川金絲猴腎的組織結(jié)構(gòu)觀察及Bax蛋白的表達

俞詩源，茍?zhí)杖唬?歐　銳

(1.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州　730070；2.西北師范大學學報編輯部，甘肅蘭州 730070)

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川金絲猴腎的組織結(jié)構(gòu)觀察及Bax蛋白的表達

俞詩源1，2，茍?zhí)杖?， 歐銳1

(1.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070；2.西北師范大學學報編輯部，甘肅蘭州 730070)

為觀察川金絲猴腎的組織結(jié)構(gòu)及其相關(guān)蛋白Bax的表達，制作石蠟切片，采用H.E染色觀察川金絲猴腎的組織結(jié)構(gòu)特征，用免疫組織化學法檢測Bax蛋白在腎組織中的表達.結(jié)果顯示：川金絲猴和多數(shù)哺乳類腎的組織結(jié)構(gòu)相似，外觀呈蠶豆形，表面包以致密的結(jié)締組織被膜，腎實質(zhì)由外周的皮質(zhì)和內(nèi)部的髓質(zhì)構(gòu)成；腎小體數(shù)量較多，周圍有很多近曲小管和遠曲小管，近曲小管管腔不規(guī)則，有明顯刷狀緣，遠曲小管則無刷狀緣，集合管管腔較大，細胞界限清晰，腎小管和集合管上皮細胞都呈Bax蛋白免疫反應(yīng)陽性；川金絲猴的腎主要由腎單位和集合管構(gòu)成，Bax蛋白參與川金絲猴腎小管和集合管上皮細胞的凋亡，調(diào)控川金絲猴腎的發(fā)育過程.

川金絲猴；腎；組織結(jié)構(gòu)；Bax；免疫組織化學

川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)屬靈長類動物，是中國特有的珍稀物種，屬于國寶級保護動物.研究川金絲猴的生境特點和器官組織結(jié)構(gòu)對于保護生物學、生理學和比較組織學研究都具有重要的科學意義.有關(guān)川金絲猴的社會結(jié)構(gòu)[1]、內(nèi)分泌腺結(jié)構(gòu)[2]、肝內(nèi)管道分布[3]、雌性生殖器的大體解剖結(jié)構(gòu)[4]、睪酮水平的變化[5]及輸卵管和子宮的組織結(jié)構(gòu)[6]、冠狀動脈的解剖[7]和腦動脈的供應(yīng)[8]已有報道.但有關(guān)川金絲猴腎組織結(jié)構(gòu)、何種因子參與川金絲猴腎組織細胞的生長發(fā)育和調(diào)控尚未見文獻報道.有研究表明腎組織細胞的凋亡是腎發(fā)育過程中的普遍事件，是腎單位結(jié)構(gòu)不均一性形成的基礎(chǔ)[9]，Bax蛋白的表達產(chǎn)物與Bcl-2蛋白等形成異二聚體，可共同調(diào)節(jié)細胞的存亡[10].為了解川金絲猴腎的組織結(jié)構(gòu)以及凋亡Bax蛋白的表達情況，本實驗用生物顯微技術(shù)和免疫組織化學法觀察了一只因病死亡川金絲猴的腎組織結(jié)構(gòu)和Bax蛋白的表達情況，旨在為動物學及生物學研究提供依據(jù).

1　材料和方法

1.1實驗材料

本實驗利用動物園因病而死亡的大齡雌性川金絲猴1只，按常規(guī)方法解剖取出左右腎，用生理鹽水沖洗，固定于10%的福爾馬林中作為實驗材料，Bax蛋白和DAB顯色劑均購于武漢博士德生物工程有限公司.

1.2光鏡觀察

取上述福爾馬林固定的川金絲猴腎組織，石蠟包埋后連續(xù)切片(6 μm)，H.E染色，中性樹膠封固.隨機抽取5張切片，在Olympus顯微鏡下觀察，每張切片選取5個視野(10×40)拍照，利用Image-proplus6.0圖像分析軟件檢測分析腎小球直徑、腎小管和集合管的管徑，并計算平均值[11].

1.3免疫組織化學檢測

根據(jù)試劑盒方法，將上述石蠟切片經(jīng)脫蠟、H2O2孵育、微波處理修復、山羊(Capragenus)血清室溫孵育封閉，用兔抗(0ryctolaguscuniculus)Bax(工作濃度為1∶100)4 ℃冰箱孵育(空白對照用PBS代替一抗)，再滴加生物素標記的二抗(羊抗兔IgG抗血清)室溫孵育后，用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物(StreptAvidin-Biotin Complex)工作液室溫孵育，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片，光學顯微鏡觀察并拍照.利用Image-proplus 6.0軟件進行定量分析，取5張切片，每張切片選取5個視野(10×40)分析Bax蛋白在川金絲猴腎組織中表達的平均光密度值(已去除本底色).

1.4統(tǒng)計學分析

2　結(jié)果

2.1腎的組織結(jié)構(gòu)

川金絲猴的腎位于腹腔后上部，腰椎兩側(cè)，左右各一，右腎位置偏前.兩腎表面光滑，新鮮時呈紅褐色，質(zhì)地柔軟.表面觀呈蠶豆形，腎門清楚，血管、神經(jīng)和輸尿管均由此經(jīng)過.腎表面包以致密的結(jié)締組織被膜，在腎的額狀切面上，腎實質(zhì)分為皮質(zhì)和髓質(zhì)兩部分.腎皮質(zhì)主要位于淺層，富有血管，新鮮標本為紅褐色.腎髓質(zhì)位于腎實質(zhì)的深部，顏色較淺，致密而有條紋.自髓質(zhì)呈放射狀伸入皮質(zhì)的條紋是髓放線.每條髓放線與其周圍的皮質(zhì)迷路構(gòu)成一個腎小葉.

川金絲猴的腎主要由腎單位和集合管組成，腎單位由腎小體和與其相連的腎小管構(gòu)成.

1)腎小體川金絲猴的腎小體由腎小球和腎小囊組成，大小約(157.02±6.51)μm，在腎皮質(zhì)內(nèi)多呈均勻分布，或 2～3個相鄰，部分腎小球似出現(xiàn)萎縮(圖1：A).腎小囊為雙層球形囊，由腎小管盲端膨大內(nèi)陷形成.外層為壁層與近曲小管相連，為單層扁平上皮；內(nèi)層為臟層緊貼在腎小球毛細血管表面.內(nèi)、外兩層之間形成窄小的腎小囊腔，與腎小管相通；腎小球被包于腎小囊中，是入球小動脈分支(3～5支)形成的許多毛細血管袢迂回盤繞成團狀的毛細血管球，其末端各分支再匯合成出球小動脈離開腎小囊.腎小球直徑約為(108.30±6.52)μm(圖1：A～C，表1).

2)腎小管川金絲猴的腎小管根據(jù)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)分為近端小管、細段和遠端小管.近端小管與腎小囊壁層上皮相連，管腔不規(guī)則，直徑約為(54.78±5.85)μm，管壁由單層立方上皮組成，各細胞界限不明顯，近管腔面有刷狀緣，胞質(zhì)嗜酸性，伊紅染色后較深，胞核著色淺，位于細胞基底部(圖1：B，表1).細段大部在髓袢降支，管徑較小，約為(14.40±1.84)μm，管壁由單層扁平上皮構(gòu)成，胞核圓形居中，著色淺，無刷狀緣(圖1：D，表1).遠端小管管壁由單層立方上皮構(gòu)成，管徑約為(38.43±2.44)μm，細胞弱嗜酸性，腔面無刷狀緣，胞核大而圓(圖1：C，表1).另外，腎小管上皮有腫脹和脫落現(xiàn)象.

圖1　川金絲猴腎的組織結(jié)構(gòu)及Bax蛋白的表達

A.川金絲猴腎組織，標尺=100 μm；B.川金絲猴腎皮質(zhì)，標尺=25 μm；C.川金絲猴腎皮質(zhì)，標尺=25 μm；D.川金絲猴腎髓質(zhì)，標尺=25 μm；E.Bax蛋白在川金絲猴腎皮質(zhì)中的表達，標尺=25 μm；F.Bax蛋白在川金絲猴腎髓質(zhì)的表達，標尺=25 μm.

A.The histological section of Sichuan snub-nosed monkeys kidney，bar=100 μm;B.The renal cortex of Sichuan snub-nosed monkeys，bar=25 μm;C.The renal cortex of Sichuan snub-nosed monkeys，bar=25 μm;D.The renal medulla of Sichuan snub-nosed monkeys，bar=25 μm;E.The expression of Bax protein in renal cortex of Sichuan snub-nosed monkeys，bar=25 μm;F.The expression of Bax protein in renal medulla of Sichuan snub-nosed monkeys，bar=25 μm.

CD.集合管；Dt.遠曲小管；Pt.近曲小管；Rc.腎小體；TL.細段；↑.刷狀緣.

CD.Collecting duct;Dt.Distal tubule;Pt.Proximal tubule;Rc.Renal corpuscle;TL.Thin limb；↑.Brush border.

3)集合管川金絲猴的集合管由遠曲小管匯合而成，周圍有少量纖維性結(jié)締組織.集合管橫截面多為橢圓形，管徑較粗，約為(61.73±2.35)μm.集合管上皮細胞排列整齊，分界清晰，胞質(zhì)透明，呈弱酸性，著色較淺，胞核位于細胞基底部.集合管始段為弓狀集合小管，上皮細胞為立方形.末段為乳頭管，起始處為單層柱狀上皮，在開口處移形為變移上皮(圖1：D，表1).

2.2Bax蛋白在腎組織中的表達

川金絲猴腎組織中Bax蛋白的陽性表達部位被染成棕黃色，Bax蛋白主要在細胞質(zhì)中表達.從圖可以看出，Bax蛋白在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)中均有表達，其中，近端小管、遠端小管和集合管上皮細胞有大量表達，腎小體內(nèi)有少量表達(圖1：E～F).川金絲猴腎臟中Bax蛋白表達部位的平均光密度值為(0.165±0.042).

表1　川金絲猴腎單位及集合管的直徑(μm)

3　討論

3.1組織結(jié)構(gòu)特點

腎臟是機體主要的排泄器官，具有排除機體代謝終產(chǎn)物和進入體內(nèi)的過剩異物，調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡和酸堿平衡等作用.川金絲猴的腎臟主要由腎單位和集合管組成，其調(diào)節(jié)功能與腎小體和各段腎小管的結(jié)構(gòu)特點直接相關(guān).川金絲猴腎小體的直徑(157.02±6.51 μm)比人(200 μm)[12]腎小體直徑小，但比西藏小型豬(Sussalvanius)(156 μm)[13]、比格犬(Canisfamiliaris)(124 μm)[14]、小熊貓(Ailurusfulgens)(108～155 μm)[15]等獸類動物的腎小體直徑大.川金絲猴等哺乳動物和人的腎小球是由入球小動脈反復分支盤繞形成的毛細血管球，結(jié)構(gòu)較為復雜，因而濾過面積較大，濾過率較強，通過血管球濾過形成的原尿相對較多[16]，而白孔雀(Pavocristatu)[17]和紅腹錦雞(Chrysolophuspictus)[18]等鳥類腎小球的毛細血管則沒有復雜的分支和吻合，結(jié)構(gòu)較為簡單，其濾過率較弱，但白孔雀和紅腹錦雞等鳥類腎小球的數(shù)量多，故鳥類亦能快速排出其代謝廢物.川金絲猴和人近端小管腔面刷狀緣發(fā)達，使小管上皮細胞的表面積明顯增加，因而川金絲猴和人近端小管有較強的重吸收作用.川金絲猴和人腎小管細段管腔小、管壁薄，由單層扁平上皮構(gòu)成，表明它的通透性大，這種結(jié)構(gòu)特點可能對尿的濃縮有重要作用.有研究表明，在非洲雛鴕鳥(Struthiocamelus)的飲水中添加一定劑量的硼后，會對腎小體、腎小管等結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接損傷，出現(xiàn)腎小體結(jié)構(gòu)模糊，近端小管的上皮細胞破裂、管腔內(nèi)沉積組織碎片等現(xiàn)象，這些形態(tài)學損傷進而會影響腎生理功能的發(fā)揮[19].本實驗發(fā)現(xiàn)，川金絲猴腎小體萎縮、腎小管上皮有腫脹和脫落現(xiàn)象，這可能與實驗動物的年齡大、器官組織衰退有關(guān).

3.2Bax蛋白的表達

細胞凋亡在多細胞生物組織的穩(wěn)態(tài)和生命過程中起重要作用[20].Bcl-2家族的蛋白質(zhì)是細胞凋亡的主要參與者[21-23]，Bax蛋白是該家族的主要成員，是促凋亡因子，而Bcl-2蛋白是抑制凋亡因子，Bax與Bcl-2蛋白比率直接影響細胞的生長發(fā)育和存亡.研究表明，Bcl-2和Bax的表達與線粒體的分布和數(shù)量相關(guān)，它們通過調(diào)節(jié)線粒體膜的穩(wěn)定性來抑制和促進凋亡[24].Bax-Bax形成同源二聚體后，線粒體釋放細胞色素C，細胞質(zhì)釋放ATP，從而啟動Caspase家族級聯(lián)反應(yīng)，出現(xiàn)細胞凋亡[25].

在腎發(fā)生發(fā)育的過程中，各種結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的細胞凋亡是腎發(fā)育的一個基本特征[9].腎小體在發(fā)育中通過細胞凋亡的形式清除增生過剩的內(nèi)皮細胞，從而有利于毛細血管管腔的形成，調(diào)節(jié)毛細血管的增生速度[26].有實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠(Musmusculus)腎臟缺血再灌注后，腎組織中Bax和Bcl-2表達均急劇上升，24 h后達到峰值，Bcl-2達到峰值后開始下降，且部分炎癥因子抑制Bcl-2的表達，導致Bcl-2/Bax比值下降，引起細胞凋亡，其機制與上調(diào)某些促凋亡基因、下調(diào)抑凋亡因子的表達相關(guān)[27].生長期膳食缺鋅小鼠腎細胞凋亡的增加可能是Bcl-2下調(diào)及Bax上調(diào)使得Bcl-2/Bax 比值下降所致[28].在已知的細胞凋亡調(diào)節(jié)途徑中，Bcl-2和Bax的比率最具特征，直接決定細胞存亡，影響腎上皮細胞存活、分化、成熟所必需的環(huán)境[29].本研究發(fā)現(xiàn)，Bax蛋白在川金絲猴腎中的表達部位主要集中在近端小管、遠端小管和集合管上皮細胞，表明其分化、成熟已達高峰，其炎性細胞因子增多，p-p38MAPK信號傳導通路被激活，導致Bax上調(diào)及Caspase-3蛋白表達，腎臟細胞出現(xiàn)凋亡[30]，這與上述實驗動物年齡大、器官組織衰退的表現(xiàn)一致，進一步表明Bax蛋白參與川金絲猴腎小管和集合管上皮細胞的凋亡，調(diào)控川金絲猴腎的發(fā)育過程.

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(責任編輯陸泉芳)

Histological structure and Bax proteins expression in Sichuan snub-nosed monkey(Rhinopithecusroxellana) kidney

YU Shi-yuan1,2，GOU Tao-ran1，OU Rui1

(1．College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu,China；2．Editoral Department of the University Journal，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，Gansu,China)

To observe the Sichuan snub-nosed monkeys(Rhinopithecusroxellana) kidney histological structure and its related proteins expression of Bax,the paraffin sections and H.E stain are used to observe the histological structure characteristics of Sichuan snub-nosed monkeys kidney,and immunohistochemical method is used to detect Bax protein expression in the Sichuan snub-nosed monkeys kidney.Results show the kidney tissue of Sichuan snub-nosed monkeys is similar to the most mammals,the kidney profile likes broad beans and is wrapped by dense connective tissue in surface.Renal parenchyma is composed of external cortex of kidney and internal medullary of kidney.There are so many renal corpuscles.Proximal tubule and distal tubule located renal corpuscles are numerous.Proximal tubule’s lumen is irregular and the brush border clearly exists while distal tubule hasn’t brush border.The lumen of collecting tubule is big and its cell boundary is clear.Bax is expressed in epithelial cells which are located in renal tubule and collecting tubule. The kidney of Sichuan snub-nosed monkeys are mainly made up of the nephron and collecting tubule.Bax participates cell apoptosis which occurs in renal tubule and collecting tubule to control the development of Sichuan snub-nosed monkeys kidney.Key words:Sichuan snub-nosed monkeys(Rhinopithecusroxellana);kidney;histological structure;Bax;immunohistochemistry

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.05.019

2016-07-15;修改稿收到日期:2016-08-02

甘肅省自然科學基金資助項目(1107RJZA141);蘭州市社會發(fā)展項目(2013-3-72，2014-1-102)

俞詩源(1957—)，男，甘肅蘭州人，教授，博士，博士研究生導師.主要研究方向為組織發(fā)生.

E-mail:syyu006@nwnu.edu.cn

Q 955

A

1001-988Ⅹ(2016)05-0085-05