免疫磁珠分選法原代培養(yǎng)小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞

周玲萍，馮成，湯雪斌，徐紅蕾

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015）

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免疫磁珠分選法原代培養(yǎng)小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞

周玲萍，馮成，湯雪斌，徐紅蕾

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015）

目的：探討一種高效、穩(wěn)定的小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVECs）原代培養(yǎng)方法。方法：選取45 只1周齡Balb/c小鼠，隨機(jī)分成3組，分別用酶消化法、組織貼塊法、免疫磁珠分選法3種方法分離培養(yǎng)小鼠PMVECs，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及VI I I因子相關(guān)抗原免疫熒光染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)算各組原代培養(yǎng)成功率及從原代培養(yǎng)開始到首次傳代所需時(shí)間，測定細(xì)胞純度，MTT法繪制生長曲線。結(jié)果：3組原代培養(yǎng)的細(xì)胞在倒置顯微鏡下均能見到短梭形、多邊形的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物VI I I因子相關(guān)抗原表達(dá)陽性。免疫磁珠分選法組原代培養(yǎng)成功率及細(xì)胞活性顯著高于其他2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），從原代培養(yǎng)至首次傳代所需的時(shí)間短于組織貼塊法組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），細(xì)胞純度顯著高于酶消化法組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：相比于酶消化法與組織貼塊法，免疫磁珠分選法原代培養(yǎng)小鼠PMVECs具有重復(fù)性好，分離速度快，細(xì)胞純度高及活性好的優(yōu)點(diǎn)。

細(xì)胞培養(yǎng)；原代培養(yǎng)；免疫磁珠；肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞

建立高效的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）體外培養(yǎng)方法對急性肺損傷等疾病發(fā)病機(jī)制及藥物治療等方面的研究起著重要作用。目前文獻(xiàn)報(bào)道體外培養(yǎng)PMVECs的方法主要有酶消化法、組織塊培養(yǎng)法、免疫磁珠分選法，但由于PMVECs較脆弱難成活、生長緩慢、易污染、不易純化等原因，目前其培養(yǎng)仍是一個(gè)難題。本研究對上述3種PMVECs體外培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，明確不同培養(yǎng)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，探討出一種穩(wěn)定的PMVECs培養(yǎng)方法。

1　材料和方法

1.1材料 健康1周齡Balb/c小鼠45只，雌雄不限，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。EndothelialCell Medium（Sciencell公司），F(xiàn)BS（Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司），I型膠原酶（Gibco公司），大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體（Invitrogen公司），羊抗大鼠IgG磁珠（New England公司），兔抗人VI I I因子相關(guān)抗原多克隆抗體（Santa公司），IV型膠原酶（Gibco公司），中性蛋白酶（Roche公司），MTT（Sigma公司）。

1.2方法

1.2.1分組與肺組織的分離：取Balb/c小鼠45只，隨機(jī)分為酶消化法組、組織貼塊法組、免疫磁珠分選法組，每組各15只。用10%水合氯醛（0.35 mL/ 100 g）麻醉后置75%乙醇浸泡消毒3 min。將小鼠置無菌操作盤上，用無菌眼科剪、眼科鑷逐層打開胸腔暴露心肺，自右心室心尖處進(jìn)針緩慢推注10 mL DMEM液（含肝素與雙抗），直至肺組織發(fā)白。剪取小鼠心肺組織置DMEM液中，移入超凈臺內(nèi)備用。

1.2.2細(xì)胞原代培養(yǎng)：酶消化法［2］：超凈臺內(nèi)剪取肺組織，加入0.25%胰蛋白酶5 mL消化5 min。將周緣肺組織剪碎成盡可能小的組織塊。將組織塊吸入離心管中，加入3 mL IV型膠原酶（2.25 mg/mL），培養(yǎng)箱消化10 min。再加入3 mL中性蛋白酶（10 mg/mL）消化15 min，期間每5 min振蕩1次。置離心機(jī)上1 000 r/min離心5 min，棄上清，用10 mL DMEM（含10% FBS）重懸成細(xì)胞懸液。200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后制備單細(xì)胞懸液，離心后棄上清。加入3 mL ECM重懸后接種到1%明膠包被的6孔板中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2 h后換液除去未貼壁及壞死細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，此后每2 d換液1次。②組織貼塊法［3］：在超凈臺內(nèi)剪取肺組織，加入0.25%胰蛋白酶5 mL消化5 min。周緣肺組織剪成1×1×1 mm3大小組織塊，均勻鋪在盛有500 μL FBS的35 mm培養(yǎng)皿中，置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。45 min后將組織塊取出并均勻貼入1%明膠包被的6孔板中，斜置培養(yǎng)箱中固化1 h。加入500 μL ECM培養(yǎng)基，平置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后追加500 μL ECM培養(yǎng)基，60 h后將組織塊去除并換液，此后每2 d換液1次。③免疫磁珠分選法［4］：CD31抗體磁珠配制：超凈臺內(nèi)取20 μL羊抗兔IgG磁珠，加入預(yù)冷的DMEM（含10% FBS）1 mL，混勻，置磁力分選架上靜置2 min，吸棄DMEM，重復(fù)3次，最后用90 μL DMEM（含10% FBS）重懸。取10 μL大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體加入上述磁珠DMEM中合成100 μL，混勻，4 ℃冰箱孵育過夜，期間反復(fù)振蕩。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天在超凈臺內(nèi)用DMEM漂洗心肺組織2次，肺周緣組織剪碎成盡可能小的組織塊。加入10 mL I型膠原酶（1 mg/mL），置培養(yǎng)箱中消化60 min，每15 min振蕩1次。1 000 r/min離心5 min，棄上清，用預(yù)熱的10 mL DMEM（含10% FBS）重懸。用200目細(xì)胞濾網(wǎng)將細(xì)胞過濾到無菌離心管中，反復(fù)離心重懸2次，最后用DMEM（含10% FBS）重懸成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋成細(xì)胞數(shù)1×107/mL的細(xì)胞懸液，分裝至1.5 mL EP管內(nèi)，每個(gè)EP管中加入1 mL細(xì)胞懸液。取出提前配制的CD31抗體磁珠用DMEM（含10% FBS）清洗4次后加入細(xì)胞懸液中?；靹蚝笾? ℃冰箱孵育，每10 min輕微振蕩1次。2 h后將EP管靜置磁力分選架上，10 min后吸棄上清液。加入1 mL ECM培養(yǎng)基反復(fù)清洗后轉(zhuǎn)入1%明膠包被的6孔板內(nèi)，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1只小鼠肺組織分離獲得的細(xì)胞在同一孔內(nèi)培養(yǎng)。48 h后換液除去磁珠，此后每2 d換液1次。

1.2.3細(xì)胞傳代：細(xì)胞長至80%～90%融合時(shí)即可傳代，吸出原有培養(yǎng)液，PBS液清洗后加入0.25%胰蛋白酶。消化2～3 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞間連接疏松，細(xì)胞成片收縮時(shí)吸出消化液，加入DMEM（含10% FBS）終止消化。用吸管反復(fù)吹打，收集細(xì)胞懸液至離心管，1 000 r/min離心5 min。棄上清，ECM培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。首次傳代細(xì)胞傳至25 cm培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，此后按1:2傳代。

1.2.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)學(xué)變化，計(jì)算小鼠PMVECs原代培養(yǎng)成功率、從原代培養(yǎng)開始到首次傳代所需時(shí)間。

1.2.5PMVECs的鑒定：采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測VI I I因子相關(guān)抗原。培養(yǎng)的第2代細(xì)胞接種至放有蓋玻片的6孔板內(nèi)，制備細(xì)胞爬片。100%甲醇-20 ℃固定20 min，0.2% Triton X-100穿膜15 min，3% H2O2孵育15 min，封閉血清封閉20 min。滴加兔抗人VI I I因子相關(guān)抗原（1:200）50 μL，4 ℃孵育過夜，滴加熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:100）室溫避光孵育1 h，隨后緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、攝片。陰性對照選PBS代替一抗。

1.2.6PMVECs純度的測定：采用1.2.5的方法將PMVECs上的VI I I因子相關(guān)抗原染成綠色，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察免疫熒光染色陽性的PMVECs，計(jì)算出陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，并計(jì)算同一視野普通光條件下細(xì)胞總數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)下列公式計(jì)算PMVECs的純度。

PMVECs純度=（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%

1.2.7PMVECs生長曲線的測定：取第2代培養(yǎng)細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化、離心后加入ECM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后（每孔1×107個(gè)）接種于96孔板內(nèi)，每孔接種100 μL，設(shè)空白組。第2天起每天取5孔細(xì)胞，用200 μL DMEM換液，加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，置培養(yǎng)箱孵育4 h后小心吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫分析儀于490 nm波長處檢測各孔光吸收值（OD值），連續(xù)測定10 d，未測定細(xì)胞每3 d換液1次，以時(shí)間為橫軸，平均OD值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用表示，樣本均數(shù)的比較采用方差分析，以LSD法進(jìn)行兩兩比較，樣本率的比較采用行×列的x2檢驗(yàn)，以行×列表分割后進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 3種培養(yǎng)方法的細(xì)胞生長情況及形態(tài)學(xué)變化如下：①酶消化法組：4次原代培養(yǎng)2 d后見大量未貼壁細(xì)胞，換液后僅遺留少許圓形貼壁不良細(xì)胞，未見內(nèi)皮細(xì)胞生長，其他11次見細(xì)胞貼壁生長，顯微鏡下可見短梭形、多邊形等內(nèi)皮細(xì)胞生長，存在較多圓形貼壁不良細(xì)胞，換液后不能除去，傳代后細(xì)胞體積增大，生長活性降低，很少能匯合長滿培養(yǎng)瓶底（見圖1A）；②組織貼塊法組：2次出現(xiàn)細(xì)菌污染，2次未見內(nèi)皮細(xì)胞游出，6次原代培養(yǎng)至21 d細(xì)胞仍未能長滿培養(yǎng)板底，不能進(jìn)行傳代，5次在培養(yǎng)24 h后PMVECs開始游出，60 h后游出的內(nèi)皮細(xì)胞及紅細(xì)胞圍繞組織塊周圍，多次換液后紅細(xì)胞可除去，培養(yǎng)細(xì)胞多呈短梭形、多邊形，融合的單胞層具有血管內(nèi)皮細(xì)胞典型的鋪路石樣形態(tài)，純度高，雜細(xì)胞少（見圖1B）；③免疫磁珠分選法組：2次培養(yǎng)2 d后僅見少量PMVECs貼壁生長，繼續(xù)培養(yǎng)后不能長滿培養(yǎng)板底部，1次經(jīng)第2次傳代后生長緩慢，培養(yǎng)15 d仍未長滿培養(yǎng)瓶底，其他12次細(xì)胞傳代后生長良好，原代培養(yǎng)2 d后可見免疫磁珠附著在細(xì)胞表面，經(jīng)換液后大多磁珠從細(xì)胞表面脫落（見圖1C），細(xì)胞融合成單層呈典型鋪路石樣排列，純度高，過度生長時(shí)呈紡錘狀，傳代后細(xì)胞增殖活躍，3～5 d可再次傳代。

圖2　小鼠PMVECs VI I I因子相關(guān)抗原免疫熒光染色陽性（×200）

2.2免疫熒光法檢測VI I I因子相關(guān)抗原 熒光顯微鏡下，經(jīng)免疫熒光染色的培養(yǎng)細(xì)胞胞漿呈綠色熒光，細(xì)胞呈短梭形、多邊形（見圖2），陰性對照無熒光染色，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。

2.33組原代培養(yǎng)PMVECs成功率的比較 將能進(jìn)行2次以上細(xì)胞傳代視為原代培養(yǎng)成功1次。免疫磁珠分選法組成功率明顯高于其他2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），組織貼塊法組成功率明顯高于酶消化法組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1　3組原代培養(yǎng)小鼠PMVECs成功率、首次傳代所需時(shí)間及純度的比較

2.43組培養(yǎng)PMVECs從原代培養(yǎng)開始到首次傳代所需時(shí)間的比較 酶消化法組首次傳代時(shí)間明顯短于其他2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），免疫磁珠分選法組首次傳代時(shí)間明顯短于組織貼塊法組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.53組培養(yǎng)PMVECs第2代純度的比較 免疫磁珠分選法組純度顯著高于酶消化法組（P＜0.01），組織貼塊法組純度顯著高于酶消化法組（P＜0.01），免疫磁珠分選法組與組織貼塊法組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.63組培養(yǎng)PMVECs生長曲線的比較 免疫磁珠分選法組細(xì)胞活性明顯高于酶消化法組（P＜0.01），免疫磁珠分選法組細(xì)胞活性高于組織貼塊法組（P＜0.05），組織貼塊法組細(xì)胞活性明顯高于酶消化法組（P＜0.01），見圖3。

圖3　3組培養(yǎng)小鼠PMVECs生長曲線

3　討論

自1973年首次體外成功培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以后［1］，內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)不斷改進(jìn)，但是大多為大血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，而微血管內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、基因表型及功能上與其都有很大區(qū)別，并且微血管內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)為組織器官特異性。故在對炎癥、感染、免疫、腫瘤的生長及移植排斥反應(yīng)等微血管病變的研究中應(yīng)選取微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為研究的細(xì)胞模型［2］。目前用于微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代體外培養(yǎng)的方法主要有酶消化法、組織貼塊法和免疫磁珠分選法。

酶消化法中，本研究采用Kim等［2］報(bào)道的培養(yǎng)方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，運(yùn)用中性蛋白酶聯(lián)合IV型膠原酶分離PMVECs。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)該法雖能快速從小鼠肺組織中獲得PMVECs，但是出現(xiàn)了眾多文獻(xiàn)中所報(bào)道的問題，如細(xì)胞純度不高，重復(fù)試驗(yàn)成功率低，經(jīng)傳代后細(xì)胞活性低，消化時(shí)間、酶濃度較難把握。組織貼塊法是目前應(yīng)用較多的PMVECs培養(yǎng)方法，該法避免了消化酶的化學(xué)損傷及組織剪碎過程對細(xì)胞的機(jī)械損傷［5］。在培養(yǎng)過程中，采用了高潤娣等［3］報(bào)道的PMVECs培養(yǎng)方法并適當(dāng)改進(jìn)。在實(shí)驗(yàn)中能獲得高純度的小鼠PMVECs，但是由于剪取的小鼠肺周緣組織量少，經(jīng)過60 h貼壁組織周邊游走出的內(nèi)皮細(xì)胞量少，且分布不均勻，很難形成單層生長，延長了原代培養(yǎng)周期，以致在首次傳代時(shí)很多細(xì)胞出現(xiàn)老化現(xiàn)象，降低了培養(yǎng)成功率及細(xì)胞活性。最后本研究沿用了Hewett等［4］的微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法并進(jìn)行了改進(jìn)，采用I型膠原酶消化肺組織獲得細(xì)胞懸液，再利用CD31抗體磁珠陽性分選獲得短梭形、多邊形的細(xì)胞，密度高時(shí)呈典型的鋪路石樣排列，VI I I因子相關(guān)抗原免疫熒光染色呈陽性，鑒定為微血管內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量多，生長快，細(xì)胞純度高，可達(dá)80%以上，并且原代培養(yǎng)7 d可進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞生長活性好。該法既克服了酶消化法純度低，細(xì)胞活性差的缺點(diǎn)，又克服了組織貼塊法細(xì)胞數(shù)量少，原代培養(yǎng)周期長的缺點(diǎn)，是一種較高效的PMVECs原代培養(yǎng)方法。該方法的最大缺點(diǎn)是抗體磁珠費(fèi)用高，細(xì)胞培養(yǎng)成本高，因此限制了其大規(guī)模使用，本研究采用羊抗兔IgG磁珠與大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體自行制備CD31抗體磁珠，而非直接購買抗體磁珠，大大降低了成本。隨著細(xì)胞傳代次數(shù)增多，細(xì)胞體積逐漸增大，生長速度減慢，這可能是長期體外培養(yǎng)條件不適合細(xì)胞生長引起的終末分化等引起。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)5代內(nèi)細(xì)胞生長快且形態(tài)穩(wěn)定，適合臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。

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［2］KIM N S，KIM S J. Isolation and cultivation of microvascular endothelial cells from rat lungs： effects of gelatin substratum and serum［J］. Yonsei Med J，1991，32（4）： 303-314.

［3］高潤娣,曹婕,盧珊,等. 小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及其血管形成功能的研究[J]. 中國病理生理雜志,2012,28(1): 186-188,192.

［4］HEWETT P W，MURRAY J C. Human lung microvessel endothelial cells： isolation，culture，and characterization［J］. Microvasc Res，1993，46（1）： 89-102.

［5］陳瑞華,趙自剛,牛春雨,等. 大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)[J]. 中國微循環(huán),2007,11(1): 16-19.

（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

Comparison of different methods for mouse pulmonary microvascular endothelial cells culture

ZHOU Lingping，F(xiàn)ENG Cheng，TANG Xuebin，XU Honglei. Department of Pulmonary and Critical Care Medicine，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015

Objective： To explore an effcient and stable method for the mouse pulmonary microvascular endothelial cells （PMVECs） culture. Methods： Forty-fve 1 week old Balb/c mice were randomly divided into three groups. Mouse PMVECs were isolated and cultured respectively by enzyme digestion method，explants method and immunimagnetic beads method. Cells were identifed by morphological observation and VIII factor related antigen immunofuorescence staining. The success rate of primary culture and the time required from primary culture to the beginning of the frst passage was calculated，the cell purity was determinated，growth curves were drew by MTT method. Results： Short spindle and polygonal microvascular endothelial cells were observed in all of the three methods. Those cells were positive to the VIII factor related antigen. The success rate and cell activity in immunomagnetic beads method group increased signifcantly compared with the other two groups （P＜0.01）. As for the time required from primary cultured to the beginning of the frst passage，it decreased in immunomagnetic beads method group compared with the explant method group （P＜0.05）. And the purity increased significantly in immunomagnetic beads method group compared with the enzyme digestion method group （P＜0.01）. Conclusion： Immunomagnetic beads method is of higher repeatability，rapider separation，and obtains much higher purity and better activity mice PMVECs.

cell culture； primary culture； immunomagnetic beads； pulmonary microvascular endothelial cells

R331

B DOI： 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.08.010

2015-06-08

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY12H01001）。

周玲萍（1987-），女，浙江龍泉人，住院醫(yī)師。

徐紅蕾，教授，Email：601282329@qq.com。