復(fù)合微生物固態(tài)發(fā)酵整粒棉籽的研究

■ 劉倚帆 王星凌 岳壽松 錢 鑫 萬發(fā)春 趙紅波 劉曉牧

（1.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 250100；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

我國是全球棉花產(chǎn)量最高的國家，棉籽產(chǎn)量已超過了1 000萬噸，棉籽脫殼后棉仁中含油脂30%～33%，含蛋白質(zhì)35%～38%，是優(yōu)良的植物油脂資源，也是重要的植物蛋白資源。此外，棉籽中還富含高附加值的棉籽糖、維生素E、木糖醇等，是重要的飼料資源[1]。全棉籽的粗蛋白質(zhì)含量較穩(wěn)定，平均22.5%～24.9%；粗脂肪含量16.9%～24.7%，而中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量很高，分別為39%～52%和29%～40.1%[2]。目前，對(duì)整粒棉籽在牛生產(chǎn)性能上的研究主要集中在奶牛上，育肥肉牛上很少報(bào)道。朱文濤等（2008）[3]研究表明，奶牛日糧中添加8%全棉籽使產(chǎn)奶量提高5.65%；鐘榮珍等研究表明，飼糧中添加全棉籽可以提高奶牛產(chǎn)奶量，改善乳脂品質(zhì)[4]。本團(tuán)隊(duì)在前期利用整粒棉籽進(jìn)行了一系列研究，在一定范圍內(nèi)用全棉籽替代精料中的棉餅和油脂能提高育肥閹牛的生長速度[5]。限制棉籽應(yīng)用的因素包括其自身含有的有毒、有害物質(zhì)如棉酚、硫代葡萄糖苷，以及纖維素、低聚糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子，而且蛋白質(zhì)品質(zhì)較差，蛋氨酸等必需氨基酸含量低且不平衡等，目前通過微生物發(fā)酵方法以脫毒及提高飼用品質(zhì)的報(bào)道都是針對(duì)棉籽粕，但對(duì)整粒棉籽發(fā)酵尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究整粒棉籽經(jīng)微生物有氧發(fā)酵后營養(yǎng)成分、pH值、氨基酸含量及黃曲霉毒素的變化，觀察和評(píng)估棉籽的發(fā)酵效果和營養(yǎng)價(jià)值，從而為棉籽在反芻動(dòng)物飼料中的應(yīng)用提供有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉籽：市售。米曲霉、馬克思克魯維酵母菌均由岳壽松博士實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

棉籽發(fā)酵為有氧發(fā)酵，采用固態(tài)發(fā)酵的方式，米曲霉和酵母菌分別以0.8%和0.2%的接種量接種于7 kg棉籽中，水分含量為30%，發(fā)酵溫度為30℃，在第7、14 d取樣，一份65℃烘干測定初水分，用于常規(guī)飼料成分檢測；一份-20℃保存用于鮮樣測定。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 棉籽發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 棉籽形態(tài)、氣味觀察及霉變比例的測定

每次取樣前先觀察記錄棉籽的形態(tài)及揮發(fā)出的氣味，并測定霉變比例。

1.3.2 pH值測定

在規(guī)定取樣時(shí)間，選取對(duì)照組和發(fā)酵組樣品各10 g，加蒸餾水90 ml，于搖床上100 r/min振蕩30 min，使用pH計(jì)測定其pH值。

1.3.3 常規(guī)營養(yǎng)成分測定

干物質(zhì)（DM）：采用失重法測定；

粗蛋白質(zhì)（CP）：采用凱氏定氮法測定;

粗脂肪（EE）：采用殘余法測定；

有機(jī)物（OM）：采用灰化法測定；

能量（GE）：采用氧彈熱量計(jì)法測定；

Ca、P：采用原子吸收光譜法測定；

酸性洗滌纖維（ADF）：采用NY/T 1459—2007測定；

中性洗滌纖維（NDF）：采用GB/T 20806—2006測定。

1.3.4 氨基酸組成的測定

參考GB/T 18246—2000，采用氨基酸自動(dòng)分析儀測定。

1.3.5 黃曲霉毒素的測定

參考GB/T 5009.23—2006，采用高效液相色譜法測定黃曲霉毒素B1。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵對(duì)整粒棉籽霉變比例的影響（見表2）

表2 米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵對(duì)整粒棉籽霉變比例的影響（W，%）

由表2可知，與對(duì)照組相比，米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵能有效降低整粒棉籽在發(fā)酵過程中的霉變產(chǎn)生，在發(fā)酵第7 d和第14 d發(fā)酵組比對(duì)照組分別降低了60%和50%，差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵對(duì)整粒棉籽pH值的影響(見表3)

表3 米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵對(duì)整粒棉籽pH值的影響

由表3可知，發(fā)酵后7 d與發(fā)酵前的pH值沒有顯著差異，但發(fā)酵后14 d發(fā)酵組pH值升高。同時(shí)，與對(duì)照組相比，發(fā)酵組在第7 d與對(duì)照組差異不顯著，發(fā)酵后14 d pH值極顯著升高（P＜0.01）。

2.3 米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵對(duì)整粒棉籽營養(yǎng)成分的影響（見表4）

表4 米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵對(duì)整粒棉籽營養(yǎng)成分的影響

由表4可知，米曲霉加酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵整粒棉籽第7 d，營養(yǎng)成分如粗蛋白、粗脂肪含量以及能量均高于對(duì)照組，比對(duì)照組分別提高6.2%、5.6%和25.6%，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維低于對(duì)照組。同時(shí)，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后棉籽的粗蛋白、粗脂肪的含量分別提高了12.27%、11.39%，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維降低了5.5%和4.1%。而發(fā)酵第14 d，發(fā)酵組粗蛋白含量低于對(duì)照組，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維高于對(duì)照組。同時(shí)，與發(fā)酵前相比，粗蛋白、磷、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維提高，而鈣含量及能量降低。

2.4 米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵對(duì)整粒棉籽氨基酸組成的影響（見表5及表5續(xù)）

表5 米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵對(duì)整粒棉籽氨基酸組成的影響(g/100 g)

表5(續(xù)) 米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵對(duì)整粒棉籽氨基酸組成的影響(g/100 g)

由表5的試驗(yàn)結(jié)果可知，米曲霉加酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵整粒棉籽第7 d，發(fā)酵組必需氨基酸及總氨基酸含量比對(duì)照組分別提高了3.55%和8.14%，且比發(fā)酵前棉籽氨基酸含量分別提高了22.9%和27.2%，其中必需氨基酸中的蛋氨酸含量比發(fā)酵前提高了59%。但到發(fā)酵第14 d，必需氨基酸及總氨基酸含量均低于對(duì)照組，且比發(fā)酵前氨基酸含量明顯降低。

2.5 米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵對(duì)整粒棉籽黃曲霉毒素B1的影響（見表6）

表6 米曲霉、酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵對(duì)整粒棉籽黃曲霉毒素B1的影響(μg/kg)

由表6可知，發(fā)酵前并未檢測出棉籽中含有黃曲霉毒素B1，在發(fā)酵第7 d，對(duì)照組黃曲霉毒素B1含量高達(dá)340 μg/kg，發(fā)酵組未檢出。發(fā)酵第14 d，對(duì)照組黃曲霉毒素B1含量高達(dá)354 μg/kg，發(fā)酵組未檢出。

3 討論

棉籽脂肪含量18.09%，與大豆脂肪含量相似，比豆粕含量高，其中，不飽和脂肪酸占70%，是反芻動(dòng)物優(yōu)良的能量飼料來源。粗蛋白質(zhì)含量達(dá)30.57%，在常規(guī)原料中僅次于大豆類原料。王平等（2003）[6]研究日糧不同棉籽水平對(duì)肉牛消化率的影響的結(jié)果表明，添加棉籽后對(duì)日糧ADF消化率有顯著促進(jìn)作用，且添加25%棉籽組日糧養(yǎng)分消化率要低于添加13%棉籽組，日糧中粗脂肪消化率明顯提高。但是，棉籽自身含有抗?fàn)I養(yǎng)因子如纖維素、低聚糖等，而且蛋白質(zhì)品質(zhì)較差，必需氨基酸不平衡等因素又導(dǎo)致棉籽在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中受到諸多限制。本試驗(yàn)探討利用微生物發(fā)酵棉籽的適宜的生產(chǎn)模式，以期改善棉籽品質(zhì)，提高其營養(yǎng)價(jià)值，為進(jìn)一步開發(fā)棉籽的應(yīng)用潛力提供理論依據(jù)。

菌種是微生物發(fā)酵取得良好效果的關(guān)鍵，原料經(jīng)發(fā)酵后氣味芳香、適口性好，發(fā)酵過程中可產(chǎn)生多種水解酶，富含B族維生素等；黑曲霉、米曲霉、根霉、木霉等霉菌可以分泌豐富的酶類，如淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等，這些酶能夠促進(jìn)原料中的淀粉、纖維素等高分子化合物分解為單糖，供微生物生長需要；且菌體中蛋白質(zhì)含量也較高，達(dá)到20%～30%，因此，在蛋白質(zhì)飼料的生產(chǎn)中這些種類的霉菌得到廣泛應(yīng)用。夏新成等（2010）[7]利用兩株酵母和一株霉菌對(duì)棉籽粕進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，使底物粗蛋白提高了17.72%。張慶華等（2007）[8]采用熱帶假絲酵母、擬內(nèi)孢霉菌和植物乳桿菌三株菌協(xié)同固態(tài)發(fā)酵棉籽粕，發(fā)酵后蛋白質(zhì)和氨基酸含量顯著提高。吳偉偉（2009）[9]研究了黑曲霉與釀酒酵母混合固態(tài)發(fā)酵對(duì)棉籽餅粕的脫毒效果及提高棉籽餅粕營養(yǎng)價(jià)值的作用，結(jié)果表明，發(fā)酵溫度30℃、接種量15%，發(fā)酵時(shí)間為60 h，使真蛋白含量從32.99%提高到42.40%，必需氨基酸中賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸分別較發(fā)酵前相比增加了31.03%、25.00%和22.23%，而且17種氨基酸的總量較發(fā)酵前相比增加了30.10%。張文舉等（2006）[10]利用熱帶假絲酵母與黑曲霉復(fù)合固體發(fā)酵使棉籽餅底物粗蛋白、總氨基酸、必需氨基酸含量分別提高了27.83%、18.15%、19.18%。研究表明，發(fā)酵處理后底物粗蛋白質(zhì)含量提高的原因：一是，由于微生物大量生長繁殖，而微生物菌體蛋白豐富，從而增加了粗蛋白質(zhì)的含量；二是，微生物通過對(duì)基質(zhì)利用，可大量合成自身所需要的菌體蛋白和細(xì)胞骨架，將其轉(zhuǎn)化成菌體蛋白或分泌蛋白，從而提高了飼料中的蛋白質(zhì)含量。另外，在發(fā)酵過程中同時(shí)也消耗一定量的糖類物質(zhì)，釋放出能量和二氧化碳，糖類物質(zhì)比例降低后從而也導(dǎo)致基質(zhì)中蛋白質(zhì)的單位含量的增加。棉籽是重要的植物性蛋白質(zhì)和能量資源，但由于其中的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量較大，結(jié)構(gòu)緊密，不利于動(dòng)物的消化和吸收，通過微生物發(fā)酵的方法，可將其中的大分子蛋白降解為小分子蛋白及多肽，從而提高動(dòng)物對(duì)其消化利用率。本試驗(yàn)利用米曲霉和酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵，添加量1%，含水量30%，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵第7 d，肉眼可見棉籽上覆蓋一層黃色的米曲霉孢子菌絲，且發(fā)酵組比對(duì)照組霉變比例顯著下降，說明米曲霉具有防止霉變的作用。發(fā)酵后的棉籽營養(yǎng)成分如粗蛋白、粗脂肪含量均高于對(duì)照組，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維低于對(duì)照組，能量高于對(duì)照組。同時(shí)，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后棉籽的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、磷的含量均明顯提高，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維明顯降低，能量明顯提高，表明微生物發(fā)酵對(duì)棉籽的營養(yǎng)價(jià)值改善產(chǎn)生了顯著作用，特別是發(fā)酵7 d必需氨基酸和總氨基酸含量比發(fā)酵組和發(fā)酵前棉籽均有所提高，其中蛋氨酸含量提高了59%，這可能是由于微生物發(fā)酵后微生物菌體蛋白中蛋氨酸含量較高，所以使發(fā)酵后棉籽的蛋氨酸含量也顯著提高。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長和底物的消耗，在發(fā)酵第14 d，雖然發(fā)酵組粗脂肪含量仍高于對(duì)照組，但粗蛋白含量低于對(duì)照組，且中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量升高，尤其是必需氨基酸及總氨基酸含量均低于對(duì)照組，且比發(fā)酵前氨基酸含量明顯降低，說明米曲霉和酵母菌混合固態(tài)有氧發(fā)酵整粒棉籽的最佳時(shí)間在7 d左右。

pH值是發(fā)酵工藝中的一個(gè)重要因素，不同的微生物都有一個(gè)適宜其生長和發(fā)揮活性功能的最適pH值范圍。一般情況下，真菌生長的pH值范圍為3.5～6.0，酵母菌為4.5～7.0[9]。本試驗(yàn)在發(fā)酵第一周（7 d內(nèi)），對(duì)照組和發(fā)酵組pH值均在正常范圍內(nèi)，而到發(fā)酵第二周結(jié)束（第14 d），對(duì)照組pH值為7.54，發(fā)酵組pH值為8.52，高于米曲霉和酵母菌最適生長pH值范圍，這也可能是導(dǎo)致發(fā)酵后期霉菌大量繁殖的原因。

飼料中的霉菌毒素不僅會(huì)對(duì)畜禽健康和生產(chǎn)性能構(gòu)成危害，還會(huì)帶來食品安全問題。齊鳴等(2015)[11]對(duì)飼料中常見霉菌毒素進(jìn)行調(diào)查中指出，棉籽粕黃曲霉毒素B1含量較高，最高污染水平達(dá)3 992.5 μg/kg。本試驗(yàn)在發(fā)酵第7 d、第14 d于對(duì)照組棉籽樣品中均檢測出黃曲霉毒素B1，且含量分別為340、354 μg/kg，而添加米曲霉及酵母菌的發(fā)酵組并未檢出黃曲霉毒素B1。因?yàn)榘l(fā)酵是在開放的環(huán)境下進(jìn)行，參與發(fā)酵的微生物種類較多，易被雜菌污染從而產(chǎn)生黃曲霉毒素。本試驗(yàn)利用米曲霉加酵母菌混合發(fā)酵，嚴(yán)格控制了黃曲霉毒素的產(chǎn)生，是一種安全、可靠的生物控制方法。

4 結(jié)論

①米曲霉和酵母菌復(fù)合固態(tài)有氧發(fā)酵整粒棉籽，能夠提高植物蛋白飼料中粗蛋白、粗脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的含量，并提高必需氨基酸及總氨基酸含量，從而改善飼料品質(zhì)，提高了營養(yǎng)價(jià)值。

②米曲霉和酵母菌復(fù)合固態(tài)有氧發(fā)酵整粒棉籽，能有效降低發(fā)酵過程中植物蛋白飼料的霉變比例，并且米曲霉和酵母菌復(fù)合固態(tài)有氧發(fā)酵整粒棉籽能顯著降解黃曲霉毒素B1。

③米曲霉和酵母菌復(fù)合固態(tài)有氧發(fā)酵整粒棉籽的最佳時(shí)間為7 d，接種量為1%，含水量30%，發(fā)酵溫度30℃。