丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)方法確認(rèn)

曾付芳,吳　丹,周　吉,田　方,彭冬菊

(湖北省十堰市中心血站　442000)

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·論著·

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)方法確認(rèn)

曾付芳,吳丹,周吉,田方,彭冬菊

(湖北省十堰市中心血站442000)

目的對(duì)獻(xiàn)血者的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)采用速率法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)這種方法進(jìn)行性能驗(yàn)證，證明其滿足ISO15189的要求。方法按照CNSA-CL02：2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》及《血站技術(shù)操作規(guī)程》(2012版)的要求對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的精密度、正確度、靈敏度、可報(bào)告范圍、生物學(xué)參考區(qū)間以及測(cè)量不確定度進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果ALT質(zhì)控血清和兩個(gè)濃度獻(xiàn)血者標(biāo)本檢測(cè)20次和20 d的批內(nèi)不精密度<5.0%，批間不精密度<6.7%；正確度估計(jì)通過2014年的原衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)結(jié)果分析和校準(zhǔn)品結(jié)果分析，相對(duì)偏倚均小于1/2CLIA′88允許總誤差；可報(bào)告范圍用直線回歸得到回歸方程Y=0.995 1X-5.618 4，r=0.999 7(R2=0.999 4)，該檢測(cè)范圍內(nèi)結(jié)果準(zhǔn)確；生物學(xué)參考區(qū)間為0.0～32.7 U/L；測(cè)量不確定度為(74.90±3.32)U/L。結(jié)論ALT檢測(cè)方法的性能指標(biāo)均符合ISO15189的預(yù)期要求，該方法可以作為實(shí)驗(yàn)室的血液篩查檢測(cè)方法。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；確認(rèn)；性能驗(yàn)證

為進(jìn)一步提高血站血液篩查實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，保證血液檢測(cè)質(zhì)量，本站于2014年末申請(qǐng)ISO15189質(zhì)量體系認(rèn)證。ISO15189要求實(shí)驗(yàn)室使用的檢測(cè)方法是經(jīng)過確認(rèn)的檢測(cè)方法。本站在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)方法確認(rèn)中，依照ISO15189的要求[1-2]，結(jié)合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[3]，對(duì)定量試驗(yàn)的性能指標(biāo)，包括精密度、正確度、靈敏度、可報(bào)告范圍、生物學(xué)參考區(qū)間以及被測(cè)量值的測(cè)量不確定度6個(gè)方面進(jìn)行驗(yàn)證?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源

1.1.1精密度采用試劑廠家配套質(zhì)控品。北京中生質(zhì)控品(批號(hào)141052，65.3 U/L)，兩個(gè)近期已檢測(cè)的獻(xiàn)血者標(biāo)本(檢測(cè)值為20～50 U/L)。由于當(dāng)時(shí)只有一種濃度的質(zhì)控品，血站ALT臨界值設(shè)定為50 U/L，而臨界值附近的標(biāo)本精密度直接影響血液報(bào)廢率，故選擇用臨界值附近的獻(xiàn)血者標(biāo)本代替。

1.1.2正確度采用原衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評(píng)的標(biāo)本(編號(hào)1451～1455)，英國(guó)朗道校準(zhǔn)品(批號(hào)910UN)。

1.1.3靈敏度采用湖北省臨檢中心PT能力驗(yàn)證標(biāo)本(編號(hào)201513， 96.9 U/L)。

1.1.4可報(bào)告范圍(1)采用參加原衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)成績(jī)合格的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本，高濃度標(biāo)本(761 U/L)，低濃度標(biāo)本(20 U/L)；(2)蒸餾水作為標(biāo)本。

1.1.5生物學(xué)參考區(qū)間采用ALT初篩檢測(cè)(干化學(xué)法)、復(fù)檢(速率法)檢測(cè)合格的獻(xiàn)血者標(biāo)本160份。

1.1.6測(cè)量不確定度采用試劑廠家配套校準(zhǔn)品。北京中生生化多項(xiàng)校準(zhǔn)品(批號(hào)150085))，北京中生ALT非定值質(zhì)控品(74.9 U/L)。

1.2儀器與試劑儀器為美國(guó)貝克曼公司AU400全自動(dòng)生化分析儀，試劑為北京中生公司產(chǎn)品(批號(hào)140571)。

1.3方法

1.3.2正確度估計(jì)通過對(duì)2014年參加原衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)英國(guó)朗道校準(zhǔn)品的結(jié)果進(jìn)行比較，分別計(jì)算相對(duì)偏倚，相對(duì)偏倚小于1/2CLIA′88允許總誤差10%為可接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3靈敏度驗(yàn)證將湖北省臨檢中心PT能力驗(yàn)證標(biāo)本稀釋為90 U/L進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證吸光度變化率是否在廠家濃度為90 U/L的吸光度變化率范圍內(nèi)。

1.3.6測(cè)量不確定度以標(biāo)準(zhǔn)差的形式可提供不確定度的估計(jì)值(稱為標(biāo)準(zhǔn)不確定度)，通過單個(gè)分量方差相加合成測(cè)量過程多個(gè)分量的估計(jì)值，然后取方差合成的平方根Uc(稱為合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度)。這些分量的方差可通過試驗(yàn)方式(稱為A類不確定度)或理論方式(稱為B類不確定度)進(jìn)行估計(jì)。最后，不確定度可表達(dá)為具有規(guī)定包含因子的置信區(qū)間(95%區(qū)間具有包含因子為2的U，即擴(kuò)展不確定度或擴(kuò)展合成不確定度[4])。參照文獻(xiàn)[5]的方法，每天檢測(cè)1次質(zhì)控品，連續(xù)檢測(cè)10 d，計(jì)算日間標(biāo)準(zhǔn)差，不確定度分量的定量Uc=U2(rep)+U2(δ)，U(rep)為重復(fù)測(cè)量的不確定度分量，U(δ)為儀器和試劑帶來的不確定度分量。U(rep)=0.865 U/L(重復(fù)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度)；U(δ1)=0.82 U/L(儀器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度)；U(δ2)=1.15 U/L(校準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)不確定度)。

2　結(jié)　　果

2.1精密度估計(jì)3個(gè)濃度的定值血清的批內(nèi)和批間精密度見表1，批內(nèi)精密度分別為1.446%、2.101%、2.833%，符合批內(nèi)不精密度<5.0%的要求；批間精密度分別為2.360%、1.970%、3.640%，符合批間不精密度<6.7%的要求。

表1　　精密度檢測(cè)結(jié)果

2.2正確度估計(jì)2014年參加原衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)結(jié)果(偏倚分別為-3.03%、-3.03%、-2.82%、-1.74%、-1.41%)和英國(guó)朗道校準(zhǔn)品結(jié)果相對(duì)偏倚比較，原衛(wèi)生部PT結(jié)果偏倚最大值為-3.03%，英國(guó)朗道校準(zhǔn)品偏倚為-1.56%，均小于1/2CLIA′88允許總誤差10%的要求。

2.3靈敏度驗(yàn)證將湖北省臨檢中心PT能力驗(yàn)證標(biāo)本稀釋為90 U/L進(jìn)行檢測(cè)，吸光度變化率為0.020 A/min，在廠家要求的吸光度變化率范圍內(nèi)(0.010～0.080 A/min)。

2.4可報(bào)告范圍6個(gè)濃度的線性物質(zhì)標(biāo)本預(yù)期值X，實(shí)測(cè)值Y，用直線回歸做數(shù)據(jù)處理，得到回歸方程Y=0.995 1X-5.618 4，r=0.999 7(R2=0.999 4)，截距a和斜率b通過t檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為-1.41、-0.42，P>0.05)。蒸餾水檢測(cè)20次結(jié)果的可報(bào)告范圍為1.17～757.70 U/L,在廠家檢測(cè)蒸餾水的線性范圍內(nèi)(10.0～800.0 U/L)。見表2。

表2　　可報(bào)告范圍檢測(cè)結(jié)果(U/L)

2.5生物學(xué)參考區(qū)間160份獻(xiàn)血者標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的生物學(xué)參考區(qū)間為0.0～32.7 U/L。

2.6測(cè)量不確定度根據(jù)Uc的相關(guān)公式，計(jì)算得到Uc為1.66 U/L，擴(kuò)展不確定度U為3.32 U/L(k=2)，測(cè)量不確定度報(bào)告為(74.90±3.32)U/L。

3　討　　論

檢測(cè)方法的確認(rèn)是證實(shí)一種在實(shí)驗(yàn)室使用的方法(檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn))的適用性的過程。對(duì)檢測(cè)方法的確認(rèn)要盡可能全面，并通過客觀證據(jù)(以性能特征形式)證實(shí)滿足檢測(cè)預(yù)期用途的特定要求[1]。方法確認(rèn)是保證實(shí)驗(yàn)室結(jié)果準(zhǔn)確性的前提。對(duì)性能指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，可以獲得該方法能夠得到準(zhǔn)確、穩(wěn)定檢測(cè)結(jié)果的證據(jù)。

精密度的驗(yàn)證最常用的方法是采用穩(wěn)定的標(biāo)本做重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算批內(nèi)精密度和批間精密度。精密度的好壞通常采用不精密度表示，不精密度通常以CV體現(xiàn)。本室檢測(cè)批內(nèi)不精密度均小于5.0%，批間不精密度均小于6.7%，結(jié)果在可接受標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)。正確度評(píng)估采用原衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評(píng)的標(biāo)本和校準(zhǔn)品與靶值的分析比較，2014年的5個(gè)室間質(zhì)評(píng)標(biāo)本與靶值的偏倚在-3.03%～-1.41%范圍內(nèi)，校準(zhǔn)品的偏倚為-1.56%，滿足實(shí)驗(yàn)室的要求。

可報(bào)告范圍驗(yàn)證通常采用配制包含不同分析物濃度的系列標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，將按稀釋比例計(jì)算的預(yù)期值和實(shí)測(cè)值設(shè)置為2個(gè)變量，做線性回歸：回歸直線應(yīng)當(dāng)為過原點(diǎn)、斜率為1的直線，直線所達(dá)的限值即為結(jié)果的檢測(cè)可報(bào)告范圍[6]。本室選用室間質(zhì)評(píng)標(biāo)本高值(761 U/L)、低值(20 U/L)，按比例配制成6個(gè)濃度的系列標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，得到回歸方程為Y=0.995 1X-5.618 4，r=0.999 7(R2=0.999 4)。截距a和斜率b通過t檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，沒有產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性偏倚。用蒸餾水檢測(cè)的可報(bào)告范圍為1.17～757.70 U/L，在廠家檢測(cè)蒸餾水的線性范圍內(nèi)(10.0～800.0 U/L)，可以認(rèn)為該檢測(cè)范圍內(nèi)結(jié)果的報(bào)告范圍可靠。

本研究討論的生物學(xué)參考區(qū)間，檢測(cè)了160份經(jīng)獻(xiàn)血前初篩和復(fù)檢合格的獻(xiàn)血者標(biāo)本，測(cè)得生物學(xué)參考區(qū)間為0.0～32.7U/L，并以其作為獻(xiàn)血人群的參考區(qū)間[7]。測(cè)量不確定度是指表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[8]。測(cè)量不確定度的評(píng)估可在中間精密度條件下通過測(cè)量質(zhì)控物獲得的量值進(jìn)行計(jì)算，這些條

件包括了測(cè)量程序標(biāo)準(zhǔn)操作中盡可能多而合理的常規(guī)變化，如不同批次試劑和校準(zhǔn)物、不同操作者和定期儀器維護(hù)[1]。本室做了試劑、校準(zhǔn)品、儀器的不確定度值，計(jì)算出Uc，得到擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)不確定度，最終確定不確定度報(bào)告為(74.90±3.32)U/L。不確定度值是實(shí)驗(yàn)室測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo)[9]，被測(cè)量值的不確定度越小，測(cè)量質(zhì)量越高[10]。依據(jù)試劑、校準(zhǔn)品和儀器的不確定度的分量值，校準(zhǔn)品分量占的比例最大，提醒研究者要選擇質(zhì)量可靠的校準(zhǔn)品，以提高檢測(cè)質(zhì)量。

通過對(duì)檢測(cè)方法的確認(rèn)，目的是為提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的問題是實(shí)驗(yàn)室一項(xiàng)全面質(zhì)量管理體系的問題。它不僅是一項(xiàng)單純、具體的技術(shù)工作，而且也是實(shí)驗(yàn)室的管理內(nèi)容，如科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓芾碇贫?、正確的操作規(guī)程，以及檢驗(yàn)人員的職業(yè)道德、業(yè)務(wù)素質(zhì)等。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的保證貫穿檢驗(yàn)過程的始終，包括抽樣、制樣、試驗(yàn)、數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析等，直到出具檢驗(yàn)報(bào)告為止。因此還必須按ISO9000系列標(biāo)準(zhǔn)以及ISO15189的要求，建立起完善健全的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系，以確保實(shí)驗(yàn)室的管理要求和技術(shù)要求。

[1]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).ISO15189 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則[S].北京：中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，2008.

[2]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS-CL38醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床化學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說明[S].北京：中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，2012.

[3]孟凡云,丁玉娟,王夕剛.《血站技術(shù)操作規(guī)程》(2012版)研讀[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2013,10(9):397-398.

[4]王治國(guó)．臨床檢驗(yàn)方法確認(rèn)與性能驗(yàn)證[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：160-176．

[5]國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局計(jì)量司．測(cè)量不確定度評(píng)定與表示指南[M]．北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2005：115-163．

[6]金寧娟,王惠民.不同線性評(píng)價(jià)方法在臨床化學(xué)測(cè)量中的應(yīng)用[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2015，36(23):3423-3425.

[7]衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會(huì).WS/T407-2012臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)項(xiàng)目參考區(qū)間的制定[S].北京:衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會(huì),2013.

[8]王治國(guó)．臨床檢驗(yàn)質(zhì)量控制技術(shù)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：22-54．

[9]陳文祥，申子瑜，楊振華．臨床檢驗(yàn)中的測(cè)量不確定度[J]．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30(9)：967-971．

[10]汪子偉．臨床實(shí)驗(yàn)室的量值溯源和測(cè)量不確定度估計(jì)[J]．現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2009，21(8)：797-798．

Confirmation of ALT detection method

ZENGFufang,WUDan,ZHOUJi，TIANFang,PENGDongju

(ShiyanMunicipalBloodCenter，Shiyan,Hubei442000,China)

ObjectiveTo confirm the performance of rate method for detecting ALT in blood donors to verify that it meets the requirements of ISO15189.Methodsaccording to the requirements of CNSA-CL02:2012 the Medical Laboratory Quality and Ability Recognized Standards and the Blood Station Technical Operation Regulations(edition 2012),the precision,accuracy,sensitivity,reportable range,biology reference interval and measurement uncertainty of the detection system were verified.ResultsThe intra-batch imprecision for the ALT quality control serum and 2 concentrations of blood donor sample detected for 20 times and 20 d was<5.0% and the inter-batch imprecision was <6.7%;the correct estimates passed the external quality assessment results of the original Ministry of Public Health in 2014 and calibration results analysis.The relative bias was less than 1/2 of CLIA′88 permissible error;the regression equation of reportable range obtained by the linear regression wasY=0.995 1X-5.618 4，r=0.999 7(R2=0.999 4),the results within the detection range were correct;the biological reference interval was 0.0-32.7 U/L and the measurement uncertainty was (74.90±3.32)U/L.ConclusionThe performance indexes of ALT detection method conform to the expected requirements of ISO15189.This method can be used as a blood screening test method in laboratory.

alanine aminotransferase；confirm；performance verification

曾付芳，女，主管技師，主要從事輸血相關(guān)傳染病防治研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.019

A

1673-4130(2016)17-2406-03

2016-04-03

2016-06-11)