全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)在遺傳性纖維蛋白原異常家系致病基因的克隆鑒定中的應(yīng)用

劉曉娣　張新友　宋通微　洪澄英

[摘要]目的研究采用全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)在遺傳性纖維蛋白原異常家系致病基因鑒定中的應(yīng)用價(jià)值。方法采集12例遺傳性纖維蛋白原異?；颊呒捌浜诵募彝コ蓡T外周血檢測(cè)凝血指標(biāo)，并提取其基因組DNA進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果，探討遺傳性纖維蛋白原異常的分子機(jī)制。結(jié)果全基因組外顯子測(cè)序結(jié)果顯示：先證者A1、A4以及B2均為FGA基因g，1233G>A突變，A1的妹妹、A4的父親以及B2的母親均攜帶有相同的突變；A2、A7、B4和B5均為FGG基因g，10819G>A突變，家系成員中A2的母親和外婆、A7的姐姐和女兒、B4的母親和B5的母親均攜帶有相同的突變；A3、A5、A6、B1和B3及其相關(guān)親屬共10例攜帶有FGB基因g，9692A>G突變。先證者及家系主要成員中發(fā)生Fg基因突變的成員APTT、PT和TT均明顯延長(zhǎng)，但Fg活性顯著降低。結(jié)論遺傳性纖維蛋白原異?？捎啥喾NFg基因外顯子突變導(dǎo)致，F(xiàn)GB和FGG外顯子突變較為常見。

[關(guān)鍵詞]遺傳性纖維蛋白原異常；全基因組外顯子測(cè)序；家系致病基因；基因突變

[中圖分類號(hào)]R554.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-0616（2016）03-33-04

纖維蛋白原（Fgrinogen，F(xiàn)g）能夠在凝血酶作用下修飾成為纖維蛋白，在止血過程中發(fā)揮重要的生理作用，同時(shí)又可激活纖溶系統(tǒng)防止血栓的形成，F(xiàn)g在集體出血與止血平衡中發(fā)揮重要的作用。遺傳性異常纖維蛋白原血癥（inheriteddvsfgrinogenemia）是人群中罕見的一種常染色體雜合顯性遺傳病，純合顯性遺傳者少見，該病發(fā)病率低，患者多數(shù)僅表現(xiàn)為輕微隱匿性癥狀。Fg基因較為復(fù)雜，從分子發(fā)病機(jī)制上方能很好地研究和診斷遺傳性異常纖維蛋白原血癥。本研究于2015年1～8月針對(duì)我院收集的遺傳性纖維蛋白原異?；颊呒捌渚哂兄苯友夑P(guān)系的親屬和正常健康者，進(jìn)行表型和基因分析，旨在從功能上探討遺傳性纖維蛋白原異常的分子發(fā)病機(jī)制。

1.資料與方法

1.1一般資料

選取遺傳性纖維蛋白原異?；颊呒捌渚哂兄苯友夑P(guān)系的親屬和正常健康者參與本研究。其中，已確診的該疾病2個(gè)家系先證者共計(jì)12例，A家系7例，B家系5例先證者家系中的核心家系內(nèi)成員共26例，A家系15例，B家系11例；正常健康者200例。12例先證者中有5例因消瘦原因就診，生化檢查表現(xiàn)為凝血酶原時(shí)間（PT）及凝血酶時(shí)間（TT）延長(zhǎng)，活化部分凝血時(shí)間（Am）正常，纖維蛋白原（Fg）活性明顯降低；3例先證者無臨床癥狀，但易發(fā)生瘀斑、傷口愈合延遲，有自發(fā)流產(chǎn)史；4例先證者表現(xiàn)為經(jīng)期經(jīng)血過多，凝血較差，術(shù)前檢查為TT顯著延長(zhǎng)，F(xiàn)g活性下降。所有先證者平常均無自發(fā)出血、血栓病史，心腦、肝、腎功能均正常，所在家系中無近親結(jié)婚史，所有成員亦無自發(fā)出血、血栓病史，心腦、肝、腎功能均正常。

所有患者在采集血液等樣本和個(gè)人信息時(shí)均知情同意并簽字，本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2研究方法

1.2.1樣本收集及處理在知情同意的情況下，采集患者、家系成員靜脈血，以0.109mol/L枸櫞酸鈉1：9抗凝，4℃下1500rpm離心15min，將血漿-進(jìn)行分裝于潔凈凍存管中進(jìn)行標(biāo)記，冷凍于70℃超低溫冰箱保存。提取所有研究對(duì)外周血細(xì)胞中基因組DNA進(jìn)行外顯子測(cè)序，-80%保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2家系基因分析通過QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp DNA Blood Mini Kit提取從采集的血漿樣本中提取研究對(duì)象的基因組DNA作為下步基因擴(kuò)增的模板。家系基因分析采用測(cè)序方法找尋突變位點(diǎn)，測(cè)序方法為全基因組外顯子測(cè)序。

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（NationalCenter of Biotechnology Information，NCBI）基因庫中公布的Fg基因序列（FGB ID：2244；FGA ID：2243；FGG ID：2266），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)23對(duì)引物以覆蓋Fg基因的24個(gè)外顯子區(qū)域及其啟動(dòng)子序列，其中FGA引物5對(duì)，F(xiàn)GB引物8對(duì)，GGG引物10對(duì)。將提取得到的DNA隨機(jī)打斷，將片段化的DNA分子在酶的作用下補(bǔ)齊隨機(jī)打斷造成的黏性末端而成為平末端，連接接頭，通過NimbleGen外顯子序列捕獲芯片捕獲目標(biāo)外顯子區(qū)域，檢測(cè)其捕獲效率；然后對(duì)捕獲的目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物連接后隨機(jī)打斷，末端補(bǔ)平及加“A”堿基，連接測(cè)序接頭，PCR擴(kuò)增并檢測(cè)序文庫的質(zhì)量，最后利用illumina公司NextSeq 500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：上下游引物各1.5uL、模板DNA 2uL、dNTP混合物2uL、10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5uL、Taq DNA聚合酶0.2uL、無菌超純水15.3uL，總體積25uL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30sec→95℃變性30sec→52～63℃退火30sec→72℃延伸45sec。

1.2.3表型分析將采集的研究對(duì)象的外周血，以0.109mol/L枸櫞酸鈉1：9抗凝，4℃下3000rpm離心10min，取血漿檢測(cè)凝血酶原時(shí)間（PT）、活化的部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）、Fg活性。

2.結(jié)果

2.1家系基因分析結(jié)果

家系A(chǔ)和B中的12例先證者纖維蛋白原基因分析結(jié)果見表1，先證者A1、A4以及B2均為FGA基因第2外顯子g，1233G>A突變，A1的妹妹、A4的父親以及B2的母親均攜帶有相同的突變；A2、A7、B4和B5均為FGG基因第8外顯子g，10819G>A突變，家系成員中A2的母親和外婆、A7的姐姐和女兒、B4的母親和B5的母親均攜帶有相同的突變；A3、A5、A6、B1和B3及其相關(guān)親屬共10例攜帶有FGB第4外顯子g.9692A>G突變。家系其他成員及健康對(duì)照基因檢測(cè)均未發(fā)現(xiàn)異常。見表1。

2.2先證者及主要家系成員表型檢測(cè)結(jié)果

表2中為先證者及主要家系成員表型檢測(cè)結(jié)果，可見所有先證者APTT、PT和TT等三項(xiàng)凝血指標(biāo)均有明顯延長(zhǎng)，但Fg活性明顯降低。經(jīng)全基因組外顯子測(cè)序確認(rèn)發(fā)生基因突變的家系主要成員APqT、PT和TI"等三項(xiàng)凝血指標(biāo)也存在明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)g活性明顯降低的現(xiàn)象。其他家系成員和健康者四項(xiàng)指標(biāo)均正常。

3.討論

纖維蛋白原由3條同源多肽鏈Aα、Bβ、γ聚合而成的六聚物（AαBβ γ），這三條多肽鏈分別由FGA、FGB和FGG基因編碼，且三個(gè)基因?yàn)橥椿颍蚨ㄎ挥?q28-4q31約50kb的染色體區(qū)域內(nèi)，按5→3方向依次為FGG、FGA和FGB。三個(gè)基因中的任何一個(gè)發(fā)生突變均可導(dǎo)致纖維蛋白原出現(xiàn)數(shù)量及功能上異常，研究表明FGA基因突變占所有纖維蛋白原基因突變中的多數(shù)。纖維蛋白原異常對(duì)纖維蛋白肽釋放、聚集、穩(wěn)定性、交聯(lián)，纖溶均能產(chǎn)生影響。遺傳性異常纖維蛋白原血癥是由于纖維蛋白原基因發(fā)生突變產(chǎn)生的一種纖維蛋白原結(jié)構(gòu)和功能異常的遺傳性疾病，常表現(xiàn)為APTT、PT和TT等凝血指標(biāo)延長(zhǎng)、Fg活性降低等。目前，基因突變檢測(cè)是遺傳性異常纖維蛋白原血癥臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但在臨床診斷時(shí)還需要分析其臨床表現(xiàn)、凝血功能指標(biāo)和家系情況。

外顯子序列進(jìn)展人類基因組序列的不足1%，單包含有85%以上的人類基因信息，人類多數(shù)遺傳疾病均是由于相應(yīng)基因外顯子區(qū)域發(fā)生突變所致。全基因組外顯子測(cè)序技術(shù)是近年來發(fā)展起來的用于尋找人類基因致病基因及發(fā)病機(jī)制的一種方法，李斌等利用全外顯子組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了基因c.1735 1736insT框移突變?yōu)镵allmann綜合征為新的疑似致病性突變。

本研究中，先證者A1、A4以及B2均為FGA基因第2外顯子g.1233G>A突變，A1的妹妹、A4的父親以及B2的母親均攜帶有相同的突變；A2、A7、B4和B5均為FGG基因第8外顯子g.10819G>A突變，家系成員中A2的母親和外婆、A7的姐姐和女兒、B4的母親和B5的母親均攜帶有相同的突變；A3、A5、A6、B1和B3及其相關(guān)親屬共10例攜帶有FGB基因第4外顯子g.9692A>G突變。先證者及家系主要成員中發(fā)生Fg基因突變的成員APTT、PT和TT均明顯延長(zhǎng)，但Fg活性顯著降低。

FGA基因g.1233G>A突變能導(dǎo)致Aα中的Arg35被His或者Cys替代，是纖維蛋白原異常中最常見的突變，能使影響凝血酶對(duì)纖維蛋白原肽的釋放，抑制纖維蛋白聚合。FGB基因g.9692A>G突變可導(dǎo)致纖維蛋白原糖基之間可以通過相互排斥力使纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，從而調(diào)節(jié)纖維蛋白形成，糖基化影響纖維蛋白初限位的相互交聯(lián)和纖維聚集，但由于這種改變沒有影響到主要的聚集位點(diǎn)，纖維蛋白未受到關(guān)鍵影響，患者多無臨床表現(xiàn)。FGG基因g.10819G>A突變常導(dǎo)致γ鏈中的Arg301發(fā)生變化。γArg301是纖維蛋白初纖維過程中D-D接觸面上的重要位點(diǎn)之一，對(duì)于纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成所必需的，該位點(diǎn)的突變能夠影響纖維蛋白正常結(jié)構(gòu)和聚集功能，多數(shù)突變基因攜帶者無臨床癥狀。

綜上，遺傳性纖維蛋白原異?？捎啥喾NFg基因外顯子突變導(dǎo)致，F(xiàn)GB和FGG外顯子突變較為常見，這可能與地域有關(guān)。