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    響應(yīng)面法優(yōu)化魚尾鰭抗氧化肽酶解工藝

    2016-09-29 00:49:44蘇現(xiàn)波王更先
    關(guān)鍵詞:尾鰭多肽底物

    蘇現(xiàn)波 王更先

    (邯鄲學(xué)院,河北 邯鄲 056005)

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    響應(yīng)面法優(yōu)化魚尾鰭抗氧化肽酶解工藝

    蘇現(xiàn)波王更先

    (邯鄲學(xué)院,河北 邯鄲 056005)

    對酶解法制備魚尾鰭抗氧化肽的最佳工藝進行探討,以期為豐富魚尾鰭應(yīng)用領(lǐng)域,開發(fā)高附加值水產(chǎn)品提供理論依據(jù)。以羥自由基清除率為評價指標(biāo),通過響應(yīng)面分析得到最佳酶解工藝為:底物濃度15%(w/v),酶解pH=8.403,溫度54.02℃,加酶量0.6%(w/w),酶解時間3 h。在此最優(yōu)條件下制備的魚尾鰭抗氧化肽產(chǎn)物對羥自由基的清除率為82.09%,與理論值相比相對誤差為1.38%。同時測得此酶解條件下,魚尾鰭多肽得率為31.68%。

    魚尾鰭;抗氧化肽;酶解;羥自由基;響應(yīng)面法

    我國是世界上主要的漁業(yè)生產(chǎn)國,但魚類加工會產(chǎn)生大量的下腳料,包括魚頭、魚骨、內(nèi)臟和魚尾鰭等,約占原料魚的40%~55%[1]。據(jù)統(tǒng)計,2003年我國魚類加工的廢棄物總量就達到200萬噸以上。目前,發(fā)達國家的水產(chǎn)品加工率在80%以上,而我國的水產(chǎn)品加工率不足30%[2]。這些下腳料中不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素,還含有多種活性物質(zhì)。因此合理開發(fā)利用這些低值水產(chǎn)品下腳料具有一定的經(jīng)濟效益和社會意義。

    魚尾鰭中粗蛋白含量高達40%左右[3],可作為優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)蛋白的來源。目前工業(yè)上只是將魚尾鰭加工成飼料魚粉,或是作為廢料處理,造成資源的極大浪費和環(huán)境污染。魚類多肽不僅具有魚類蛋白質(zhì)的優(yōu)點,在功能特性與生物活性方面又得到極大的改善,具有良好的溶解性、熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)以及易消化吸收、抗氧化活性、降血壓活性等生理功能[4],近年來得到國內(nèi)外學(xué)者的研究和推崇[5~7]。因此本文采用酶解方法制備魚尾鰭抗氧肽,利用單因素實驗和響應(yīng)面分析優(yōu)化得到最佳酶解工藝,最終獲得高得率和抗氧化性的魚尾鰭酶解產(chǎn)物,從而為魚尾鰭的開發(fā)利用提供理論依據(jù),減少環(huán)境污染并提高水產(chǎn)品加工的附加值。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    魚尾鰭(邯鄲市菜市場);堿性蛋白酶(BR 南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司);牛血清白蛋白(BR 上海如吉生物科技有限發(fā)展公司);Tris試劑(GR Sigma);福林酚試劑(BR 國藥集團);磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS)、硼砂、硫酸銅、酒石酸鈉、硫酸鈉、鹽酸、抗壞血酸、鄰苯三酚、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫(AR 國藥集團)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    JA3003B型電子天平(上海精天電子儀器有限公司);SHZ-B水浴恒溫震蕩器(上海將任實驗設(shè)備有限公司);HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海將任實驗設(shè)備有限公司);PHS-25數(shù)顯酸度計(杭州雷磁分析儀器廠);JYL-C022型九陽料理機(九陽股份有限公司);5810型臺式高速離心機(德國艾本德股份公司);FD-1A-50冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);722可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 原料預(yù)處理

    將魚尾鰭剔除魚肉洗凈后冷凍干燥,打成粉備用。

    1.3.2 魚尾鰭中各組分的含量分析

    蛋白質(zhì)測定:GB/T5009.5—2010 凱氏定氮法;灰分測定:GB/T5009.4-2010 灼燒法;水分測定:GB/T5009.3-2010 干燥法;脂肪測定:氯仿-甲醇法[8];總糖測定:蒽酮比色法[9]。

    1.3.3 魚尾鰭抗氧化肽的制備

    稱取15 g魚尾鰭粉末,加入250 mL具塞三角瓶中,加入一定量去離子水,使其底物濃度為15%(w/v),攪拌均勻,調(diào)節(jié)溶液pH=9.0,60℃下水浴震蕩30 min后加入0.6%堿性蛋白酶開始水解,待酶解3 h后快速于99℃滅活10 min,冷卻后9800 r/min離心28 min,去除上清液中微量油脂及底部沉淀,收集中間部位清液備用。

    1.3.4 堿性蛋白酶單因素實驗

    按照1.3.3魚尾鰭抗氧化肽制備方法,分別考察底物濃度、pH、溫度、加酶量和酶解時間五種因素[10]對魚尾鰭抗氧化肽多肽得率和抗氧化活性的影響。

    各因素水平分別為:底物濃度:5%、10%、15%、20%、25%;pH:7.0、8.0、9.0、10.0;酶解溫度:40℃、50℃、60℃、70℃;加酶量: 0.2%、0.6%、1.0%、1.4%(w/w);酶解時間:2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。

    1.3.5 多肽得率的測定

    牛血清白蛋白對照品溶液:精確稱量2.5 mg牛血清白蛋白,用蒸餾水定容于25 mL容量瓶。

    標(biāo)準曲線的制備:精密移取對照品溶液0.0 mL,0.5 mL,1 mL,1.5 mL,2 mL,分別置于具塞試管中,各加水至2.0 mL。再分別加入5 mL試劑C(VA液:VB液=1:50;A液為0.5 g硫酸銅和1.0 g酒石酸鈉溶于100 mL蒸餾水中,B液為20.0 g碳酸鈉和4.0 gNaOH溶解于1 L蒸餾水),混勻于室溫下放置10 min后,各加入0.5 mL試劑D(Folin-酚試劑),立即混勻,室溫下放置30 min,然后于750 nm處測定其吸光度值。同時以0號管為空白,對照品溶液濃度為橫坐標(biāo),其相對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo),計算線性回歸方程。

    樣品的測定:量取1.0 mL酶解液,依標(biāo)準曲線的制備方法,測出酶解液在750 nm處的吸光度值。并計算多肽得率(%)。

    式中:c為由標(biāo)準曲線計算得到的多肽提取液的質(zhì)量濃度(mg/mL);V為多肽提取液的體積(mL);m為樣品粉質(zhì)量(mg)。

    1.3.6 抗氧化性的測定

    方法測定對羥自由基的清除效率[11]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 魚尾鰭中各基本組分的分析結(jié)果

    多數(shù)魚類的蛋白質(zhì)含量可達18%~20%,高于肉、禽、蛋、奶的蛋白質(zhì)含量[12]。由表1可以看出,該魚尾鰭主要成分為蛋白質(zhì),含量為18.96%,與魚肉蛋白質(zhì)含量相近。經(jīng)冷凍干燥后,魚尾鰭粉末中蛋白質(zhì)含量則接近47%。

    表1 魚尾鰭中各基本組成成分(%)

    2.2 單因素實驗

    2.2.1 底物濃度

    如圖1所示,隨著底物濃度的增加,多肽得率和羥自由基清除率都表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時,酶與底物接觸幾率小,酶解程度較弱,導(dǎo)致其產(chǎn)生的多肽較少。隨著底物濃度的增加,多肽得率也隨之增加。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0%時,其多肽得率達到最高。若底物濃度繼續(xù)增加,多肽得率反而下降,其原因是該體系底物濃度增加導(dǎo)致溶液黏度提高,因此降低體系中底物和蛋白酶的反應(yīng)接觸能力,從而抑制酶解作用。從圖1還可得知,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5%時,羥自由基清除率達到最大值。

    2.2.2 pH

    pH通過影響酶的穩(wěn)定性、酶與底物的結(jié)合以及酶催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物,從而影響酶的催化效果[13],因此pH是酶解反應(yīng)的重要因素之一。結(jié)果如圖2所示??梢钥闯觯趐H7.0~8.0范圍,多肽得率和羥自由基清除率隨pH上升而增加。在超過pH 9后則呈現(xiàn)下降趨勢。考慮到實驗所用酶為堿性蛋白酶,故選擇pH范圍8.0~10.0。

    2.2.3 溫度

    溫度對酶的穩(wěn)定性及反應(yīng)速率皆有一定影響。酶解溫度過高則會破壞蛋白酶特定空間構(gòu)象,從而破壞蛋白酶活性中心,降低其活性;若酶解溫度過低,則降低酶解體系內(nèi)的分子運動,使底物和酶活性分子的碰撞幾率降低[14]。酶解溫度對多肽得率及羥自由基清除率的影響如圖3所示。隨著酶解溫度升高,多肽得率和羥自由基消除率呈先升高后下降的趨勢。在55℃~60℃時,多肽得率和羥自由基消除率較高。當(dāng)溫度高于60℃時,兩者反而下降,可能是由于溫度升高導(dǎo)致蛋白酶結(jié)構(gòu)改變,活性降低。因此,在后續(xù)實驗中,選擇酶解溫度為不高于60℃。

    2.2.4 加酶量

    由圖4可知,隨著加酶量的增加,多肽得率和羥自由基清除率逐漸增加。當(dāng)加酶量高于0.6%時,加酶量對多肽得率和羥自由基清除率均不再有顯著影響。說明當(dāng)加酶量為0.6%時,酶分子與底物的結(jié)合已達到飽和。因此在酶解實驗中,確定最佳加酶量為0.6%。

    2.2.5 酶解時間

    由圖5可知,酶解前3h內(nèi),多肽得率和羥自由基清除率隨酶解時間增加逐步上升。酶解時間長于3h時,酶解時間不再對多肽得率有顯著影響,而羥自由基清除率降低,可能是隨著酶解時間延長,部分具有抗氧化活性的多肽被繼續(xù)水解導(dǎo)致抗氧化性降低。因此,本實驗確定堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的較優(yōu)反應(yīng)時間為3h。

    2.3 響應(yīng)面

    根據(jù)以上單因素實驗結(jié)果,確定使用堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的基本工藝參數(shù),下一步以抗氧化活性即羥自由基的清除率為評價指標(biāo),利用響應(yīng)面分析法對酶解反應(yīng)進行優(yōu)化。

    在單因素實驗的分析結(jié)果基礎(chǔ)上,采用三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面的設(shè)計方法,選擇底物濃度、酶解pH以及溫度這三個相對來說影響較大的因素進行響應(yīng)面試驗,試驗因素水平的設(shè)計見表2[15,16]。

    表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平

    2.3.1 響應(yīng)面分析設(shè)計及結(jié)果

    以底物濃度、pH以及反應(yīng)溫度為自變量的三因素三水平試驗共17組,經(jīng)軟件Design Expert 8.05設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平,具體試驗設(shè)計及結(jié)果如表3和表4所示。

    表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

    表4 回歸模型的方差分析

    通過軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析,得到回歸方程為:

    Y=68.80+3.90A-4.47B+3.10C-9.56AB-2.39BC+5.73A2-5.63C2。

    由表4可知,該模型的P=0.0117<0.05,失擬性在α=0.05水平上不顯著(P=0.2682>0.05),表明該模型差異顯著,能正確反映魚尾鰭酶解過程中底物濃度、酶解pH以及反應(yīng)溫度之間的關(guān)系。

    2.3.2 各因素交互作用分析

    各因素對羥自由基清除率影響的響應(yīng)曲面圖如圖6~8所示。由圖可看出,隨pH(B)和反應(yīng)溫度(C)的增加,羥自由基的清除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。從圖6可知,在固定的酶解pH下,隨著底物濃度的增大,羥自由基的清除率先緩慢提高后逐漸減小;而在反應(yīng)溫度一定時,羥自由基的清除率隨底物濃度的增加而增加(如圖7所示)。比較三個因素的兩兩交互作用圖,A(底物濃度)與B(酶解pH)的交互作用對羥自由基清除率的影響較大,表現(xiàn)為在選定的取值區(qū)間內(nèi)曲面響應(yīng)值變化大,這與回歸模型方差分析中的AB項P<0.01結(jié)果一致。

    2.3.3 回歸模型的驗證試驗

    經(jīng)軟件Design Expert 8.05優(yōu)化后,分析得到最佳的實驗參數(shù)為:底物濃度為15%(w/v),酶解為pH=8.403,反應(yīng)溫度為54.02℃。對最佳方案進行驗證,測得羥自由基清除率為82.09%,與理論預(yù)測的最大值83.2432%相比,相對誤差為1.38%,說明該模型可較好的預(yù)測堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的反應(yīng)條件和羥自由基清除率的關(guān)系,同時也證明響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解魚尾鰭制備抗氧化肽工藝參數(shù)的科學(xué)性和可行性,此酶解條件下測得多肽得率為31.68%。

    3 結(jié)論

    選用堿性蛋白酶對魚尾鰭進行酶解,以多肽得率和對羥自由基的清除率為指標(biāo),采用單因素實驗和響應(yīng)面分析優(yōu)化對酶解魚尾鰭的主要影響因素底物濃度、pH、溫度、加酶量和酶解時間進行優(yōu)化,并建立了基于魚尾鰭抗氧化肽酶解條件的優(yōu)化模型。試驗結(jié)果表明:底物濃度15%,pH=8.403,反應(yīng)溫度54.02℃,加酶量0.6%,酶解時間3h,酶解產(chǎn)物的抗氧化性最佳,對羥自由基清除率為82.09%,與預(yù)測值相比相對誤差為1.38%,表明該模型可較好的預(yù)測堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的反應(yīng)條件和羥自由基清除率的關(guān)系。該研究為魚尾鰭的開發(fā)利用提供理論依據(jù),可減少環(huán)境污染并提高水產(chǎn)品加工的附加值。

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    [責(zé)任編校:張彩紅]

    2016-03-22

    邯鄲市科技局科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(1422104057-4)。

    蘇現(xiàn)波,男,河北邯鄲人,邯鄲學(xué)院講師。

    TS254.9

    A

    1009-5462(2016)01-0053-07

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