素酶由兩個結(jié)構(gòu)域組成，即纖維素結(jié)合域 (CBD) 和纖維素催化域，兩者之間通過Linker (PT) 連在一起構(gòu)成了纖維素酶，而Linker的存在能夠更易于水解纖維素[12-13]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CBD能夠牢固地錨定纖維素底物，從而使酶能夠更好地酶解底物。根據(jù)氨基酸序列、結(jié)合特異性和結(jié)構(gòu)，將CBD分為14個家族，大部分屬于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ家族；CBD包含有30–180個氨基酸，在一個蛋白中可能存在1個、2個或者3個結(jié)合域[13]。來源于糞堿纖維單細胞的CBDcex屬于Ⅱa家族，由β-筒狀構(gòu)成基本骨架[14]。已有一些酶與CBD融合表達，并對其酶學特性進行了研究及分析[15-19]。由于CBD能結(jié)合在纖維素載體上，它不僅可以作為親和標簽來純化蛋白[20-21]，而且也用于酶的固定化研究[22]，通過加入Linker和酶切位點融合表達目的蛋白，從而節(jié)約了蛋白純化的成本。

目前對Gox的固定化研究主要采用化學交聯(lián)的方法，如通過戊二醛交聯(lián)法[23-24]將谷氨酸氧化酶固定化，形成酶膜，然后置于安培電極上進行L-谷氨酸的檢測。但目前還沒有將Gox與CBD重組表達的方式進行固定化的報道。

本論文主要是通過基因工程的方法將來源于NTU3304的Gox (GenBank Accession No. AF239797.1) 的基因[2]成功地在大腸桿菌內(nèi)表達；并將該基因與來源于革蘭氏陽性菌中纖維素結(jié)合蛋白域[25](CBDcex) 融合表達，融合蛋白為Gox-CBD，然后通過對融合蛋白進行一步純化、酶學特性測定以及融合蛋白結(jié)合微晶纖維素 (MCC) 的酶學測定，并對融合蛋白結(jié)合MCC的穩(wěn)定性進行了研究和探討，以期對固定化L-谷氨酸氧化酶在工業(yè)生產(chǎn)應用中提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pETM10-CBDcex和pET-24a(+)由本實驗室保存。菌株BL21(DE3)、DH5α購自北京全式金生物科技有限公司。LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物 (均購自OXOID) 5 g/L，NaCl 10 g/L) 用于的培養(yǎng)?？股睾驼T導劑的儲存濃度：硫酸卡那霉素50 mg/mL，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 為1 mol/L。4-氨基安替比林和20種氨基酸購自Sigma。苯酚購自上海泰坦科技有限公司。過氧化氫標準液購自Alfa Aesar公司。辣根過氧化物酶購自南京建成生物工程研究所。

Trans2K Plus DNA Marker和T4 DNA ligase購自北京全式金生物技術有限公司。限制性內(nèi)切酶和蛋白Marker均購自Thermo Scientific公司。瓊脂糖購于天根生化科技(北京) 有限公司。高純度質(zhì)粒小提試劑盒購買自Axgen公司。PCR高純度片段回收試劑盒購買自Omega公司。BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀生物技術有限公司。HisTrapTMFF購自GE公司。PCR擴增引物合成和DNA測序由金唯智生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 表達質(zhì)粒pET-24a(+)-Gox和pETM10- Gox-CBD的構(gòu)建

為了便于Gox的異源表達及其后期純化，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，將Gox的堿基序列進行優(yōu)化，由上海捷瑞生物技術有限公司進行全基因合成。通過Ⅰ/Ⅰ酶切位點構(gòu)建在pET-24a(+) 上，并命名為pET-24a(+)-Gox。

以pET-24a(+)-Gox為模板，使用PCR擴增引物 (表1) 擴增Gox基因片段。PCR反應程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s，63 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳，檢測目的條帶。檢測到目的條帶以后，使用cycle- pure核酸一步純化試劑盒將目的基因片段回收，得到完整的基因片段。用Ⅰ和dⅢ核酸內(nèi)切酶對目的基因片段和載體pETM10-CBDcex進行酶切，37 ℃酶切1 h。使用cycle-pure核酸一步回收試劑盒回收目的基因片段，載體使用膠回收試劑盒回收。將片段和載體使用T4 DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α，對得到的克隆進行菌落PCR驗證，將陽性克隆進行DNA序列測定，確定構(gòu)建正確的序列，并命名為pETM10-Gox-CBD。

表1 PCR引物的設計

Note: the underlined bases representⅠ andd Ⅲcutting site respectively.

1.2.2 重組蛋白Gox與Gox-CBD的表達與純化

將pET-24a(+)-Gox與pETM10-Gox-CBD表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) 中，對目的蛋白的表達情況進行研究。異源蛋白可溶性表達是由多因素決定的，它與基因序列、載體、蛋白結(jié)構(gòu)、宿主及培養(yǎng)條件等密切相關[26]，為了提高目的蛋白的可溶性，重組蛋白Gox和Gox-CBD的表達分別采用16 ℃，IPTG濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)12 h和16 ℃，IPTG濃度為 0.1 mmol/L培養(yǎng)12 h的條件進行誘導表達。

根據(jù)蛋白表達條件進行菌體的培養(yǎng)，然后用緩沖液A (50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 100 mmol/L NaCl)懸浮充分，加入終濃度為 1 mmol/L的苯甲基磺酰氟 (PMSF)，高壓勻漿破碎儀破碎3遍，低溫離心 (4 ℃、15 000 r/min離心1 h)，收集上清，然后用0.45 μm的濾膜過濾除雜質(zhì)。采用HisTrapTMFF親合層析柱純化蛋白，用緩沖液B (50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 100 mmol/L NaCl, 500 mmol/L咪唑) 梯度洗脫，根據(jù)峰圖收集有活性洗脫液，并進行SDS-PAGE檢測。

1.2.3 結(jié)合量測定及蛋白定量

稱取1.0 g微晶纖維素 (MCC) 于15 mL離心管中，先用去離子水洗2遍 (5 000 r/min離心5 min)，然后使用緩沖液C (20 mmol/L KPB, 100 mmol/L NaCl, pH 7.4) 平衡MCC，離心并倒去上清液。將10 mL純化的蛋白 (蛋白濃度為 1.435 mg/mL) 與MCC于4 ℃孵育4 h，期間取樣 (10、20、25、30、60、90、120和240 min) 測定結(jié)合量。結(jié)合完成后，4 ℃離心，倒去并保留上清液，然后使用含有1 mol/L NaCl的緩沖液D (20 mmol/L KPB, 1 mol/L NaCl, pH 7.4) 對非特異結(jié)合蛋白進行洗脫。將各部分收集，測定蛋白濃度。蛋白結(jié)合量即為結(jié)合前的蛋白總量減去離心上清液與洗脫上清液的蛋白總和。結(jié)合蛋白使用10%的SDS-PAGE分析檢測。

蛋白定量方法：蛋白測定法采用Bradford法測定。

1.2.4 酶活測定

通過4-氨基安替吡啉苯酚法來測定過氧化氫的增加量[8]。將1 mL的反應液在30 ℃反應10 min，測定其在505 nm下每分鐘吸光值的增加量。Gox一個酶活單位的定義為：30 ℃下每分鐘釋放1 μmol過氧化氫所需的酶量。1 mL的反應液體系包括10 U/mL的過氧化物酶、 25 mmol/L的L-谷氨酸、2 mmol/L的4-氨基安替吡啉、10 mmol/L的苯酚和適量的酶于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中。

1.2.5 重組酶Gox和Gox-CBD的酶活性質(zhì)

分別對異源表達的Gox、游離的Gox-CBD和固定到MCC的Gox-CBD進行酶活性檢測。通過對溫度、熱穩(wěn)定性、pH、金屬離子的影響和底物特異性來對重組表達的GOX、Gox-CBD和固定在微晶纖維素上的Gox-CBD進行檢測 (以下實驗每組平行測定多次)。

最適反應溫度：按照酶活測定方法，將等量的純酶分別于20–80 ℃的條件下測定酶活，以所測的不同反應溫度下的最高酶活為100%，研究不同溫度對酶的影響。

熱穩(wěn)定性測定：按照酶活測定方法，將等量的酶置于20–80 ℃條件下，在不同溫度下孵育30 min，然后測定剩余酶的酶活，以最高酶活為100%，研究其熱穩(wěn)定性。

最適反應pH：按照酶活測定方法，將純化的酶置于pH 4.5–8.5 (pH 4.5–5.5為0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液；pH 6.0–8.0為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液；pH 8.0–9.0為含有0.1 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl) 范圍內(nèi)，在最適反應溫度下測定酶活，以所測的最高酶活為100%，研究不同pH下對其活性的影響。

金屬離子的影響：按照酶活測定方法，在反應液中加入不同的金屬離子，以對照組不含金屬離子為100%，研究金屬離子對其的影響。

底物特異性：按照酶活測定方法，將以L-谷氨酸為底物的換成其他的氨基酸，測定不同底物對其的影響，以L-谷氨酸為底物測定的酶活為100%。

操作穩(wěn)定性：按照酶活測定方法，將固定化酶置于反應液中，然后離心倒去反應液，將固定化酶用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 多次離心洗滌固定化酶，洗去表面殘留的未反應的底物和反應后的產(chǎn)物，然后，重新轉(zhuǎn)入底物溶液中測定殘留酶活力，如此反復操作，以初始酶活為100%，考察隨著使用次數(shù)的增加，固定化酶的酶活力保留情況。

1.2.6 結(jié)合穩(wěn)定性測定

將固定化的Gox進行結(jié)合穩(wěn)定性研究，纖維素結(jié)合域有可能會被雙蒸水、低鹽 (<5 mmol/L) 或pH>9的緩沖液等洗脫掉[27]，為了使纖維素結(jié)合域能夠牢固地結(jié)合在纖維素，通過測定這些條件對結(jié)合蛋白的影響，并確定Gox結(jié)合到MCC上穩(wěn)定性的參數(shù)，以便為以后的應用提供參考。

低鹽的影響：配制50 mmol/L的Tris-HCl (pH 7.4)，然后進行洗脫，再對洗脫液進行SDS-PAGE、蛋白定量以及酶活測定，測定使用該緩沖液對結(jié)合蛋白的影響。

低鹽耐受度檢測：配制含有1 mol/L NaCl的去離子水，然后對結(jié)合蛋白進行梯度 (NaCl梯度為1 mol/L、0.5 mol/L、0.2 mol/L、0.1 mol/L、90 mmol/L、50 mmol/L、30 mmol/L、20 mmol/L、15 mmol/L、10 mmol/L、5 mmol/L、0 mmol/L) 洗脫，每個梯度以10倍體積 (CV) 進行洗脫，對蛋白洗脫液進行蛋白濃度測定。

pH對結(jié)合量的影響：在緩沖液緩沖范圍內(nèi)，配制pH 4.5–12 (pH 4.5–5.5為0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液；pH 6.0–8.0為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液；pH 8.0–9.0為含有0.1 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl；pH 9.0–10.0為0.1 mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液；pH 11.0為0.1 mol/L的磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液；pH 12.0為0.1 mol/L的氯化鉀-氫氧化鈉緩沖液) 的緩沖液，對結(jié)合蛋白進行洗脫檢測。

1.2.7m值的測定

在標準酶活測定方法的條件下，測定底物L-谷氨酸的濃度在3–15 mmol/L下的反應速度，按照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，分別對重組Gox、游離Gox-CBD和固定化的Gox-CBD的m和比活力進行測定。

1.2.8 一步純化融合蛋白Gox-CBD

按照1.2.2操作，將菌體經(jīng)破碎離心上清液與MCC 4 ℃孵育4 h，結(jié)合完成后，將結(jié)合液通過重力柱，然后使用含有1 mol/L NaCl的緩沖液D (20 mmol/L KPB, 1 mol/L NaCl, pH 7.4) 對非特異結(jié)合蛋白進行洗脫。各部分取樣用10%的SDS-PAGE分析檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達載體的構(gòu)建

通過序列檢索與分析，密碼子優(yōu)化Gox基因，以全基因合成的pET-24a(+)-Gox為模板，PCR擴增的基因片段，然后通過Ⅰ和dⅢ 雙酶切及T4 DNA連接酶的連接，將連接在已構(gòu)建完成的pETM10-CBDcex載體上，最終完成表達載體pETM10-Gox-CBD的構(gòu)建。Gox通過Linker連接到CBD的N端，Linker的加入確保融合蛋白保持自身的生物活性[28]。結(jié)果顯示，擴增的片段大小約2 000 bp (圖1)，與目標基因帶大小一致。然后，對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提取單菌落，進行菌落PCR驗證，將與目的條帶大小一致的送交測序，并將測序結(jié)果通過DNAMAN序列比對，測序正確的確定為陽性克隆。

圖1 gox基因的PCR擴增

2.2 融合蛋白Gox-CBDcex的表達

根據(jù)1.2.2的實驗條件，將表達載體pET-24a(+)-Gox與pETM10-Gox-CBD轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，16 ℃培養(yǎng)12 h，10%的SDS-PAGE檢驗，融合蛋白分子量大小分別約為78 kDa (圖2) 和88 kDa (圖3)，與理論分子量一致。

來源于NTU3304的Gox是由α、β、γ三個亞基構(gòu)成的，分子量約為74 kDa[2]。經(jīng)蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，它與鏈霉菌X-119-6 (sp.X-119-6) 的蛋白序列約有84%的序列一致性，并且都有α、β、γ亞基結(jié)構(gòu)。Arima等[8]在大腸桿菌重組表達實驗中發(fā)現(xiàn)，當采用灰色鏈霉菌的金屬內(nèi)肽酶進行消化處理，不僅催化活性提高了，而且恢復了同源二聚體的結(jié)構(gòu)，其酶活特性幾乎接近于野生菌株產(chǎn)生的Gox。本研究通過大腸桿菌來表達重組Gox蛋白，蛋白分子量約為78 kDa，而成熟蛋白的分子量約為74 kDa，這是由于蛋白的翻譯后修飾的作用。而在固定化研究中，融合表達蛋白Gox-CBD是以前體蛋白的形式存在的，本論文是對固定化到纖維素載體的融合蛋白的初步探索以及可行性進行研究。

圖2 誘導表達重組蛋白Gox的SDS-PAGE分析

圖3 誘導表達重組蛋白Gox-CBD的SDS-PAGE分析

2.3 融合蛋白Gox-CBD的純化

將重組表達載體pET-24a(+)-Gox和pETM10- Gox-CBD分別轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) 中。挑取單菌落培養(yǎng)在含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)作為一級種子液，然后，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至2 L的搖瓶中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至菌體濃度 (600) 約為0.6時，開始誘導表達，誘導表達條件參照2.2。

離心收獲細菌 (4 ℃，5 000 r/min，30 min)，然后加入含有終濃度為1 mmol/L的PMSF的裂解液 (50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，100 mmol/L NaCl) 懸浮菌泥。使用高壓破碎儀破碎菌液3遍，將細胞破碎液通過高速離心 (4 ℃、15 000 r/min離心1 h) 收集上清液。將上清液通過0.45 μm的濾膜過濾除雜，使用Ni-NTA親和層析純化。操作過程中各步驟分別取樣將通過10%的SDS-PAGE進行分析檢測，約在78 kDa和88 kDa處分別得到了純化蛋白Gox和Gox-CBD (圖4)。

2.4 纖維素結(jié)合融合蛋白的測定

融合蛋白具有CBD標簽，而來源于的CBDcex標簽具有很強的結(jié)合纖維素能力[29-30]，通過將過量融合蛋白Gox-CBD與MCC在4 ℃下不同時間段取樣，可以確定Gox-CBD的結(jié)合量，非特異結(jié)合的蛋白將通過加入含有1 mol/L NaCl的緩沖液D除去。通過在不同時間段對蛋白進行取樣檢測，確定其吸附結(jié)合到MCC上的蛋白結(jié)合量。結(jié)果表明，融合蛋白結(jié)合到MCC的量約為9.0 mg/g (圖5)。

圖4 SDS-PAGE分析：Ni-NTA柱親和純化重組蛋白Gox-CBD和Gox

圖5 Gox-CBD結(jié)合微晶纖維素 (MCC) 的結(jié)合量

2.5 Gox與Gox-CBD的酶學特性測定

2.5.1 不同pH對酶活性的影響

使用不同pH的緩沖液 (pH 4.5–5.5為0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液；pH 6.0–8.0為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液；pH 8.0–9.0為含有0.1 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl)對重組表達的Gox、游離和固定化到MCC上的Gox-CBD的酶活進行測定，按照酶學測定方法進行操作。實驗結(jié)果表明，在pH約6.5時，酶活達到最大，為該酶的最適反應pH；當隨著pH的升高時，酶活不斷下降 (圖6)。

圖6 pH值對酶活性的影響

2.5.2 最適反應溫度和熱穩(wěn)定性

本實驗對重組表達的Gox、游離和固定化到MCC上的Gox-CBD的最適反應溫度進行了測定，測定方法按照標準酶活測定方法操作。結(jié)果表明，在溫度為20–40 ℃時，隨著溫度的升高，酶活也在逐步升高；當?shù)竭_40 ℃時，酶活達到最大值，隨著溫度的升高，不同重組Gox、游離Gox-CBD和固定化Gox-CBD的酶活逐漸降低 (圖7)。

同時，將重組Gox、游離和固定化Gox-CBD置于20–80 ℃條件下30 min，待溫度降至室溫后進行酶活檢測，以測定其熱穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，融合表達的游離和固定化的Gox的熱穩(wěn)定性有一定提高，而固定化Gox-CBD比游離Gox-CBD具有更高的熱穩(wěn)定性；特別是在60 ℃時，重組表達的Gox幾乎失去了活性，而固定化的Gox酶活保存有70%左右的活性 (圖8)。

圖7 溫度對酶的活性影響

圖8 酶的熱穩(wěn)性

2.5.3 金屬鹽對酶活性的影響

在酶的反應液中加入終濃度為1 mmol/L的金屬鹽溶液，測定金屬鹽離子對酶活性的影響，采用標準酶活測定方法進行酶活測定，以未加入金屬鹽溶液的反應為對照，并記作100%。結(jié)果顯示，HgCl2和CuCl2對重組Gox、游離Gox-CBD和固定化Gox-CBD的酶活具有明顯的抑制作用 (圖9)。

圖9 不同金屬離子對酶活性的影響

表2 Gox底物特異性分析

2.5.4 酶的底物特異性

由表2可知，Gox除對L-谷氨酸起作用外，還對L-谷氨酰胺有微弱的活性，對其他的氨基酸則沒有反應。而來源于NTU3304胞外產(chǎn)生Gox，具有優(yōu)于其他L-谷氨酸氧化酶更好的性能[10]。針對重組表達的L-谷氨酸氧化酶，很有可能是因為產(chǎn)生前體蛋白，而沒有經(jīng)過翻譯后修飾，以及蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了微弱的變化引起的，從而影響底物特異性。

圖10 固定化Gox-CBD的操作穩(wěn)定性

2.5.5 操作穩(wěn)定性研究

在實際應用中酶的重復使用效率是評價固定化酶的重要指標之一[31]，尤其是在工業(yè)應用中。從圖10中可以看出，經(jīng)5次重復性操作后，固定化酶的酶活依然可以保存有較高的活性，從驗證結(jié)果中可以說明固定化酶Gox-CBD具有較好的操作穩(wěn)定性。

2.6 固定化酶Gox-CBD結(jié)合穩(wěn)定性研究

纖維素結(jié)合蛋白能牢固地結(jié)合在微晶纖維素上，但由于在不同操作條件下對結(jié)合到MCC上的Gox結(jié)合穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[27]。因此，本實驗研究了不同操作條件對固定化Gox-CBD與MCC的結(jié)合穩(wěn)定進行了研究。試驗結(jié)果顯示 (圖11)，使用在Tris-HCl (pH 7.4) 的條件下，Gox-CBD與MCC結(jié)合穩(wěn)定性較高，即使洗脫40 CV，固定化酶的結(jié)合量也沒有發(fā)生變化。對于鹽耐受程度，使用1 mol/L的NaCl進行梯度洗脫，實驗結(jié)果表明，通過梯度洗脫的過程中沒有檢測到結(jié)合蛋白從纖維素載體上洗脫下來，直到NaCl濃度降到5 mmol/L時，開始檢測到了有Gox-CBD洗脫下來 (圖12)，很有可能由于氫鍵或者疏水作用的原因[15]，但洗脫過程中融合蛋白洗脫下來是一個很緩慢的過程，當最后使用200 CV去離子水繼續(xù)洗時，發(fā)現(xiàn)還是有殘留蛋白結(jié)合在纖維素載體上。從圖13中可以看出pH對結(jié)合蛋白的影響，在pH為4–10時，Gox-CBD與MCC結(jié)合穩(wěn)定，但當pH≥10時，開始有蛋白從纖維素載體上洗脫下來，但由于在pH≥10時，L-谷氨酸氧化酶幾乎已失去活性，因此，只要保證在Gox活性范圍內(nèi)則可保證牢固結(jié)合到微晶纖維素上。

2.7 Km值的測定

m是酶對底物親和力程度的重要特征性常數(shù)，m越大表示酶與底物親和力越弱，m越小表示酶與底物的親和力越強。根據(jù)Lineweaver- Burk雙倒數(shù)作圖法，通過酶活測定結(jié)果分別計算1/和1/[]，計算得到Gox、游離Gox-CBD和固定化Gox-CBD的m(表3)。結(jié)果表明，固定化和游離的Gox-CBD的m值高于重組表達的Gox，融合表達重組酶對底物的親和力低于重組Gox，固定化后比酶活略有降低。這很有可能是由于在固定化的過程中只有CBD參與完成的定向固定化[32]，對酶的結(jié)構(gòu)影響不是太大。

表3 酶常數(shù)的測定

2.8 一步純化融合蛋白Gox-CBD

融合蛋白Gox-CBD的一步純化操作：將上述操作的蛋白直接與MCC結(jié)合，并對蛋白結(jié)合過程中各部分取樣進行SDS-PAGE檢測 (圖14)。從圖中可以看出，通過一步純化可以得到純度比較高的蛋白，因此在后期應用中可以通過簡單破碎處理，然后將破碎液與MCC進行孵育結(jié)合，從而實現(xiàn)目的蛋白的快速高效的純化，節(jié)約時間，并將蛋白純化成本降到最低。

圖14 SDS-PAGE分析Gox-CBD的一步純化固定到MCC上

3 結(jié)論

本文通過構(gòu)建CBD與Gox的重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)中，并成功進行了融合蛋白Gox-CBD的重組表達。優(yōu)化表達條件為誘導物IPTG終濃度為0.1 mmol/L條件下，16 ℃誘導表達過夜。通過對重組表達的Gox、游離Gox-CBD和固定到微晶纖維素上的Gox-CBD進行相關酶學性質(zhì)的分析。純化的融合蛋白 (Gox-CBD)，在4 ℃條件下，固定1 h左右?guī)缀蹩梢越Y(jié)合飽和，達到9.0 mg/g；該重組酶Gox、游離酶Gox-CBD和固定化酶Gox-CBD的最適反應pH、最適溫度明顯變化；固定化酶Gox-CBD相對于重組蛋白Gox的比酶活略有降低，但在熱穩(wěn)定性上固定化酶比游離酶提高了很多，在60 ℃放置30 min還保留有75%的活性，而游離酶則完全喪失了活性。并可以通過一步純化的方法將融合蛋白Gox-CBD固定到微晶纖維素上，得到比較純的蛋白，該方法具有操作方法簡便、經(jīng)濟實惠、節(jié)約成本、蛋白結(jié)合量高等特點。

而目前的固定化研究中主要以戊二醛為交聯(lián)劑的化學法。戊二醛是一種雙功能偶聯(lián)劑，它對酶來說是一種變性劑，在固定化的過程中是由戊二醛的醛基與蛋白氨基的相互作用，這樣容易造成目的蛋白活性位點的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并且還很有可能由于醛基與氨基的錯綜交互，酶分子的活性中心受到醛基的束縛，活性中心受到破壞，產(chǎn)生空間位阻，極大地降低了酶蛋白的活性及改變酶的底物特異性，甚至導致酶分子失活[33]。而與重組表達的Gox相比，融合蛋白Gox-CBD固定到MCC的研究中，其還保留有較高的酶活活性。

通過對固定化Gox的物化特性進行分析，對于以后的應用是必不可少的。本文根據(jù)纖維素結(jié)合蛋白的特性，以廉價的纖維素為載體研究酶的固定化，為以后以纖維素為載體固定化L-谷氨酸氧化酶提供了研究基礎，如：1) 可以通過親和吸附的方法將酶固定到纖維素載體上制作成酶膜，用于傳感器，對工業(yè)發(fā)酵L-谷氨酸產(chǎn)品進行監(jiān)測分析及在臨床醫(yī)學上的應用等；2) 利用固定化Gox也可以對α-酮戊二酸酶催化的方法進行生產(chǎn)，便于后期產(chǎn)物的分離純化，實現(xiàn)生態(tài)友好型生產(chǎn)α-酮戊二酸。通過本文的研究，為固定化酶的研究及應用提供了新策略。

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(本文責編 郝麗芳)

Analysis of immobilized L-glutamate oxidase fused with cellulose binding domain on microcrystalline cellulose

Hui Song1,2, Wenyu Zhang2, Pengju Wang2, Huanbo Tan2, Wencheng Su2, Shuxin Zhao1, and Peijian Zou2

1 College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China;2 National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Immobilization of enzymes is important and widely applied in biocatalysis.gene, encoding an extracellular L-glutamate oxidase (Gox), was fusedto cellulose binding domain (CBDcex) fromand the recombinant protein Gox-CBD was expressed in. The fusion protein (Gox-CBD) was immobilized onto microcrystalline cellulose. The preparation conditions, binding capacity, properties and stability of the immobilized enzyme were studied. Under the condition of 4 ℃, for 1 hour, the fusion protein Gox-CBD was able to bind microcrystalline cellulose at a ratio of 9.0 mg of protein per gram of microcrystalline cellulose. Enzymatic properties of free and immobilized L-glutamic oxidase (Gox-CBD) were compared. The specific activity of the immobilized enzyme decreased, but its thermal stability increased a lot compared with that of the free Gox-CBD. After incubation at 60 ℃ for 30 min, 70% of the total activity remained whereas the free recombinant Gox completely lost its activity. The immobilized protein was tightly bound to microcrystalline cellulose at pH below 10 or more than 5 mmol/L NaCl. The fusion protein of Gox-CBD can be specifically immobilized on the microcrystalline cellulose on a single step. Therefore, our findings can provide a novel strategy for protein purification and enzyme immobilization.

L-glutamate oxidase, cellulose binding domain, immobilized

March 1, 2016; Accepted:May 12, 2016

Peijian Zou. Tel/Fax: +86-22-24828722; E-mail: zou_pj@tib.cas.cn

Supported by:Tianjin Municipal Science & Technology Project (No. 14ZCZDSY00057).

天津科技支撐計劃項目 (No. 14ZCZDSY00057) 資助。