上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化與卵巢癌及其相關(guān)miRNA的調(diào)控機(jī)制

陳雨龍，姚勤

（青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，山東 青島 266500）

卵巢癌病死率居于婦科惡性腫瘤首位，其遠(yuǎn)期生存率低。已有研究證實(shí)，癌細(xì)胞從瘤體脫落并獲得轉(zhuǎn)移種植能力的過(guò)程中，上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）起到了重要的作用［1］。微小RNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，在卵巢癌中已發(fā)現(xiàn)多種miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)EMT影響卵巢癌的生物學(xué)特性。研究miRNA調(diào)節(jié)EMT影響卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過(guò)程中的分子機(jī)制，針對(duì)關(guān)鍵通路中的主要信號(hào)分子設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)移篩查方法和靶向治療藥物，將為卵巢癌的預(yù)后判斷和治療提供新的思路。

1 miRNA及EMT概述

miRNA是一種長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子。自LEE等［2］從線蟲(chóng)克隆出lin－4基因以來(lái)，人類(lèi)對(duì)miRNA的研究快速發(fā)展，據(jù)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（miRbase）最新統(tǒng)計(jì)［3］，目前已發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)前體 miRNA（pri－miRNA）已超過(guò)1800種，表達(dá)成熟miRNA產(chǎn)物已超過(guò)2500種。

EMT可誘導(dǎo)許多病理過(guò)程，如慢性炎癥、器官纖維化、高分化癌等。典型的上皮細(xì)胞具有游離面－基底面的極性特征，細(xì)胞間具有緊密連接和黏附連接，不能夠隨意地遷移。EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞喪失正常極性并獲得侵襲遷移能力，伴隨細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的改變和多種細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)變化，主要表現(xiàn)為上皮表型相關(guān)分子如E－鈣黏素（E－cad）、角蛋白、纖維粘連蛋白（FN）等的減少，以及間質(zhì)表型相關(guān)分子如α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－SMA）、波形蛋白（Vimentin）、鈣結(jié)合蛋白S100A4等的增加。

2 EMT相關(guān)通路

2.1 Wnt信號(hào)通路

Wnt基因包括兩個(gè)高度同源基因，即小鼠乳癌細(xì)胞int－1基因和果蠅無(wú)翅wingless（wg）基因，故合稱(chēng)為 Wnt基因［4］。Wnt通路主要包括：Wnt蛋白（Wnt配體）及其受體（卷曲家族蛋白Frz），低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）、松散蛋白（Dsh／Dvl）、β－catenin、糖原合成酶激酶3β（GSK－3β）、軸抑制因子（Axin）、家族性腺瘤性息肉病基因（APC）等。Wnt／β－catenin經(jīng)典通路為：Wnt配體與其受體Frz結(jié)合后，可激活細(xì)胞內(nèi)的 Dsh／Dvl，并進(jìn)一步抑制 GSK－3β／Axin／APC復(fù)合物對(duì)β－catenin的磷酸化作用，β－catenin降解隨之減少并在細(xì)胞內(nèi)積聚，而后進(jìn)入細(xì)胞核并激活c－myc、survivin和cyclin D基因的轉(zhuǎn)錄［5］。研究表明，miR－939可通過(guò)下調(diào)APC來(lái)抑制Wnt通路，并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖［6］。

2.2 PI3K／Akt／mTOR通路

研究顯示，PI3K／Akt／mTOR通路主要由磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt／PKB）及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）構(gòu)成［7］。PI3K／Akt／mTOR通路的大致激活過(guò)程為：生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)肽等與相應(yīng)受體結(jié)合形成復(fù)合體，該復(fù)合體激活PI3K的p110催化亞基，使底物Ptd Ins（4，5）P2轉(zhuǎn)化為 Ptd Ins（3，4，5）P3，PIP3隨后與 Akt氨基端調(diào)節(jié)區(qū)PH結(jié)構(gòu)域（pleckst rin homology domain）結(jié)合，使Akt向細(xì)胞膜募集。而后Akt的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Thr－308／Ser－473）分別被PI3K依賴(lài)激酶1（PDK1）／PI3K 依賴(lài)激酶2（PDK2）磷酸化。激活后的Akt可以直接磷酸化mTOR使其激活，或通過(guò)滅活結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1／2（TSC1／2）以增強(qiáng)mTOR的活性。GSK－3β是 Wnt信號(hào)通路和PI3K／Akt／mTOR通路的共同信號(hào)分子，提示各信號(hào)通路間相互影響。有研究表明，在卵巢癌細(xì)胞株中下調(diào)miRNA－150可以激活PI3K／Akt通路并降低癌細(xì)胞對(duì)帕妥珠單抗的敏感性［8］。

2.3 Hedgehog信號(hào)通路

Hedgehog是一種分節(jié)極性基因，哺乳動(dòng)物中有3種Hedgehog同源基因：SHH、DHH和IHH。經(jīng)典SHH信號(hào)通路的構(gòu)成：SHH配體，跨膜蛋白受體Ptch、Smo，Gli蛋白家族。Gli蛋白家族包括轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子Gli1、Gli2，轉(zhuǎn)錄抑制因子Gli3，三者相互作用引起靶基因過(guò)表達(dá)，并最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。Hedgehog信號(hào)通路的作用機(jī)制為：當(dāng)SHH缺少時(shí)，Ptch與Smo結(jié)合使Smo失活，Gli失去Smo的刺激作用后表達(dá)減少且不斷被蛋白酶水解，從而導(dǎo)致靶基因表達(dá)受抑制；當(dāng)SHH過(guò)表達(dá)時(shí)，SHH作為配體與Ptch結(jié)合使其與Smo分離，Smo隨后激活Gli的過(guò)表達(dá)并引起靶基因的高表達(dá)，最終引起腫瘤的發(fā)生。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，Hedgehog信號(hào)通路的激活與卵巢癌密切相關(guān)［9］。

2.4 TGF－β／Smad信號(hào)通路

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β（TGF－β）屬于 TGF－β超家族，體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞時(shí)，若加入表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和TGF－β，成纖維細(xì)胞不再貼壁生長(zhǎng)，并能在瓊脂中生長(zhǎng)，密度抑制效應(yīng)隨之消失。TGF－β除了誘導(dǎo)EMT的發(fā)生外，可在體外誘導(dǎo)正常成纖維細(xì)胞（NF）向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）的轉(zhuǎn)變［10］。TGF－β與細(xì)胞表面Ⅰ型受體Ⅱ型受體結(jié)合后，Ⅰ、Ⅱ型受體構(gòu)型發(fā)生改變形成復(fù)合體，使Smad2與Smad3磷酸化并進(jìn)一步與Smad4結(jié)合，隨后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。已有研究證實(shí)，TGF－β能夠激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（TG2），TG2可上調(diào)鋅指增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1（ZEB1）、下調(diào)E－cad表達(dá)，從而誘導(dǎo)卵巢癌EMT過(guò)程，而這一過(guò)程主要是經(jīng)Samd通路和TGF－β激活激酶（TAK1）／NF－κB途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的［11］。

2.5 其他信號(hào)通路

Notch信號(hào)通路：直接作用于轉(zhuǎn)錄因子Snail的啟動(dòng)子以上調(diào)Snail水平；還可在缺氧誘導(dǎo)因子－1α（HIF－1α）存在的情況下上調(diào)賴(lài)氨酰氧化酶（LOX）以穩(wěn)定Snail，減少Snail的降解，最終誘導(dǎo)EMT過(guò)程［12］。研究結(jié)果表明，上皮性卵巢癌中高表達(dá)Snail對(duì)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展具有協(xié)同作用［13］。此外，NF－κB、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等多種信號(hào)通路都參與了EMT的過(guò)程［14］。

3 卵巢癌發(fā)生EMT及其相關(guān)miRNA的調(diào)控機(jī)制

3.1 miR－200家族

3.1.1 miR－200家族與卵巢癌發(fā)生發(fā)展 序列（尤其是種子序列）高度同源miRNA通常被歸為一個(gè)家族。miR－200家族主要包括miR－200a／b／c、miR－141、miR－429。內(nèi)源性miR－200家族可與 E－cad轉(zhuǎn)錄抑制因子 ZEB1／2的3′UTR結(jié)合，抑制ZEB轉(zhuǎn)錄因子的翻譯，從而維持E－cad的表達(dá)水平，在 MET／EMT過(guò)程中起到重要作用［15］。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞系HEY中，miR－429的過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo) MET過(guò)程，伴隨細(xì)胞形態(tài)的改變和ZEB1／2的下降及E－cad的升高［16］。但 BENDORAITE等［17］發(fā)現(xiàn)ZEB1／2也可以反向抑制miR－200家族的表達(dá)并在一定程度上逆轉(zhuǎn)miR－200家族誘導(dǎo)的MET過(guò)程。EMT／MET這種雙向抑制的反饋通路在結(jié)直腸癌中也已被證實(shí)，miR－34可以抑制Snail的表達(dá)：miR－34通過(guò)與Snail的3′UTR結(jié)合；反之Snail也可以抑制miR－34的表達(dá)：Snail通過(guò)與miR－34啟動(dòng)子上的E－boxes結(jié)合［18］。在卵巢癌的相關(guān)研究中，miR－200家族表達(dá)水平既有上升也有下降［17］。這提示miR－200家族在卵巢癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的不同時(shí)期起到不同的作用。不妨假設(shè)，在腫瘤發(fā)展早期，miR－200家族表達(dá)下調(diào)，隨之E－cad表達(dá)水平降低，細(xì)胞間黏附作用下降，腫瘤細(xì)胞獲得侵襲能力；當(dāng)腫瘤已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，miR－200家族表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生MET過(guò)程，以利于腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處的定植。OLSON等［19］的研究部分驗(yàn)證了這一過(guò)程：通過(guò)RT2小鼠體外構(gòu)建多步驟腫瘤發(fā)生模型發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)瘤細(xì)胞進(jìn)展到類(lèi)轉(zhuǎn)移原發(fā)瘤期或轉(zhuǎn)移瘤期時(shí)，miR－200家族才會(huì)明顯地下調(diào)。

3.1.2 miR－200家族與卵巢癌耐藥 已有研究證實(shí)，卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT后對(duì)鉑類(lèi)藥物的耐藥性會(huì)顯著上升［20］，而miR－200家族尤其是 miR－429可以逆轉(zhuǎn) EMT過(guò)程［16］，根據(jù)該逆轉(zhuǎn)過(guò)程是否伴隨卵巢癌細(xì)胞恢復(fù)對(duì)鉑類(lèi)藥物敏感性的這一設(shè) 想，JABBARI等［21］在卵巢 癌細(xì)胞系 SKOV－3 和HEY－A8中分別過(guò)表達(dá)miR－200家族各成員，并隨后進(jìn)行順鉑耐藥性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR－429與miR－141對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的恢復(fù)最高，miR－200c與miR－200a次之，miR－200b較差。JABBARI等［21］認(rèn)為這與 miR－200家族各成員間非種子序列的差異性有關(guān)。

3.1.3 miR－200家族與卵巢癌預(yù)后 腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移以后預(yù)后很差，卵巢癌亦是如此。HU等［22］對(duì)55例晚期卵巢癌miRNA 表達(dá)水平分析后結(jié)果顯示，miR－200a、miR－200b、miR－429與卵巢癌復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)期生存率密切相關(guān)，其表達(dá)水平越低，預(yù)后越差。EITAN等［23］的研究結(jié)果顯示，在Ⅲ期卵巢癌中 miR－200a、miR－34a、miR－449b下調(diào)最為顯著，其中miR－200a與病人總生存期密切相關(guān)。腫瘤誘發(fā)miRNA表達(dá)后在血清－血漿中穩(wěn)定存在且不受內(nèi)源性RNA酶的影響，因此血清或血漿標(biāo)本都可以用以檢測(cè)miRNA的含量［24］。miR－429被認(rèn)為除可以作為卵巢癌發(fā)生EMT的標(biāo)志物外，還對(duì)抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移具有一定的治療價(jià)值［10］。

3.2 其他 miRNA

除了miR－200家族外，尚有許多miRNA參與了卵巢癌EMT過(guò)程。CHAO等［25］研究發(fā)現(xiàn)，miR－187在卵巢惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，但與之相反的是miR－187的表達(dá)水平卻與總生存率及無(wú)復(fù)發(fā)生存率呈正相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌發(fā)生的最初階段miR－187異常表達(dá)可以抑制其靶基因Dab2（一種抑癌基因），并引起癌細(xì)胞過(guò)度增殖，隨后在卵巢癌進(jìn)展晚期，持續(xù)上調(diào)的miR－187可以抑制Dab2依賴(lài)的EMT過(guò)程。YANG等［18］通過(guò)對(duì)459例晚期卵巢癌病例的分析研究發(fā)現(xiàn)，提高miR－506的表達(dá)可以上調(diào)E－cad水平，抑制EMT過(guò)程，最終降低癌細(xì)胞的增殖侵襲能力。

4 展望

卵巢惡性腫瘤整體預(yù)后不良，上皮性卵巢癌病死率居?jì)D科惡性腫瘤首位。卵巢腫瘤的組織學(xué)分型在目前人類(lèi)實(shí)體腫瘤中也最為復(fù)雜多樣，這在一定程度上加大了其診斷和治療難度。隨著對(duì)EMT及其相關(guān)microRNA調(diào)控機(jī)制研究的深入，將為卵巢癌發(fā)病機(jī)制的解釋、化療方案選擇及預(yù)后判斷提供了新的思路。如 miR－429與ZEB1／2、miR－34與Snail的雙向抑制反饋通路首先通過(guò)EMT過(guò)程使癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移侵襲能力，而后又在腫瘤進(jìn)展晚期通過(guò)MET過(guò)程使腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處組織器官定植，這為解釋腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的觀點(diǎn)。

雖然miRNA對(duì)EMT的調(diào)控機(jī)制研究已取得長(zhǎng)足進(jìn)展，但miRNA數(shù)量龐大，其調(diào)控的EMT通路間錯(cuò)綜復(fù)雜，且不同病理類(lèi)型的卵巢癌組織中其miRNA表達(dá)存在較大差異。進(jìn)一步深入研究各EMT通路的機(jī)制及其的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，將為臨床診斷、預(yù)后判斷、化療方案的選擇提供指導(dǎo)和依據(jù)。

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