一種改進(jìn)的Aβ1-42寡聚體的制備與鑒定方法*

禹文峰， 孔　欣， 官志忠，**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)　550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

?

一種改進(jìn)的Aβ1-42寡聚體的制備與鑒定方法*

禹文峰1， 孔欣2， 官志忠1，2**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

目的： 改進(jìn)Aβ1-42寡聚體的制備與鑒定方式。方法： 以化學(xué)合成多肽Aβ1-42為原料在體外制備Aβ1-42寡聚體，用Western blotting進(jìn)行鑒定;加入不同濃度Aβ1-42寡聚體后，用CCK-8法測(cè)定體外原代培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞(AS)的存活率。結(jié)果： 化學(xué)合成的 Aβ1-42寡聚體分子量為4～188 kD，以64 kD最多，亦有少量4 kD單體存在；CCK-8法顯示Aβ1-42寡聚體對(duì)AS有明顯的神經(jīng)毒性作用，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論： 成功建立了一種改進(jìn)的制備和鑒定Aβ1-42寡聚體的方法，為深入研究阿爾茨海默病提供了研究手段。

淀粉樣蛋白； 阿爾茨海默病； 寡聚體； 星形膠質(zhì)細(xì)胞； 免疫印跡法

[Abstract]Objective: To improve method for preparation and identification of Aβ1-42oligomer. Methods: Aβ1-42oligomer was prepared by using chemical synthetic Aβ1-42polypeptideinvitro. The prepared peptide was identified by the assay of Western blotting. In order to confirm the neurotoxicity of the peptide, primary cultured astrocytes from the cortex of rats were treated with different concentrations of Aβ1-42oligomer and the survival rates of the cells were detected via Cell Counting Kit-8(CCK-8) assay. Results: The results indicated that chemical synthetic Aβ1-42oligomer weighed from 4 to 188 kd, in which the points with 64 kd were the most. In addition, a few points with 4 kd, a monomer, was also found. Furthermore, the neurotoxicity of Aβ1-42oligomer on astroytes was significantly detected with a manner of dose-dependence. Conclusions: An improved method for preparation and identification of Aβ1-42oligomer has been successfully established, which is important in the research work of Alzheimer's disease.

[Key words]amyloid; Alzheimer disease; oligomer; astrocytes; immunoblotting

阿爾茨海默氏病(Alzheimer disease, AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，AD患者表現(xiàn)出進(jìn)行性記憶能力降低、行為和認(rèn)知功能障礙。AD的主要病理改變有腦組織老年斑及神經(jīng)纖維纏結(jié)形成，老年斑的主要成分是β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)[1-2]。在AD的發(fā)病過程中，Aβ分子經(jīng)歷了從可溶態(tài)到不溶纖維狀的轉(zhuǎn)變。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Aβ生成后分泌到細(xì)胞外，累積到一定程度后就會(huì)自發(fā)聚合構(gòu)成寡聚體、原纖維體及中間體，最后會(huì)形成成熟、老化的纖維狀A(yù)β。目前認(rèn)為，可溶性Aβ寡聚體是產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用的重要來源，比纖維狀A(yù)β的毒性更強(qiáng)，在AD的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用[3-6]。Aβ寡聚體的穩(wěn)定性較差，易被轉(zhuǎn)化為纖維體，引起毒性減弱，影響實(shí)驗(yàn)效果，目前國(guó)內(nèi)對(duì)Aβ寡聚體的制備和鑒定方法較少。為此，本研究在原有Aβ寡聚體制備的基礎(chǔ)上，對(duì)制備和鑒定方法的改進(jìn)，并檢測(cè)其神經(jīng)細(xì)胞毒性作用，為AD的研究提供可靠的方法。

1　材料與方法

1.1材料

新生24～48 h 的SD(Sprague-Dawley)大鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、F12無酚紅培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))，0.25%胰蛋白酶、青—鏈霉素購(gòu)自Hyclone公司(美國(guó))，GFAP兔抗牛多克隆抗體購(gòu)自Dako公司(丹麥)，Cyb3標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自碧云天公司，Aβ1-42肽、六氟異丙醇、DMSO購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))，鼠抗Aβ多克隆抗體6E10購(gòu)自Covance公司(美國(guó))，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠二抗購(gòu)自Santa Cruz公司(美國(guó))，預(yù)制膠、電泳槽、預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)品、電泳液等購(gòu)自life technologies公司(美國(guó))，聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus發(fā)光試劑購(gòu)自Millipore公司(美國(guó))，高效顯影膠片購(gòu)自柯達(dá)公司(美國(guó))，腫囊收縮素-8(CCK-8)試劑盒購(gòu)自日本同仁公司。電泳儀(上海六一儀器廠)、CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)、高速離心機(jī)(德國(guó)eppendorf公司)、真空濃縮離心機(jī)(中國(guó)Heto)、超凈工作臺(tái)(中國(guó)SPEG AIR TECH)、-80 ℃冰箱(美國(guó)Thermo公司)、恒溫震蕩搖床、手術(shù)器械(眼科剪刀、鑷子等)經(jīng)高壓消毒。

1.2方法

1.2.1星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AS)培養(yǎng)及鑒定參照Mc Carthy等[7-9]方法并改進(jìn)，取24～48 h內(nèi)大鼠乳鼠的大腦皮質(zhì)，消化漂洗后，棄廢液，加入含10%FBS的DMEM，吹打制成細(xì)胞懸液，接種至25 cm2培養(yǎng)瓶，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，24 h后換液1次；隨后3～4 d用含10% FBS的DMEM換液，至細(xì)胞長(zhǎng)滿。培養(yǎng)7～9 d，純化并傳3～4代。傳代后，以細(xì)胞免疫熒光的方法對(duì)AS 特征性標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)進(jìn)行染色鑒定[10]。

1.2.2體外制備Aβ1-42參照文獻(xiàn)[11-14]在體外制備Aβ1-42寡聚體的方法，將HFIP置于冰上，在Aβ1-42粉末中加入充足的冷卻的HFIP(HFIP是一種高腐蝕性、揮發(fā)性的試劑，操作時(shí)注意安全)，使終濃度為1 mmol/L。充分用液體吹打瓶壁，使Aβ1-42粉末徹底溶解。室溫孵育60 min,保持封閉。溶液必須是無色、清亮的。若是出現(xiàn)黃色、渾濁液體或是懸浮的肽，證明質(zhì)量不好，不要使用。接著將其放在冰上靜置5～10 min后轉(zhuǎn)移并等量分裝至各個(gè)離心管中，蓋子打開，在通風(fēng)櫥內(nèi)室溫下過夜，使HFIP揮發(fā)完全。第2天觀察揮發(fā)情況，使用真空濃縮離心機(jī)使HFIP完全蒸發(fā)，最終只可有清晰透明的薄膜留在離心管底部，不應(yīng)為白色或是厚實(shí)的塊狀物。將干燥的肽膜存于-80 ℃冰箱保存，使用時(shí)將其放在冰上，用DMSO充分溶解，終濃度為5 mmol/L。接著用不含酚紅的F12培養(yǎng)基來稀釋，為得到最好的效果，最好不要超過100 μmol/L的濃度。4 ℃孵育24 h后，14 000 g冰凍高速離心機(jī)離心10 min，上清液即為寡聚體。

1.2.3Aβ1-42寡聚體的鑒定采用Western-blotting法。在不含血清的培養(yǎng)基內(nèi)加入100、200、300、400及500 nmol/L的Aβ1-42寡聚體，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后取出上清液。將樣品變性后，加入至4%～12%的預(yù)制膠的孔中跑電泳。接著將膠上的條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜成功后，將膜封閉2 h。用稀釋后的6E10-抗4 ℃孵育過夜后，再加入二抗在搖床上搖1 h。每進(jìn)行下一步時(shí)，都要用含0.01%的吐溫-20的TBST清洗干凈。最后用ECL發(fā)光試劑觀察表達(dá)情況。

1.2.4CCK-8細(xì)胞存活率測(cè)定每孔8 000～10 000個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞接種在96孔板上，長(zhǎng)滿后加入不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后加入0.01、0.1、1.2及5 μmol/L Aβ1-42寡聚體，共同作用24 h后棄上清液，每孔加入培養(yǎng)基200 μL 及 CCK-8試劑20 μL避光共同孵育，待1 h后通過酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處 OD值。重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料的比較采用one-way ANOVA方法檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1AS中GFAP免疫熒光鑒定

星形膠質(zhì)細(xì)胞以GFAP免疫熒光的方式染色，以Cy3標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞計(jì)數(shù)AS占所有細(xì)胞的95%以上，見圖1。

圖1　原代培養(yǎng)AS中的GFAP免疫熒光顯色(400×)Fig.1　GFA immunofluorescence of primary cultured astrocytes

2.2Aβ1-42寡聚體鑒定

經(jīng)Western blotting鑒定，500 nmol/L濃度的Aβ寡聚體在4 kD和64 kD處比較明顯，其余濃度不明顯，見圖2。

圖2　Aβ1-42寡聚體的鑒定結(jié)果(Western blotting)Fig.2　Identification of Aβ1-42 oligomer with Western blotting

2.3Aβ1-42對(duì)AS細(xì)胞存活率的影響

不同濃度的Aβ1-42對(duì)AS均有損傷作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系；自0.1 μmol/L濃度起，寡聚體的毒性作用更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3　Aβ1-42對(duì)AS存活率的影響Fig.3　effect of Aβ1-42 on cell survival of primary cultured astrocytes

3　討論

Aβ級(jí)聯(lián)假說是AD發(fā)病機(jī)制中重要的學(xué)說，是引起AD神經(jīng)退行變和癡呆的主要致病因素[15]。Aβ是淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)經(jīng)過蛋白酶水解后生成的氨基酸片段，Aβ分泌過多和異常積聚都會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷[16]。Aβ的聚集和沉積會(huì)破壞神經(jīng)細(xì)胞突觸結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，是造成記憶和認(rèn)知功能障礙的重要因素[17-19]。

本實(shí)驗(yàn)所采用的方法可以快速、成功的在體外制備Aβ1-42寡聚體，用Western blotting方法準(zhǔn)確地鑒定其表達(dá)。實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)注意的問題有：(1)在Aβ寡聚體的粉末中加入HFIP后，一定要蒸發(fā)完全，如果在通風(fēng)櫥過夜后未干，可使用真空干燥器；(2)在寡聚體制作完成后，應(yīng)盡快使用，因?yàn)槠湟鬃冃?毒性易降低，如果長(zhǎng)時(shí)間不用，在使用前應(yīng)做不同濃度的Aβ寡聚體的鑒定，觀察其分子量表達(dá)情況；(3)在用Western blotting鑒定時(shí)，由于Aβ寡聚體的表達(dá)可有多種形式，可以是單體、二聚體、或者是三聚體等不同的多聚體形式。因此，分離膠的濃度應(yīng)選擇4%～12%的梯度膠，這樣可以使各種不同分子量的多肽獲得清楚的分離效果，當(dāng)其轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，可以準(zhǔn)確觀測(cè)到分子量的變化。

相較于以往對(duì)Aβ寡聚體的制備與鑒定的研究，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上加以改良，更為經(jīng)濟(jì)、快捷、易于操作。在Aβ寡聚體的鑒定方面，普遍采用的方法是原子力顯微鏡(atomic force microscope , AFM)鑒定、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)及免疫熒光檢測(cè)等。AFM是研究生物醫(yī)學(xué)樣品的重要工具之一，但并不是實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備，使用不便。而ELISA法和免疫熒光的方法，操作耗時(shí)、花費(fèi)較高。本研究采用的Western blotting 法是在無血清的培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的Aβ寡聚體，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后取出上清液進(jìn)行鑒定，更為簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)。

AS是神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最豐富的膠質(zhì)細(xì)胞類型，在多種神經(jīng)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中充當(dāng)“雙刃劍”的重要角色。在AD早期，AS可在局部吞噬病變的神經(jīng)細(xì)胞，維護(hù)細(xì)胞微環(huán)境。但隨著疾病的發(fā)展，AS釋放各類有害因子，參與氧自由基形成及興奮性毒性作用，加重神經(jīng)細(xì)胞損傷。此外，Aβ的聚集和沉積能激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，使其釋放炎性因子，導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Aβ寡聚體對(duì)AS有一定的損害作用，細(xì)胞存活率降低。當(dāng)然，也可以使用神經(jīng)細(xì)胞或其他膠質(zhì)細(xì)胞來進(jìn)行Aβ寡聚體的神經(jīng)毒性作用鑒定。

總之，本實(shí)驗(yàn)提供了一種比較簡(jiǎn)單、直觀、經(jīng)濟(jì)的體外提取Aβ寡聚體的改進(jìn)方法及鑒定方式，為AD的研究提供了實(shí)用的研究手段。

[1]官志忠.阿爾茨海默病的病理學(xué)及生物膜結(jié)構(gòu)與受體改變機(jī)制[J].中華病理學(xué)雜志, 2003(1):69-71.

[2]Kumar A, Singh A, Ekavali. A review on Alzheimer’s disease pathophysiology and its management: an update[J]. Pharmacological Reports, 2015(67): 195-203.

[3]劉文娟,戴雪伶,姜招峰.β-淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性及其防治策略[J].生命科學(xué), 2011(10):1023-1026.

[4]Anand R, Gill KD, Mahdi AA. Therapeutics of Alzheimer’s disease: past, present and future[J]. Neuropharmacology, 2014(76):27-50.

[5]Hardy J. The amyloid hypothesis for Alzheimer’s disease: a critical reappraisal[J]. J Neurochem, 2009(4): 1129-1134.

[6]Dal Pra I, Chiarini A, Gui L, et al. Do strocytes collaborate with neurons in spreading the ‘infectious’ Aβ and tau rivers of Alzheimer’s disease[J]. Neuroscientist, 2015(1): 9-29.

[7]Mc Carthy KD，Vellis JD．Preparation of separate astroglial and oligdendroglial cell cultures from rat cerebral tissue[J]. Cell Biol, 1980(85): 890-902．

[8]Schildge S, Bohrer C, Beck K, et al. Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes[J]. J Vis Exp, 2013(71): 1-7.

[9]湯婷婷,官志忠,禹文峰.SD大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014(2):158-161.

[10]張敬軍.星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2006(7): 788-791.

[11]Klein WL. Aβ toxicity in Alzheimer’s disease: globular oligomers (ADDLs) as new vaccine an drug targets[J]. Neurochemistry International, 2002(41):345-352.

[12]官志忠,齊曉嵐,歐陽(yáng)凱,等.阿爾茨海默病發(fā)病中β淀粉樣蛋白與膽堿能尼古丁受體的相互作用[C].第十三屆全國(guó)診斷病理暨頭頸部及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集, 2012:92-97.

[13]楊帆,李東風(fēng),徐書雯.Aβ1-42寡聚體與纖維體的制備及鑒定[J].中華老年學(xué)雜志, 2013(33):2076-2078.

[14]譚現(xiàn)偉.Aβ1-42寡聚體制備方法的研究[D].北京:北京交通大學(xué)， 2009:1-37.

[15]Galimberti D, Ghezzi L, Scarpini E. Immunotherapy against amyloid pathology in Alzheimer’s disease[J]. J Neurol Sci, 2013(1):50-54.

[16]Selkoe DJ. Alzheimer’s disease is a synaptic failure[J]. Science, 2002(298):789-791.

[17]Haass C, Selkoe DJ. Soluble protein oligomer in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide[J]. Nat Rev Mol Cell Boi, 2007(2):101-112.

[18]Shankar GM, Li S, Mehta TH, et al. Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory[J]. Nat Med, 2008(8):837-842.

[19]Butterfield DA. Amyloid β-peptide (1-42)-induced oxidative stress and neurotoxicity: implications for neurodegeneration in Alzheimer's disease brain[J]. Free Radical Research, 2002(12):1307-1313.

[20]Heneka MT, O'Banion MK. Inflammatory processes in Alzheimer's Disease[J]. J Neuroimmunol, 2007(1-2):69-91.

[21]王琦,周海霞.阿爾茨海默病中β淀粉樣蛋白對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志, 2011(18):3643-3645.

(2016-06-13收稿，2016-07-30修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 趙毅

An Improved Method for Preparation and Identification of Aβ1-42Oligomer

YU Wenfeng1, KONG Xin2, GUAN Zhizhong1,2

(1.theKeyLabofMedicalMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;2.DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81360199)； 國(guó)家自然科學(xué)基金(81260173)； 教育部科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(213032A)； 貴州省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目 [黔科合外G字 (2011)7014號(hào)]； 貴州省科技計(jì)劃 [黔科合重大專項(xiàng)字(2014)6008號(hào)]

Email:1457658298@qq.com

R34-33

A

1000-2707(2016)08-0878-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.08.003

**

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-08-23網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160823.1343.052.html