HPLC法同時測定磷酸哌喹有關(guān)物質(zhì)與含量

黃 軍

（桂林南藥股份有限公司，桂林 541004）

HPLC法同時測定磷酸哌喹有關(guān)物質(zhì)與含量

黃 軍

（桂林南藥股份有限公司，桂林 541004）

目的：建立同時測定磷酸哌喹有關(guān)物質(zhì)與含量的HPLC方法。方法：采用反相高效液相色譜法，測定磷酸哌喹有關(guān)物質(zhì)與含量，并分別計算其雜質(zhì)A～I(xiàn)的相對保留時間及校正因子。色譜條件：采用Welch Ultimate XBC18（100mm×4.6mm，3μm）柱，以0.1%三氟乙酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，線性梯度洗脫。流速1.5ml·min-1，柱溫35℃，檢測波長240nm。結(jié)果：磷酸哌喹與其各雜質(zhì)峰分離度良好；磷酸哌喹與雜質(zhì)A～I(xiàn)在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999）； 磷酸哌喹，雜質(zhì)A～I(xiàn)的檢測限分別為3.4 ng·ml-1、1.0 ng·ml-1、4.9 ng·ml-1、3.1 ng·ml-1、1.4 ng·ml-1、3.8 ng·ml-1、1.7 ng·ml-1、2.8 ng·ml-1、1.9 ng·ml-1、2.0 ng·ml-1；雜質(zhì)A～I(xiàn)加樣回收率在95.5%～99.4%之間，RSD（n=9）分別為2.8%、2.7%、1.9%、3.5%、1.8%、1.8%、1.8%、2.5%、1.1%；3批樣品含量測定結(jié)果分別為99.9%，99.6%和99.8%。供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)論：本方法靈敏度好，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為磷酸哌喹的質(zhì)量控制。

磷酸哌喹；HPLC；有關(guān)物質(zhì)；含量

磷酸哌喹用于瘧疾的治療，也可作癥狀抑制性預(yù)防用，尤其是耐氯喹蟲株惡性瘧的治療與預(yù)防［1］。因磷酸哌喹單方制劑易產(chǎn)生抗藥性，磷酸哌喹通常與雙氫青蒿素、甲氧芐啶等組成復(fù)方制劑使用，如磷酸哌喹與雙氫青蒿素合用，具有顯著的協(xié)同增效作用，可延緩瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生［2-6］。

目前關(guān)于磷酸哌喹含量測定的報道較多見［7-12］，但磷酸哌喹有關(guān)物質(zhì)的檢測方法則鮮有報道，且現(xiàn)有的報道中未見對雜質(zhì)進(jìn)行定性和定量［13-15］?，F(xiàn)行的《中國藥典》2015年版二部中磷酸哌喹有關(guān)物質(zhì)采用的是高效液相色譜法，但只對3個已知雜質(zhì)進(jìn)行控制，含量測定則采用滴定法［16］。隨著人們對藥品安全問題越來越關(guān)注，今后對藥物雜質(zhì)的控制要求也將越來越嚴(yán)格。筆者經(jīng)過摸索，建立了磷酸哌喹有關(guān)物質(zhì)與含量測定的高效液相色譜方法。該法采用加校正因子的主成分自身對照法，可對磷酸哌喹原料中可能出現(xiàn)的9個已知雜質(zhì)進(jìn)行較準(zhǔn)確的控制，同時可以用于測定磷酸哌喹的含量。

1　儀器、試劑與方法

1.1儀器

高效液相色譜儀：日本島津LC-20A，紫外檢測器；安捷倫1260，DAD檢測器。紫外可見分光光度計：北京普析，TU-1901。電子天平：瑞士梅特勒，XS105。Mill-Q超純水器：美國密理博公司。

1.2藥品與試劑

磷酸哌喹對照品為中國藥品生物制品檢定所對照品（批號100751-200501，含量91.2%），磷酸哌喹的雜質(zhì)A（7-氯-4-（1-哌嗪基）喹啉，7-Chloro-4（1-piperazinyl）quinoline，含量98.9%）、雜質(zhì)B（7-氯-4-（4-（3-（哌嗪-1-基）丙基）哌嗪-1-基）喹啉，7-Chloro-4-（4-（3-（piperazin-1-yl）propyl）piperazin-1-yl）quioline，含量98.6%）、雜質(zhì)C（1-［4-（7-氯喹啉-4-基）哌嗪-1-基］-3-［（4-（5-氯喹啉-4-基）哌嗪-1-基］丙烷，1-［4-（7'-chloro-quinoline-4'）piperazine］-3-［4-（5'-chloro-quinoline-4'）piperazine-1］-propane，含量98.2%）、雜質(zhì)D（7-氯-4-羥基喹啉，7-Chloro-4-hydroxy-quinoline，含量98.8%）、雜質(zhì)E（1，4-二（3-（4-（7-氯喹啉-4-基）哌嗪-1-基）丙基）哌嗪，1，4-bis［3-（4-（7'-chloro-quinoline-4'）pierazine-1）propyl］pipeazine，含量98.1%）、雜質(zhì)F（7-氯-4-（4-（3-（（7-氯喹啉-4-基）氧代）丙基）哌嗪-1-基）喹啉，7-chloro-4-（4-3-（（7'-chloro-quinoline-4'）oxo）propyl）pipe razine-1）quinoline，含量98.7%）、雜質(zhì)G（N1-（7-氯喹啉-4-基）-N2-（3-（4-（7-氯喹啉-4-基）哌嗪-1-基）丙基）乙烷-1，2-二胺，N1-（7'-chloro-quinoline-4'）-N2-（3-（4-（7'-chloro-quinoline-4'）piperazine-1）propyl）ethane-1，2-diamine，含量99.0%）、雜質(zhì)H（1，4-二（7-氯喹啉-4-基）哌嗪，1，4-Di（7-chloroquinoline-4-yl）piperazine，含量99.8%）、雜質(zhì)I（4，7二氯喹啉，4，7-Di-quinoline，含量99.2%）對照品均由某公司提供，磷酸哌喹原料藥（桂林南藥股份有限公司，批號150401、150402、150403，水分分別為7.4%、7.2%、7.1%）。乙腈（色譜純，批號4292053，Dikma Pure），三氟乙酸（色譜純，批號14020696，TEDIA），水為Milli-Q制備的純化水。

1.3色譜條件

色譜柱為Welch Ultimate XB-C18（100mm×4.6mm，3μm）；檢測波長：240nm；流速：1.5ml·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μl；流動相：流動相A為0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B為乙腈，按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1　梯度洗脫程序Tab 1 HPLC gradient program

1.4溶液的配制

避光操作。溶劑：水-乙腈-三氟乙酸（850:150:1）。

有關(guān)物質(zhì)測定溶液的配制：取磷酸哌喹約25mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，得到濃度約為0.5mg·ml-1的溶液，作為供試品溶液。精密量取1ml 置100ml容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

含量測定溶液的配制：取磷酸哌喹約32mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置20ml容量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，得到濃度約為32μg·ml-1的溶液。

各雜質(zhì)對照品溶液及系統(tǒng)適用性溶液的配制：取雜質(zhì)A～I(xiàn)對照品各約10mg，精密稱定，分別置100ml容量瓶中，加溶劑適量溶解并稀釋至刻度，作為各雜質(zhì)對照品溶液。取磷酸哌喹對照品約25mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，精密量取各雜質(zhì)對照品溶液2.5ml加入，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

1.5方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)（避光操作）

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 取磷酸哌喹對照品約10mg，精密稱定，配制成濃度約為0.1mg·ml-1的溶液。取上述溶液及“1.4”項下各雜質(zhì)對照品溶液，倍比稀釋得到6個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，在本色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果與定量限一起計算。以溶液濃度C（μg·ml-1）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2重復(fù)性試驗(yàn) 取150401批磷酸哌喹供試品12份，取其中6份按“1.4”項下方法配制成有關(guān)物質(zhì)測定溶液，另6份配制成含量測定溶液。取磷酸哌喹對照品約32mg，配制成含量測定濃度的溶液，作為含量測定對照品溶液。取上述溶液進(jìn)樣，計算試驗(yàn)結(jié)果。

1.5.3回收率試驗(yàn) 取雜質(zhì)A～I(xiàn)對照品各3份，約為10mg，精密稱定，分別置100ml容量瓶中，加溶劑適量溶解并稀釋至刻度，作為各雜質(zhì)對照品儲備液。精密量取各個雜質(zhì)的1份儲備液50μl加入同一裝有約25mg磷酸哌喹（批號：150401）的50ml容量瓶中，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到低濃度雜質(zhì)的測試溶液，再分別精密量取各個雜質(zhì)剩下的2份儲備液各250μl、500μl，按上述低濃度雜質(zhì)測試溶液的配制方法，分別配制成中、高濃度雜質(zhì)測試溶液。每種濃度測試溶液平行配制3份，共9份。另取各雜質(zhì)約10mg，精密稱定，按中濃度雜質(zhì)測試溶液配制方法配制成溶液，作為對照溶液。取上述溶液進(jìn)樣，計算回收率結(jié)果，磷酸哌喹已知雜質(zhì)量按重復(fù)性試驗(yàn)項下的平均雜質(zhì)量計。

1.5.4破壞實(shí)驗(yàn) 取150401批磷酸哌喹3份，每份約25mg，精密稱定，分別置50 ml量瓶中。第1份加1 mol·L-1鹽酸2ml，超聲30秒鐘搖勻，于室溫避光放置24小時后，加2ml的1mol·L-1氫氧化鈉溶液中和，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品酸破壞試驗(yàn)溶液，同時做空白試驗(yàn)；第2份加1 mol·L-1氫氧化鈉溶液2ml，超聲30秒鐘搖勻，于室溫避光放置24小時后，加2ml的1 mol·L-1鹽酸中和，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品堿破壞試驗(yàn)溶液，同時做空白試驗(yàn)；第3份加3%過氧化氫溶液2ml，超聲30秒鐘搖勻，于室溫避光放置15小時后，強(qiáng)烈振搖15min，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品氧化破壞試驗(yàn)溶液，同時做空白試驗(yàn)。取上述溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。

2　結(jié)果與討論

2.1波長的選擇與校正因子

2.1.1波長的選擇

取雜質(zhì)A～I(xiàn)及磷酸哌喹對照品各適量，分別用流動相溶解并稀釋成濃度約為5μg·ml-1的溶液。按紫外-可見分光光度法，分別在200nm～400nm波長段內(nèi)掃描，磷酸哌喹在226nm、239nm、347nm波長處有最大吸收，其各雜質(zhì)均在240nm波長附近有最大吸收。綜合上述紫外波長掃描結(jié)果，本法選擇240nm作為檢測波長。在選擇的波長上，與現(xiàn)行中國藥典及多數(shù)文獻(xiàn)的波長有所不同?，F(xiàn)行中國藥典有關(guān)物質(zhì)檢測分別采用的是317nm與349nm兩個波長，含量測定采用349nm波長。

2.1.2校正因子

因磷酸哌喹與其雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)有差異，其各自的紫外波長吸收情況也有所不同，如僅用主成分自身對照法很難準(zhǔn)確測定各雜質(zhì)含量，故有必要根據(jù)情況引入校正因子。另外，磷酸哌喹的雜質(zhì)個數(shù)較多，如使用外標(biāo)法測定雜質(zhì)含量，需要用到多個雜質(zhì)對照品，檢測成本較高。本文采用加校正因子的主成分自身對照法，可降低檢測成本，亦可較準(zhǔn)確的測定各雜質(zhì)含量。

2.2流動相的選擇

在現(xiàn)行中國藥典中，流動相使用三氯乙酸作為緩沖液，其他文獻(xiàn)則多用磷酸鹽作為緩沖液。筆者在通過試驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)使用三氟乙酸代替三氯乙酸及其他緩沖鹽，磷酸哌喹雜質(zhì)的分離效果更好，并且三氟乙酸能在一定程度上改善色譜峰的峰型，防止峰展寬或者拖尾，故選擇三氟乙酸作為緩沖液。

2.3溶液配制的操作

因磷酸哌喹遇光易變色，為避免配制的溶液遇光產(chǎn)生雜質(zhì)，其有關(guān)物質(zhì)溶液在配制時采取避光操作，這點(diǎn)現(xiàn)行中國藥典也有說明。本實(shí)驗(yàn)的操作，在無日光燈直射的條件下進(jìn)行，并使用棕色容量瓶代替透明容量瓶。

2.4雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式

對磷酸哌喹原料進(jìn)行雜質(zhì)質(zhì)量控制時，其合成起始物料及合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)均根據(jù)需要作為雜質(zhì)一起控制。本法控制的9個雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1　有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)圖Fig 1 The structures of impurities

2.5方法學(xué)考察結(jié)果與樣品測定

2.5.1專屬性

2.5.1.1空白溶劑干擾和雜質(zhì)分離度試驗(yàn)

取空白溶劑、各雜質(zhì)對照品溶液及系統(tǒng)適用性溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖2。試驗(yàn)結(jié)果，空白溶劑對磷酸哌喹及其雜質(zhì)檢測無干擾。雜質(zhì)A～I(xiàn)的相對保留時間分別為0.21、0.26、0.95、0.92、1.05、1.18、1.16、1.46、1.88。各相鄰成分色譜峰之間分離度均大于1.5，磷酸哌喹峰理論塔板數(shù)為22273。

2.5.1.2破壞實(shí)驗(yàn)

將供試品破壞實(shí)驗(yàn)色譜圖與重復(fù)性試驗(yàn)項下色譜圖相比較。破壞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，空白試驗(yàn)溶劑峰對雜質(zhì)峰的檢測無影響；在本實(shí)驗(yàn)酸、堿破壞條件下，色譜圖中磷酸哌喹主峰面積未發(fā)生明顯變化，雜質(zhì)峰未見增大，且未見有新的雜質(zhì)峰生成，說明磷酸哌喹對酸、堿較為穩(wěn)定；在氧化破壞條件下，磷酸哌喹主峰面積減少，破壞產(chǎn)生的主要產(chǎn)物為相對保留時間約為1.11的未知雜質(zhì)，以及少量的雜質(zhì)B和雜質(zhì)D（見圖3）。色譜圖中各成分色譜峰的分離度均大于1.5，主要降解峰、磷酸哌喹峰純度因子均在990閾值限值內(nèi)，為純峰。以上專屬性試驗(yàn)結(jié)果表明，本法專屬性良好。

圖2　溶劑（A）、系統(tǒng)適用性溶液（B）色譜圖Fig 2 Chromatograms of solvent（A）and suitability（B）

圖3　破壞試驗(yàn)（氧化）色譜圖Fig 3 Chromatogram for destruction test（oxidation）of piperaquine phosphate

2.5.2檢測限、定量限

取磷酸哌喹對照品溶液及各雜質(zhì)對照品溶液，逐步稀釋，在信噪比S/N約為10時，測得磷酸哌喹、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I的定量限分別為10.4ng·ml-1、3.0ng·ml-1、14.6 ng·ml-1、9.2 ng·ml-1、4.3 ng·ml-1、11.4 ng·ml-1、5.0 ng·ml-1、8.4 ng·ml-1、5.6 ng·ml-1、5.9 ng·ml-1；在信噪比S/N約為3時，測得磷酸哌喹、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I的檢測限分別為3.4 ng·ml-1、1.0 ng·ml-1、4.9 ng·ml-1、3.1 ng·ml-1、1.4 ng·ml-1、3.8 ng·ml-1、1.7 ng·ml-1、2.8 ng·ml-1、1.9 ng·ml-1、2.0 ng·ml-1。

2.5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及校正因子

磷酸哌喹斜率與各個雜質(zhì)的斜率的比值即為各個雜質(zhì)的校正因子，由此計算得到各個雜質(zhì)的校正因子。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果及各雜質(zhì)校正因子見表2。

表2　磷酸哌喹及9個雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、校正因子Tab2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients，correction factors of piperaquine phosphate and nine impurities

結(jié)果表明，在各自的線性范圍內(nèi)，磷酸哌喹及9個雜質(zhì)的峰面積與其濃度均呈良好的線性關(guān)系。

2.5.4重復(fù)性試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果，有關(guān)物質(zhì)6份供試品的總雜質(zhì)分別為0.15%、0.14%、0.15%、0.14%、0.15%、0.15%，RSD為3.5%，小于10%；含量測定6份供試品磷酸哌喹的含量分別為99.8%、99.6%、99.8%、100.4%、99.9%、100.0%，RSD為0.3%。結(jié)果表明有關(guān)物質(zhì)及含量測定重復(fù)性良好。

2.5.5回收率試驗(yàn)

結(jié)果計算得到雜質(zhì)A～I(xiàn)的平均加樣回收率（n=9）分別為96.6%、95.5%、99.1%、97.4%、98.4%、98.4%、98.5%、98.6%、99.4%，RSD分別為2.8%、2.7%、1.9%、3.5%、1.8%、1.8%、1.8%、2.5%、1.1%。說明本法準(zhǔn)確度良好。

2.5.6溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重復(fù)性試驗(yàn)項下的一份含量測定供試品溶液，于室溫放置4、8、12、18、24h后，按本方法色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果與該溶液臨用新配的進(jìn)樣結(jié)果一起計算，計算得磷酸哌喹峰面積的RSD為0.5%。表明磷酸哌喹供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

取新配制的系統(tǒng)適用性溶液，按本方法色譜條件進(jìn)樣，再于室溫分別放置4、8、12、18、24h后進(jìn)樣。結(jié)果計算得磷酸哌喹雜質(zhì)A～I(xiàn)峰面積的RSD分別為0.6%、0.3%、0.5%、0.1%、0.2%、0.4%、0.3%、0.6%、0.5%。表明磷酸哌喹雜質(zhì)溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7樣品測定

2.5.7.1樣品含量測定

取150401批、150402批、150403批供試品及磷酸哌喹對照品，按“1.4”項下方法分別配制含量測定溶液和相同濃度的含量對照品溶液，按本法色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計算含量。結(jié)果見表3。

表3　樣品含量測定結(jié)果（n=3）Tab 3 The sample determination results

2.5.7.2有關(guān)物質(zhì)測定

取150401批、150402批、150403批供試品，按“1.4”項下方法分別配制有關(guān)物質(zhì)測定溶液，按本法色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果按加校正因子的主成分自身對照法計算各雜質(zhì)的含量。結(jié)果見表4。

表4　磷酸哌喹有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（%）Tab 4 Determination of related substances of piperaquine phosphate

3　結(jié)論

本文建立的高效液相色譜方法，作為有關(guān)物質(zhì)測定可同時控制9個磷酸哌喹已知雜質(zhì)，亦可用于磷酸哌喹的含量測定。該法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡單，可作為磷酸哌喹原料藥質(zhì)量控制的參考。

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HPLC Determination of Piperaquine Phosphate Content and Its Related Substances

Huang Jun
（Guilin Pharmaceutical Co.，Ltd，Guilin，Guangxi 541004，China）

Objective: To establish an HPLC method to determine piperaquine phosphate content and its related substances. Methods: Piperaquine phosphate content and its related substances were determined by RP-HPLC. The impurity A - I in piperaquine phosphate，the relative retention times and the correction factors were determined respectively by HPLC. The chromatographic condition was as follows. The Welch Ultimate XB-C18 column（100mm×4.6mm，3μm）was adopted，the mobile phase was 0.1% Trifluoroacetic Acid in water（A）- acetonitrile（B）with gradient elution at a flow rate of 1.5 ml·min-1，the column temperature was 35℃，and the detection wavelength was 240nm. Results: Piperaquine phosphate and the impurities were separated well. The calibration curves of nine impurities were linear in each concentration range（r=0.9999）. The detection limits of piperaquine phosphate and impurity A - I were 3.4 ng·ml-1，1.0 ng·ml-1，4.9 ng·ml-1，3.1 ng·ml-1，1.4 ng·ml-1，3.8 ng·ml-1，1.7 ng·ml-1，2.8 ng·ml-1，1.9 ng·ml-1，2.0 ng·ml-1，respectively. All the average recoveries of the impurity A -I were 95.5%- 99.4%，and RSDs（n=9）were 2.8%，2.7%，1.9%，3.5%，1.8%，1.8%，1.8%，2.5%，1.1%. The content determination results for the 3 batches of samples were 99.9%，99.6% and 99.8%，respectively. The solution was stable for 24h. Conclusion: The method is sensitive，easy，accurate and suitable for quality control of piperaquine phosphate.

Piperaquine phosphate； high performance liquid chromatography（HPLC）； related substances； content

Q65［Document Code］ A

10.11967/2016140410

Q65

ADOI: 10.11967/2016140410

黃軍（1978-），男，工程師。

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