韭菜胚根高效植株再生體系的建立

王婷婷 高行英 李梅蘭 宋紅霞 侯雷平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801）

韭菜胚根高效植株再生體系的建立

王婷婷 高行英 李梅蘭 宋紅霞 侯雷平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801）

為了建立韭菜高頻植株再生體系，以韭菜胚根的不同部位為外植體，研究了不同部位愈傷組織和芽的誘導(dǎo)。結(jié)果表明，胚根尖為誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到81.4%，出芽率達(dá)到73.3%；比較在不同激素配方上的愈傷組織誘導(dǎo)和芽的分化，在MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT培養(yǎng)基中再生率最高，誘愈率達(dá)到80%以上，不定芽分化率達(dá)78.8%，繁殖系數(shù)為24.7；在MS+1 mg/L GA+0.5 mg/L KT不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，30 d不定芽伸長(zhǎng)為獨(dú)立植株，比例為85.5%；獨(dú)立的韭菜苗在1/2 MS+0.3 mg/L IAA中生根率及根系狀況最佳。通過該方法130 d左右即可從胚根脫分化再生出植株。

韭菜；胚根；再生；植物激素；伸長(zhǎng)

韭菜（Allium tuberosum Rottler）屬百合科蔥屬，原產(chǎn)于中國，由于其具有特殊的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及抗癌功能［1］，深受人們的喜愛。韭菜既可以進(jìn)行種子繁殖，也可以進(jìn)行無性繁殖，但是在生產(chǎn)中大多采用多年生的方式進(jìn)行生產(chǎn)，而不是采用種子繁殖的方式，因此，在育種中不像其他的蔬菜如茄果類和葉菜類等方便進(jìn)行雜交育種。采用現(xiàn)代分子育種方法進(jìn)行品種的選育具有非常簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，因此，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化就成為一個(gè)必要的條件，但在韭菜的遺傳轉(zhuǎn)化研究方面還較少。目前許多蔥蒜類蔬菜已經(jīng)建立了高效的再生體系和成熟的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)［2-4］，而且均是采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法取得成功。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有簡(jiǎn)便、單拷貝等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，但是該方法的建立需要高效的再生系統(tǒng)作為前提。

有關(guān)韭菜組織培養(yǎng)方面的研究早在1977年就已經(jīng)開始［5］，1992年，Pandey等［6］通過莖尖的誘導(dǎo)進(jìn)行了韭菜的離體繁殖，隨后Matsuda等［7］由莖尖獲得胚性愈傷進(jìn)而得到再生的植株，效率明顯提高。人們通過未成熟胚［8］和未受精的子房［9］也誘導(dǎo)出愈傷組織，進(jìn)而成功得到了再生植株。在根外植體研究方面，Shuto等［10］和張松等［11］均通過根尖誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)而分化為植株，但是沒有形成高頻的具備鱗莖的單獨(dú)植株。其后也有一些相關(guān)的報(bào)道［12，13］，但是在激素配方的使用方面相差很大，且研究結(jié)果不系統(tǒng)，因此本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，通過比較各個(gè)配方及根系的不同部位，進(jìn)行再生過程的優(yōu)化，以期從中選出最佳的激素配方和合適的根外植體，提高形成單株組培苗的頻率，為今后的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及外植體準(zhǔn)備 試驗(yàn)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。韭菜采用“漢中冬韭”品種，種子購于山西省侯馬市農(nóng)人種業(yè)有限公司。

將韭菜種子沖洗干凈，75% 乙醇中消毒30 s，用無菌水沖洗3-5次，再在含有0.1%升汞和0.1% Tween-20的混合溶液中消毒10 min，用無菌水沖洗3-5次；消毒后的種子播種在含1/2MS固體培養(yǎng)基的9 cm的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行發(fā)芽，每個(gè)培養(yǎng)皿50粒種子。7 d左右，種子萌發(fā)生長(zhǎng)獲得1 cm無菌胚根。1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基，含3%蔗糖和0.65%瓊脂粉，用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為5.8，使用前121℃高壓滅菌20 min。為了不同的試驗(yàn)?zāi)康模诨A(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同種類和濃度的激素。

培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照度為1 500-2 500 lx，光照時(shí)間為光/暗：16 h/8 h。

1.2 方法

1.2.1 外植體選擇 在無菌環(huán)境下，切取韭菜無菌胚根的尖、中、上3個(gè)部位，長(zhǎng)為1.5-2 mm，參照之前的結(jié)果放置在含2 mg/L BA和1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織［14］。每5 d觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化情況，比較愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果，以確定根系外植體的最佳部位。

1.2.2 愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo) 為了確定不定芽誘導(dǎo)的最佳配方，將韭菜胚根尖放置在不同濃度BA（1、1.5和2 mg/L）、NAA（0.5、1和1.5 mg/L）、KT（0.5、1和1.5 mg/L）正交組合及2 mg/L BA + 1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織的分化及不定芽的分化，以得到愈傷組織及不定芽分化的最佳激素配方。

1.2.3 不定芽伸長(zhǎng) 將叢狀不定芽分為5-7個(gè)一簇，攜帶愈傷組織，分別放置在不含植物激素、含2mg/L BA + 1 mg/L NAA、2 mg/L BA+1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT、1 mg/L GA及1 mg/L GA+KT（0.5和1 mg/L）的MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽的伸長(zhǎng)，以期選擇不定芽伸長(zhǎng)的最佳配方。

1.2.4 不定芽的生根 將伸長(zhǎng)培養(yǎng)得到的獨(dú)立健壯的韭菜植株（高3 cm左右）從愈傷組織上分離，轉(zhuǎn)移到含0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/L IAA的1/2MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行生根，每2 d觀察一次，觀察記錄生根的早晚、生根率和根系的發(fā)育狀況。

2 結(jié)果

2.1 外植體的確定

將胚根各部放于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，不同部位的根段均開始膨大，胚根尖變得白色透明，胚根中部和上部的根段大部分為翠綠透明狀。20 d左右，愈傷組織從韭菜根尖開始形成，并且迅速膨大，但是中上部的根段幾乎沒有形成的愈傷組織（圖1）。50 d后記錄愈傷組織的誘導(dǎo)率，統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果（表1）表明，不同部位根尖愈傷組織的誘導(dǎo)效果差異顯著，以胚根尖端部位誘導(dǎo)效果為最好，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到81.40%，此外，從胚根尖誘導(dǎo)出的芽數(shù)也顯著高于其它兩個(gè)部位。

2.2 愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)

切取無菌胚根的根尖（圖2-A），放置在含12種不同激素組合處理的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，并分化不定芽。7 d后，根段開始膨脹變粗，15 d后，從切口處開始形成愈傷組織，30 d左右，愈傷組織直徑達(dá)到2 mm，50 d后，愈傷組織直徑達(dá)到5 mm（圖2-B），記錄愈傷組織的誘導(dǎo)率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明，2、3、10和11 這4個(gè)配方愈傷組織的形成率均達(dá)到75%以上，而且相互間無顯著性差異（表2）；隨后，愈傷組織開始逐步分化不定芽（圖2-C），15 d后，明顯可見綠色健壯的不定芽（圖2-E），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，分化的不定芽數(shù)及長(zhǎng)度不斷增加，30 d后不定芽長(zhǎng)達(dá)1 cm（圖2-F和2-G），比較幾種組合，3和11組合的不定芽分化率為71.73%和69.30%，平均誘芽數(shù)為16.53和9.56；而2和10組合的不定芽分化率分別達(dá)到77.17%和78.83%，不定芽的平均分化數(shù)為25，顯著高于其他組合。因此，把1 mg/L BA+1 mg/L NAA+1 mg/L KT和1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT作為韭菜胚根誘導(dǎo)不定芽分化的最佳配方。

圖1 胚根不同部位愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)比較

表1 韭菜根系不同部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2 不同激素組合對(duì)韭菜胚根誘導(dǎo)愈傷及不定芽的影響

通過組織學(xué)發(fā)生分析愈傷組織的形成途徑，證明愈傷組織先由根外植體誘導(dǎo)形成，然后由愈傷組織直接分化為芽體（圖2-D）。

2.3 不定芽的伸長(zhǎng)及鱗莖的分化

在誘芽培養(yǎng)基中，雖然愈傷組織分化出許多不定芽，但卻是叢生的，難以生成獨(dú)立植株。為了使其盡快分化為單獨(dú)的植株，將不定芽分為5-7個(gè)一簇，放入不同的培養(yǎng)基中。當(dāng)培養(yǎng)基中不加激素時(shí)，出現(xiàn)不定芽伸長(zhǎng)、生根及繼續(xù)分化不定芽等各種情況，形態(tài)不一致，而在誘導(dǎo)愈傷和不定芽的培養(yǎng)基中，愈傷組織繼續(xù)分化不定芽，不定芽不進(jìn)行伸長(zhǎng)（圖2-Ha）。在含GA的培養(yǎng)基中，15 d后不定芽伸長(zhǎng)達(dá)到5 cm，但僅僅使用GA，植株細(xì)弱（圖2-Hb），加入KT后，不定芽的平均伸長(zhǎng)長(zhǎng)度為7.14 cm，且非常健壯（圖2-Hc和圖2-I）。30 d后不定芽形成鱗莖進(jìn)而形成獨(dú)立植株，成為健壯獨(dú)立的韭菜小苗（圖2-J）。統(tǒng)計(jì)不定芽伸長(zhǎng)率（不定芽伸長(zhǎng)1 cm以上的植株數(shù)/總植株數(shù)）及平均伸長(zhǎng)長(zhǎng)度（表3），在MS+1 mg/L GA+0.5 mg/L KT和MS+1 mg/L GA的培養(yǎng)基上，不定芽的伸長(zhǎng)率均達(dá)到80%以上。綜合考慮統(tǒng)計(jì)結(jié)果和生長(zhǎng)狀態(tài)，不定芽伸長(zhǎng)的最佳配方為MS+1 mg/L GA+0.5 mg/L KT，操作時(shí)每塊愈傷組織盡可能含較少的芽體便于其更好地發(fā)育成獨(dú)立的小苗。

圖2 韭菜根外植體愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽的分化

表3 不同激素組合下韭菜不定芽的伸長(zhǎng)狀況

2.4 生根

將3 cm高的韭菜植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，5 d后未加IAA的組合最先開始生根，7-9 d后含IAA的組合都開始逐漸生根，15 d后觀察統(tǒng)計(jì)各個(gè)配方下生根情況及根系狀態(tài)，結(jié)果（表4）表明，未加IAA的配方生根最早，但是生根數(shù)少，且根系細(xì)長(zhǎng)。含有0.3 mg/L IAA時(shí)，根系數(shù)達(dá)到8條以上，根系粗壯且根長(zhǎng)與未加IAA配方?jīng)]有極顯著的差異。濃度繼續(xù)增高時(shí)，生根數(shù)量也提高，但根系呈現(xiàn)短粗狀。因此韭菜植株生根的最佳配方為1/2 MS+0.3 mg/L IAA（圖2-K）。

3 討論

在韭菜中已經(jīng)建立了通過胚胎發(fā)生進(jìn)行離體組培的系統(tǒng)，但是需要采用小植株來完成［7］。本試驗(yàn)以韭菜的胚根根尖作為外植體，外植體容易獲得，在任何時(shí)候都可以進(jìn)行，不受季節(jié)的影響。不僅節(jié)約外植體得到的時(shí)間，而且形態(tài)一致。比較不同部位誘導(dǎo)愈傷的情況，胚根尖飽滿，可以明顯區(qū)分其分生組織，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到81.4%以上，為最佳部位，這與屈二軍等［13］報(bào)道的胚根愈傷組織的誘導(dǎo)率相一致。

在植物組織培養(yǎng)過程中，植物激素的種類和比例對(duì)愈傷組織和不定芽的形成有著重要的影響。細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比例顯著影響愈傷組織的形成率，而細(xì)胞分裂素的濃度顯著影響不定芽的分化率，尤其是細(xì)胞分裂素KT對(duì)不定芽的分化有很大的意義。張松等［11］研究表明愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的最佳配方為MS+1 mg/L NAA+2 mg/L BA。細(xì)胞分裂素KT應(yīng)用在很多蔥蒜類組織培養(yǎng)試驗(yàn)中，提高愈傷組織誘導(dǎo)率，尤其是不定芽的增殖率。本試驗(yàn)表明，當(dāng)細(xì)胞分裂素BA和KT共同與NAA作用時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)速度快，比率高，更重要的是每個(gè)愈傷組織分化的不定芽達(dá)到20-30個(gè)，大大提高了增殖率。

在之前的韭菜再生過程中，植株分化形成叢生的不定芽，沒有形成帶有假莖的單獨(dú)的不定芽，難以生根，只能將含有多個(gè)不定芽的愈傷組織一起生根，這樣不易獲得獨(dú)立的植株，因此，繁殖系數(shù)較低、成活率也低，整個(gè)過程中也沒有形成單獨(dú)的植株［14］。Zdravkovi?-Korac等［2］在洋蔥的研究結(jié)果表明，不定芽經(jīng)過進(jìn)一步增殖可形成具有鱗莖的獨(dú)立植株。本試驗(yàn)將韭菜不定芽放置在MS+1 mg/L GA+0.5 mg/L KT中伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，能快速形成明顯與愈傷組織分離的獨(dú)立健壯的韭菜苗，大大縮短了時(shí)間，提高了再生的效率。另外，韭菜苗在1/2MS + 0.3 mg/L IAA中，植株生根的條數(shù)與形態(tài)最佳，且與之前韭菜叢生芽生根的情況一致［14］。

表4 IAA濃度對(duì)韭菜植株生根的影響

4 結(jié)論

采用胚根尖作為外植體，在培養(yǎng)基（2 mg/L BA+1 mg/L NAA）上誘導(dǎo)愈傷，50 d后愈傷直徑可達(dá)5 mm，此時(shí)部分愈傷開始分化不定芽，將其轉(zhuǎn)到誘芽培養(yǎng)基上（1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT），15 d就可以長(zhǎng)出叢生芽。再生長(zhǎng)15 d后，叢生芽數(shù)達(dá)到25-30個(gè)，最高達(dá)到3 cm。將叢生不定芽轉(zhuǎn)到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中（1 mg/L GA+0.5 mg/L KT），30 d就可以得到獨(dú)立的小苗，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中（0.3 mg/L IAA）進(jìn)行生根，5 d左右就可以開始生根，15 d后即可得到根系健壯的獨(dú)立韭菜植株。因此經(jīng)過130 d左右即可從胚根脫分化再生出植株。

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（責(zé)任編輯馬鑫）

The Establishment of High-frequency Plant Regeneration System from the Radicle Tip of Chinese Chive（Allium tuberosum Rottler）

WANG Ting-ting GAO Xing-ying LI Mei-lan SONG Hong-xia HOU Lei-ping
（College of Horticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）

In order to establish the high frequencey regeneration system of Allium tuberosum， using the radicle as the explant， the paper examined callus and bud induction from its various parts. The results showed that the radicle tip was the best explant for inducing callus with the induction rate of 81.4%， and the bud induction rate reached 73.3%. Comparing the induction of callus and differentiation of bud in several media formulas， the regeneration rate was the highest in medium of MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT， with induction rate over 80% and the differentiation rate of adventitious bud reaching 78.8%， respectively， while the propagation coefficient was 24.7. The percentage of adventitious buds elongating to be independent plant was 85.5% on elongation medium of MS+1 mg/L GA+0.5 mg/L KT at 30 d. The rooting rate and root system for the independent shoots were the best in the medium of 1/2 MS+0.3 mg/L IAA， and in which a single plant from the differentiation of radicle was generated at approximate 130 d.

Allium tuberosum；radicle；regeneration；plant regulators；shoot elongation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.015

2015-07-14

山西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20090311022，20150311010-2），山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2013-062）

王婷婷，女，碩士，研究方向：蔬菜生物技術(shù)；E-mail：tingkakatea@163.com

侯雷平，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：設(shè)施園藝；E-mail：sxndhlp@126.com